NFATc3的表達調節試劑以及基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒的制作方法

本發明涉及一種NFATc3的表達調節試劑，本發明還涉及基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒。
背景技術：
：流行病學研究表明，胃癌在全球范圍內仍是預后較差惡性程度較高的腫瘤，而幾乎有一半以上的胃癌發生于亞洲，在我國，隨著生活水平提高，飲食習慣改變，胃癌發病率逐年提高。目前胃癌主要治療方式為手術治療，但各期胃癌總生存率在5％-15％之間，主要原因是大部分患者就診時已屬晚期，喪失了根治性手術的機會；即使是進行了根治性手術，至少80％患者最終會出現局部或遠處的復發或轉移。因此，研究尋找能有效抑制胃癌的藥物很有必要。含砷類中藥在我國傳統醫學有超過兩千年的應用歷史，近年來在治療腫瘤方面取得了顯著成果。原始的含砷金屬礦石包含三種主要成分：雄黃(As4S4)雌黃(As3S2)砒霜(As2O3)。其中砒霜的主要成分三氧化二砷被成功應用于治療急性早幼粒細胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)，其作用機理主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖及誘導分化等發揮作用，被譽為“古老的中藥煥發出新的光輝”。自美國食品與藥物管理局(FDA)批準As2O3為臨床用藥以來，許多研究者嘗試將其用于治療惡性血液腫瘤以及一些實體腫瘤。但是，由于As2O3口服會明顯增加肝毒性，目前主要用于靜脈治療，長期維持治療有一定局限性。雄黃的主要成分為As4S4，是硫元素和砷元素的八元絡合物，毒性較氧化砷明顯減低，采取一定工藝進行處理可使其副作用進一步減少，應該更有臨床應用前景。雄黃(硫化砷)治療白血病的臨床實踐中未發現明顯的骨髓抑制、嚴重感染及出血，不易并發播散性血管內凝血(DIC)。由上可見，相對于氧化砷，雄黃(硫化砷)具有以下優越性：(1)口服較安全，使用方便；(2)藥源廣泛，經濟實用；(3)毒副作用小，硫化砷的毒性遠低于As2O3。如能將硫化砷用于治療腫瘤，將具有極大社會效益。使用純化的As4S4用于治療APL和慢性粒細胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)等多種惡性血液病取得了較好的療效。目前對其作用機理的認識尚處在起步階段，研究發現主要為誘導細胞凋亡、誘導細胞分化、抑制核酸合成、作為血管內皮細胞抑制劑和直接細胞毒作用等，對其作用的分子機制進行尚未有深入研究的報道。NFAT蛋白可分為5類：NFAT1(NFATc2，NFATp)、NFAT2(NFATc1，NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3，NFATx)和NFAT5(TonEBP，OREBP)。NFAT最初是在免疫細胞中被鑒定，但是后來發現，NFAT的所有亞型均能廣泛表達于所有的細胞和組織內。靜息狀態下，NFAT以高磷酸化無活性狀態處于細胞質中，當細胞受刺激后，細胞內Ca2+水平升高激活鈣調蛋白磷酸酯酶(calcineurin，CN)，從而使NFAT脫磷酸化，暴露入核信號向核易位。進而NFAT與特定DNA區域相結合協同其他轉錄因子或共激活物等共同調節靶基因的轉錄表達。因此，NFAT蛋白在分子醫學領域的研究價值十分突出。技術實現要素：本發明的一個目的在于提供一種NFATc3的表達調節試劑，本發明的另一個目的在于提供一種基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒。以解決上述問題。本發明采用了如下技術方案：本發明提供一種As4S4在制備調節癌細胞中NFATc3表達水平的試劑中的應用。進一步，上述的應用，還可以具有這樣的特征：As4S4中不含有氧化砷。進一步，上述的應用，還可以具有這樣的特征：其中，As4S4的劑量為0.5～20μM。進一步，上述的應用，還可以具有這樣的特征：其中，癌細胞為胃癌細胞、腸癌細胞或胰腺癌細胞。進一步，上述的應用，其特征在于：其中，胃癌細胞為AGS和MGC803兩個胃癌細胞株。進一步，上述的應用，其特征在于，其中，應用中還包括在調節癌細胞中NFATc3表達水平的試劑中加入JQ1的步驟。一種基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，其特征在于，包括：檢測NFATc3表達水平的試劑，當腫瘤細胞的NFATc3相對于肌動蛋白的表達量大于0.2時，則判斷該腫瘤細胞株對砷劑敏感；對于腫瘤組織塊，當其癌組織與相應癌旁組織內NFATc3表達量比值大于等于2時，則判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感；若癌旁組織內完全無表達，而癌組織內有表達，即認為陽性，判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。