一種基于熒光免疫層析技術的定量檢測計算方法與流程

本發明涉及免疫層析檢測領域，具體涉及一種基于熒光免疫層析技術的定量檢測計算方法。

背景技術：

隨著社會運行的節奏越來越快，無論是疾病疫情的現場檢測、食品中有毒有害物質的現場快速檢測，還是急診及ICU的緊急情況搶救患者的臨床檢測、災難醫學的緊急情況檢測搶救中，以及事故現場的酒精、藥物濃度檢測中；都急需一種檢測快速、攜帶便捷、操作方便的現場快速檢測技術。但傳統的快速檢測技術由于普遍存在可測量范圍窄、不穩定等缺陷，無法很好的滿足定量快速檢測的要求。

現場快速檢測（Point Of Care Testing, POCT）是體外診斷（IVD）的一個新興細分行業，是在采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗師的復雜處理程序，快速得到檢驗結果的一種新方法。POCT以“患者為中心”，是實現對病人個性化服務的最佳載體。其憑借簡單、快捷和低成本等優勢，在臨床獲得廣泛應用，是IVD行業重要的發展方向和增長最快的領域。POCT相比傳統的檢驗醫學，可以省去諸多標本預處理、樣本送檢、繁瑣的設備檢測、數據處理及傳輸流程等步驟，直接快速的得到可靠的結果，為醫生的進一步施救贏得寶貴的時間。

其中，熒光免疫層析檢測技術是POCT的一種新興檢測技術。熒光免疫層析檢測系統硬件部分主要由一個光電探測器和檢測板組成。檢測板使用的是層析法，將一定濃度的待測物樣本滴加到樣本墊上，樣本溶液通過層析作用向前移動，溶解檢測線上固化的標記物后與之發生特異性反應形成免疫復合物，復合物在檢測線和控制線上富集，附著的反應物含量與待測物濃度成正比；其中，標記物在一定波長的激發光照射下，會產生一定波長的熒光。光電探測器檢測到該熒光的光信號，轉換成對應的數據信息，并通過相應的軟件算法處理，得到待測物對應的光強特征值（檢測線/控制線的值）；最后，通過光強特征值與待測物濃度標準曲線，可檢測待測物的濃度。

但是，熒光分析屬于微弱信號的檢測范疇，一般儀器設計中，獲取信號的方法以提高儀器的增益或放大倍數為主，并且之后的算法處理中沒有針對性的過濾各種噪聲、干擾。但對熒光定量檢測儀而言，檢測到的信號可能不是來自于待檢測的熒光物質，而是來自試劑條背景熒光、外界雜散光的干擾；另外，電子電路噪聲干擾、機械振動干擾、試劑條生產工藝的干擾等都會影響到熒光強度的測量。熒光免疫試劑條檢測線很窄，僅為一條細線；當待測物濃度不高時，試劑條檢測線的熒光信號很弱，由于背景熒光、電路噪聲、以及外界各種干擾都會降低輸入信號的信噪比。這些信號會與有用信號混合，甚至會淹沒所需的熒光信號，降低儀器的靈敏度。現有的熒光免疫層析技術之后的算法處理中一般沒有針對性的對噪聲干擾做過濾操作，導致熒光免疫層析檢測的誤差較大，檢測值的可信度減少，進而降低了熒光免疫層析技術的應用面。

因此，本方案在這種背景下，提出了一整套較為完善的技術方案，來實現在檢測計算待測物濃度的過程中，還能夠過濾掉各種噪聲、信號干擾，提供較為精確的檢測結果。

技術實現要素：

本發明的目的是解決上述現有技術的不足，提供了一種在采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗師的復雜處理程序，快速得到檢測結果的新方案。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種基于熒光免疫層析技術的定量檢測計算方法，包括以下步驟：將滴加有待測樣本溶液的熒光免疫試紙條插入熒光免疫分析儀中，依次經過LED光源照射、濾光片濾光處理、光電探測器檢測、電信號處理、AD轉換處理、濾波算法處理、基線擬合、尋峰處理、計算T/C面積比值、計算濃度的過程，從而通過計算的濃度結果進行判斷。