進一步，本發明的基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，還可以具有這樣的特征：其中，檢測NFATc3蛋白表達水平的試劑包括：含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，5×上樣緩沖液，1×上樣緩沖液，一抗，二抗，TBST緩沖液。進一步，本發明的基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，還可以具有這樣的特征：其中，檢測NFATc3蛋白表達水平的試劑包括：10％的甲醛，70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液，乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液，石蠟和二甲苯(1:1)的混合溶液，二甲苯，檸檬酸鹽緩沖液，正常非免疫動物血清，一抗，內源性過氧化物酶，生物素標記的二抗，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，DAB，Gill’s蘇木素。進一步，本發明的基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，還可以具有這樣的特征，包括：檢測NFATc3基因表達水平的試劑。發明的有益效果本發明的As4S4在制備調節癌細胞中NFATc3表達水平的試劑中的應用。與現有的采用基因敲除、RNAi等下調基因表達試劑相比，As4S4的毒性小，急性毒性實驗表明，用Bliss法計算LD50為19.3±1.1g/kg，95％的可信區間為18.3-20.4g/kg,遠超過《藥典》中記錄的毒性劑量。另外，由于As4S4來源廣泛，因此使用As4S4制備調節癌細胞中NFATc3表達水平的試劑經濟實用。為癌細胞中分子機制的研究提供了新的工具。本發明的基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，由于僅通過檢測NFATc3的表達水平就可以判斷胃癌細胞株是否對砷劑敏感，因此方便快捷。附圖說明圖1是結腸癌細胞HCT116在不同濃度硫化砷作用24h后NFATc3變化；圖2是結腸癌細胞HCT116在10uM硫化砷作用不同時間后NFATc3變化；圖3是結腸癌RKO細胞不同濃度硫化砷作用24h后NFATc3變化；圖4是結腸癌RKO細胞10uM硫化砷作用不同時間后NFATc3變化；圖5結腸癌SW480細胞不同濃度硫化砷作用12h后NFATc3變化；圖6胰腺癌PANC-1細胞不同濃度硫化砷作用24h后NFATc3變化；圖7胰腺癌PANC-1細胞10uM硫化砷作用不同時間后NFATc3變化；圖8利用westernblotting檢測不同胃癌細胞株中NFATc3的基礎表達量；圖9是圖8中結果的量化柱圖；圖10胃癌AGS細胞不同濃度硫化砷作用24h后NFATc3變化；圖11胃癌MGC803細胞不同濃度硫化砷作用24h后NFATc3變化；圖12在AGS中分別利用硫化砷與JQ1單用與合用的結果；圖13MGC803中分別利用硫化砷與JQ1單用與合用的結果；圖14不同胃癌細胞株對硫化砷敏感性的差異；圖15基因沉默后胃癌細胞株對硫化砷敏感性的變化結果圖；圖16是對耐藥株SGC7901過表達NFATc3后對硫化砷敏感性上升的結果圖。具體實施方式以下說明本發明的具體實施方式。文中使用的實驗試劑均為來自商業途徑能夠購得的試劑。<實施例一>As4S4對癌細胞中NFATc3表達的調節作用。1.1As4S4對結腸癌細胞HCT116中NFATc3表達的調節作用取結腸癌細胞株HCT116。使用2.5到20μM濃度梯度的As4S4對上述細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM。結果如圖1所示，As4S4對HCT116細胞株的腸癌細胞具有下調NFATc3表達量的作用。尤其在20μM濃度時，下調NFATc3表達的效果尤其顯著。如圖2所示，在使用10μM的As4S4處理不同時間后，下調NFATc3表達的效果逐漸加強。1.2As4S4對結腸癌細胞RKO中NFATc3表達的調節作用取結腸癌細胞株RKO。使用1.25到10μM濃度梯度的As4S4對上述細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM。結果如圖3所示，As4S4對RKO細胞株的腸癌細胞具有下調NFATc3表達量的作用，在10μM濃度時，下調NFATc3表達的效果最顯著。如圖4所示，在使用10μM的As4S4處理不同時間后，下調NFATc3表達的效果逐漸加強。1.3As4S4對結腸癌細胞SW480中NFATc3表達的調節作用取結腸癌細胞株SW480。使用2.5到10μM濃度梯度的As4S4對上述細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM。結果如圖5所示，As4S4對SW480細胞株的腸癌細胞具有下調NFATc3表達量的作用，在10μM濃度時，下調NFATc3表達的效果最顯著。1.4As4S4對胰腺癌PANC-1細胞株的NFATc3表達的調節作用取胰腺癌PANC-1細胞株。使用2.5到10μM濃度梯度的As4S4對上述細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、2.5μM、5μM、10μM。結果如圖6所示，As4S4對胰腺癌PANC-1細胞株具有下調NFATc3表達量的作用，在10μM濃度時，下調NFATc3表達的效果最顯著。如圖7所示，在使用10μM的As4S4處理不同時間后，下調NFATc3表達的效果先加強然后略有減弱。1.5As4S4對胃癌細胞株AGS的NFATc3表達的調節作用。取胃癌細胞株AGS。使用0.5到4μM濃度梯度的As4S4對上述各細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM。結果如圖10所示，As4S4對AGS細胞株的胃癌細胞具有下調NFATc3表達量的作用。圖中顯示了不同濃度的As4S4作用24h后NFATc3的表達變化。1.6As4S4胃癌細胞株MGC803的NFATc3表達的調節作用。取胃癌細胞株MGC803。使用0.5到4μM濃度梯度的As4S4對上述各細胞株進行處理，按照以下濃度梯度給藥：0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM。結果如圖11所示，As4S4對MGC803細胞株的胃癌細胞具有下調NFATc3表達量的作用。圖11顯示了As4S4不同濃度作用24h后NFATc3的表達變化。為進一步提高As4S4的調節效果，加入JQ1,如圖12和圖13所示，當As4S4的濃度和JQ1的濃度分別為1μM二者合用作用于AGS或MGC803時，對NFATc3的抑制效果要強于單獨使用As4S4或JQ1時的抑制效果。可見，As4S4和JQ1二者合用具有協同效應，NFATc3表達量下降更多。以上結果表明，As4S4是一種有效的NFATc3表達抑制劑，尤其對于胃癌細胞株：AGS和MGC803，其效果更加顯著。As4S4作為NFATc3表達抑制劑的優勢在于其安全性和經濟性：純化雄黃(或稱As4S4或硫化砷)的急性毒性實驗，用Bliss法計算LD50為19.3±1.1g/kg，95％的可信區間為18.3-20.4g/kg,遠超過《藥典》中記錄的毒性劑量，遠較As2O3安全(As2O3的LD50<50mg/kg)。<實施例二>基于上述下調NFATc3表達的實驗發現，不同的胃癌細胞株對As4S4試劑的敏感性，存在著差異。對胃癌細胞株：AGS、MGC803、MKN28、MKN45、SGC7901進行進一步的細胞毒性實驗，見圖14，結果表明：在相同的給藥濃度下，As4S4對AGS和MGC803的抑制作用較強，對比圖8和圖9中NFATc3的基礎表達量，可以看到NFATc3的基礎表達量最高的AGS和MGC803，對As4S4的敏感性反而最高。如圖15所示，對最敏感的兩個細胞株：AGS和MGC803的NFATc3進行基因沉默后，抑制率下降，IC50值上升。如圖16所示，對耐藥株SGC7901過表達NFATc3后對硫化砷敏感性上升。綜合圖14、圖15、圖16的結果，可以得出結論：胃癌細胞株對于As4S4的敏感性與NFATc3的表達量相關。從而使NFATc3的表達量成為篩選對As4S4的敏感性的細胞株的一項重要指標。本實施方式的基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒，使用western對胃癌細胞進行NFATc3的表達量檢測，從而判斷不同胃癌細胞對As4S4的敏感性，指導個性化給藥。基于NFATc3的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒包括：含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，1ml；5×上樣緩沖液，20ml；1×上樣緩沖液，10ml；一抗(抗NFATc31:500)，(購自SantaCruzBiotechnology，sc-8405)紅外染料標記的二抗，(購自invitrogen,115-625-146)TBST緩沖液，20ml。使用上述試劑盒對于單獨培養的細胞株進行敏感性篩選的具體步驟如下：1.取出細胞，棄去細胞培養基，PBS洗去細胞碎片，將細胞放于冰上。2.加入適量預冷的含蛋白酶抑制劑(PMSF)的蛋白裂解液。對于6cm的細胞培養盤，每孔加入150μl。3.冰上裂解細胞10-15min，用預冷的刮刀將細胞刮下。將樣品轉移入Ep管中。4.超聲破碎儀破碎細胞。5.4℃，14000轉，離心15min。6.取上清，采用BCAProteinAssayKit測蛋白濃度后，向蛋白中加入1/5體積的5×上樣緩沖液，煮沸10min。7.根據不同蛋白的分子量，準備不同百分比的SDS-PAGE膠，具體而言，NFATc3分子量為130左右，使用8％的膠跑電泳。