優選地，所述濾波算法處理采取滑動窗口平均濾波算法。

優選地，所述基線擬合選用最小二乘法擬合。

優選地，所述計算T/C面積比值是在基線擬合后的T、C峰左右各M個點范圍內求面積，再計算T/C面積比值。

優選地，包括以下步驟：

（1）在熒光免疫試劑條上滴加待測樣本溶液，靜置一段時間后，插入熒光免疫分析儀中進行檢測；

（2）針對試劑條中熒光標記物的光譜，選擇合適的LED光源，啟動LED光源照射試劑條；

（3）針對熒光標記物的激發光波長和熒光波長，選擇對應的激發光濾光片和熒光濾光片，濾除背景光、雜散光的干擾；

（4）利用光電探測器將檢測到的熒光信號轉換成電信號；

（5）對光電探測器獲取的微弱電流信號進一步處理，先通過I/V轉換電路將電流信號轉化為電壓信號，再通過帶通濾波放大電路進行放大，增大信噪比；然后通過檢波電路以獲取高精度的放大后的電信號；

（6）通過高精度的AD轉換器，將采集處理放大后的電信號，即模擬信號轉化成數字信號，并把每個檢測點的數字信號按照順序拼成一條采樣曲線，即原始檢測數據；

（7）將原始檢測數據采取滑動窗口平均濾波算法過濾各種噪聲和干擾，衰減高頻信號，去除大部分的毛刺信號；

（8）針對濾波后的數據，選用最小二乘法擬合濾除基線漂移；

（9）在基線擬合后的曲線上進行尋峰處理，即確定出T峰（對應檢測線）和C峰（對應控制線）的位置；

（10）在基線擬合后的T、C峰左右各M個點范圍內求面積，計算T/C面積比值，得到光強特征值；

（11）根據T/C光強特征值與濃度標準曲線，計算出T/C比值對應的樣本濃度值；

（12）對計算的濃度結果進行判斷。

優選地，所述的光電探測器為光電二極管。

本發明的有益效果在于：

本發明中，LED光源的內在特征有利于熒光免疫分析儀的便攜化、穩定、長時間測量；并且LED光源的耗電非常低、熱量低、壽命長。針對試劑條中熒光標記物的光譜，選擇合適的LED光源，照射試劑條時能夠獲取較高的熒光強度，減少溫度變化，進而降低溫度對檢測結果的干擾。

本發明針對熒光標記物的激發光波長和熒光波長，選擇對應的激發光濾光片和熒光濾光片，來獲取理想波長的激發光和熒光；能夠有效地濾除背景光、雜散光的干擾。

本發明選擇光電二極管作為光電探測器，其成本低、響應快、使用壽命更長；并且具有高穩定性、低暗電流、高靈敏度等優點。LED光源、濾光片、光電二極管、以及光路結構組成的光學系統被密封在光學暗箱中，可降低雜散光的干擾。

本發明在將模擬信號轉化成數字信號的處理過程中，采用高精度的AD轉換器，并且具有轉化速度快、功耗低的優點。

本發明針對原始檢測數據中的噪聲大都是隨機信號的特點，采取滑動窗口平均濾波算法，可以很好的衰減高頻信號，對數據起到平滑作用，去除大部分的毛刺信號，可以在最大限度抑制噪聲的同時保存有用信號，從而提高信噪比。

本發明選用最小二乘法擬合來濾除基線漂移，可以有效減少噪聲干擾以及基線漂移對分析結果造成的影響。

本發明未選擇T、C峰的光強值作為待測物濃度的參考點，而是為了進一步消除隨機噪聲，選擇在基線擬合后的T、C峰左右各M個點范圍內求面積的方法，得到光強特征值；其中，M值的大小可以根據試劑條的實際情況設置。采用在同一狀態下兩者的比值----T/C面積比值作為最終結果判斷，進一步減少了噪聲干擾，保證了測量精度。