一般上樣總蛋白的范圍在20-40μg之間。8.將膠板裝入垂直電泳槽內，檢查膠板和電極架的密合度，在內池中灌滿電泳液，注意不要漏液。漏液會導致各泳道之間不齊，溴酚蘭帶會呈“︵”或“︶”等形狀。取出梳齒。9.根據上樣量計算上樣體積，并用1×上樣緩沖液補齊。10.上樣結束后，接上電源，將電源設為恒流300mA輸出，電壓80mV,待跑齊后，可改為120mV，正常情況下，電泳可以在2個小時內結束。11.電泳結束后，將膠板卸下，同時準備好電轉移所需的濾紙，PVDF膜，預冷電轉移槽和電轉液。用100％甲醇將PVDF膜浸濕。12.在一個容器中倒入1000ml左右的轉膜液，在轉膜液中將濾紙，膠和膜疊成三明治狀。從黑色負極方向到白色正極方向的順序分別為：濾紙-膠-PVDF膜-濾紙。13.將電轉移夾插入電轉移槽中，注意將靠膜的一面朝向正極，靠膠的一面朝向負極。同時插入內置的冰盒。電轉移的條件設定為恒流300mA。14.電轉結束后，取出PDVF膜，可以發現原本在膠上的Marker，現在已經被轉移到了膜上。立即將PVDF膜浸泡入5％的脫脂牛奶中，勿使膜變干，室溫封閉PVDF膜1小時。15.一抗孵育：用一抗稀釋液稀釋一抗，稀釋的倍數可以參考抗體供應商的建議。4℃孵育過夜。16.洗膜：TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。二抗孵育：用含5％脫脂牛奶的TBST稀釋與一抗相應的紅外染料標記的二抗。于室溫下孵育1小時。然后再洗膜三次，每次10min。17.采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(InfraredImagingSystem)進行成像，與傳統化學成像其優勢在于：應用熒光標記，準確定量，線性范圍寬廣；紅外：背景低條帶清晰，信噪比高；雙色：同時檢測，同時輸出。當NFATc3的相對Actin(肌動蛋白)的表達水平大于0.2時，判斷此胃癌細胞株為As4S4敏感型胃癌細胞株。對于腫瘤組織塊的western檢測，其癌組織與相應癌旁組織內NFATc3表達量比值大于等于2時，則判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。此外，若癌旁組織內完全無表達，而癌組織內有表達，即認為陽性，判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。<實施例3>對于不同胃癌病人胃癌組織，利用免疫組化方法檢測胃癌組織和癌旁組織中NFATc3的表達，從而判斷不同的胃癌組織對As4S4的敏感性:本實施方式提供的砷劑敏感型細胞的篩選試劑盒包括：10％的甲醛，70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液，乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液，石蠟和二甲苯(1:1)的混合溶液，二甲苯，檸檬酸鹽緩沖液，正常非免疫動物血清，一抗，內源性過氧化物酶，生物素標記的二抗，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，DAB，Gill’s蘇木素。使用上述試劑盒對胃癌組織進行檢測的過程如下:組織切片1、剪取組織,10％甲醛固定。2、已經固定好的組織依次在70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液中浸泡15-20min；3、再浸入乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液中15-20min，然后浸入二甲苯直到透明，將透明的組織浸入石蠟和二甲苯(1:1)的混合溶液中浸泡1h，用石蠟進行固定。4、包埋、切片免疫組化1、組織切片置于58℃烘箱內烤片20min,然后取出待冷卻后，進行脫蠟。2、連續2次二甲苯脫蠟各15min，依次浸入100％、95％、80％乙醇、蒸餾水各2min。3、高壓抗原修復：將3L檸檬酸鹽緩沖液注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于切片架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋高壓鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(加熱5-6min)，此時壓力鍋內的溫度為120℃，1.2P(1.2個標準大氣壓)，計時1-2min，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，蒸餾水沖洗，PBS洗，切片室溫冷卻20min，再次PBS洗。4、免疫化學檢測1)室溫，正常非免疫動物血清封閉30min；2)一抗(抗NFATc31:500)4℃12h；(SantaCruzBiotechnologysc-8405)；3)用PBS清洗兩次，每次2min；4)室溫，內源性過氧化物酶阻斷1h；用PBS清洗三次，每次2min；5)室溫，生物素標記的二抗30min；用PBS清洗三次，每次2min；6)室溫，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶30min；7)DAB(免疫組化用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒)顯色5min，蒸餾水沖洗；8)Gill’s蘇木素復染3min；9)自來水流水沖洗5min；依次95％、100％的乙醇脫水3min；10)用二甲苯透明，封片，鏡檢，拍照。11)計算NFATc3的表達量。對于腫瘤組織標本，其癌組織與相應癌旁組織內NFATc3表達量比值大于等于2時，則判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。此外，若癌旁組織內完全無表達，而癌組織內有表達，即認為陽性，判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。免疫組化結果的表達量計算使用二級計分的方法進行統計觀察，即免疫組織得分IRS(immunoreactivityscore,IRS)等于染色強度得分與染色陽性率得分之積。a)定位的判定：胞漿、胞膜、胞核b)定性的判定：陰性、陽性c)定量的判定：染色強度得分：在低倍鏡下觀察組織點整個視野，將染色強度分為弱陽性(淺黃色，1分)、中陽性(棕黃色，2分)及強陽性(棕褐色，3分)。染色陽性率得分：在低倍鏡下觀察組織點整個視野，隨機選取3個染色強度不同的視野，轉換為高倍鏡判讀染色陽性率。于每個高倍鏡視野中隨機觀察100個細胞，然后記下這100個細胞中染色陽性的細胞所占百分率X1％，同樣方法觀察后2個視野中染色陽性細胞所占的百分率X2％、X3％，該組織點染色陽性率為三個視野的X1％、X2％和X3％平均值。0～4％記0分，5～24％記1分，25～49％記2分，50～74％記3分，75～100％記4分。計算染色強度得分與陽性率得分之積。按照胞漿、胞核、胞膜定位分別來計分，每個樣本得分則為胞漿、胞核、胞膜得分之和。<實施例4>使用RT-PCR檢測胃癌與癌旁的NFATc3相對表達量，PT-PCR(實時定量熒光PCR)的步驟如下:(一)樣品RNA的抽提事先準備冰，75％的乙醇，1.5ml離心管放入冰中冷卻備用，離心機提前預冷，操作帶口罩。1.取適量胃癌與癌旁組織置于研磨管中，加入1ml的Trizol，消化研磨，移入冷卻好的EP管中,離心去沉淀。2.兩相分離：按Trizol：氯仿＝5：1的比例，即每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。劇烈振蕩管體15s后，室溫靜置5min。3.4℃下12000rpm離心15分鐘。4.離心后吸水相上層加入新的EP管中，200μl-400μl，再加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，顛倒混勻15s，室溫靜置10min。5.4℃下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。6.移去上清液(注意用槍頭吸，不要倒掉)，加入與最初TRIZOL等量的75％乙醇，輕輕顛倒，洗凈瓶壁。7.4℃下12000rpm離心5分鐘。8.棄上清，棄掉殘余(用200μl槍吸掉大部分乙醇溶液)，倒置晾干，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。9.加入20μlDPEC水用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液可保存于-80℃待用。(二)RNA質量檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。(三)逆轉錄20μl體系：RNA量＝1000μg/濃度(X)；MiXedRT試劑＝4μl；不含RNA酶的ddH2O＝(16-X)μl；先離心，震蕩混勻，再離心；數值：StageI37℃*15：00minStageII85℃*0.05sStageIII4℃(四)Realtime-PCR反應體系如表1所示：表1：標準品反應體系(20μl體系)2.上機步驟如下表表2：上機步驟表其相對表達數據如下表：表3：癌組織與癌旁組織NFATc3相對表達量表癌旁癌11.45711.5314.00311.04911.86911.45212.10412.213111.33711.7511.92119.5516.7413.20713.37312.581癌組織與癌旁組織的NFATc3的表達量的比值：＜1.5的3例；1.5-2的4例；2-3的3例；3-5的3例；＞5的3例。對于腫瘤組織塊，其癌組織與相應癌旁組織內NFATc3表達量比值大于等于2時，則判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。此外，若癌旁組織內完全無表達，而癌組織內有表達，即認為陽性，判斷該腫瘤細胞對砷劑敏感。當前第1頁1 2 3