本發明中，濃度標準曲線是根據試劑條在研發生產環節中測量出的大量實驗數據，采用曲線擬合算法、基于這些實驗數據計算出一條標準曲線。

本方法基于熒光免疫層析技術，提出設計了一整套完善的快速定量檢測方案；實現了在檢測計算待測物濃度的過程中，還能夠過濾掉各種噪聲、信號干擾，提供較為精確的檢測結果。該方案具有高精度、高穩定性、低功耗的優點，很好的滿足了用戶快速定量檢測的需求。

附圖說明

圖1為本發明檢測方法的流程示意圖；

圖2為本發明具體實施方式中原始曲線圖；

圖3為本發明具體實施方式中滑動窗口平均濾波后的曲線圖；

圖4為本發明具體實施方式中基線擬合后的曲線圖；

圖5為本發明具體實施方式中尋峰后的曲線圖；

圖6為本發明具體實施方式中計算峰面積示意圖；

圖7為本發明具體實施方式中試劑條對應的標準曲線圖。

具體實施方式

為更好理解本發明，下面結合實施例及附圖對本發明作進一步描述，以下實施例僅是對本發明進行說明而非對其加以限定。

本發明所述的一種基于熒光免疫層析技術的定量檢測計算方法，如圖1所示，包括如下步驟：

1、試劑條加樣

在熒光免疫試劑條上滴至少40微升的待測樣本溶液，靜置15分鐘后，插入儀器中開始檢測。

2、儀器內的硬件處理流程如下：

（1）LED光源照射試劑條上的試紙窗口，試劑條上的熒光物質的激發波長主要集中在365nm左右，受激發后熒光的波長集中在613nm左右。因此，本方案選用365nm波長的LED光源。開始檢測試劑條的時候，LED光源首先向試劑條的試紙窗口照射激發光。LED光源的內在特征有利于熒光免疫分析儀的便攜化、穩定、長時間測量；并且LED光源的耗電非常低、熱量低、壽命長。針對試劑條中熒光標記物的光譜，選擇合適的LED光源，照射試劑條時能夠獲取較高的熒光強度，減少溫度變化，進而降低溫度對檢測結果的干擾。

（2）濾光處理：針對熒光標記物的激發光波長和熒光波長，選擇對應的激發光濾光片和熒光濾光片，來獲取理想波長的激發光和熒光。LED光源發出光后，首先通過在LED光源前端的激發光濾光片（通過光波長是365±20nm），過濾掉可能存在的其他波長的激發光；激發光照射到試劑條，試紙上的熒光物質受激發產生熒光；熒光通過在光電探測器的前端的熒光濾光片（通過光波長是610±20nm），有效地濾除背景光、雜散光的干擾；以保證后續的光電探測器能夠獲取有用的熒光信號。

（3）光電探測器檢測：本方案選擇光電二極管作為光電探測器將獲取到的熒光信號轉換成電信號，其成本低，響應快，使用壽命更長；并且具有高穩定性、低暗電流、高靈敏度等優點。LED光源、濾光片、光電二極管、以及光路結構組成的光學系統被密封在光學暗箱中，以降低雜散光的干擾。檢測過程中，儀器內部的電機帶動試劑條勻速直線運動，由于試劑條上熒光物質的分布是變化的，光電探測器在試紙的每個檢測點上獲取的熒光信號也是變化的。

（4）電信號處理：對光電探測器獲取的微弱電流信號進一步的處理；首先，通過I/V轉換電路將電流信號轉化為電壓信號，再通過帶通濾波放大電路進行放大，增大信噪比；然后通過檢波電路以獲取高精度的放大后的電信號（仍然是模擬信號）。

（5）AD轉換處理：通過高精度的AD轉換器，其具有轉化速度快、功耗低的優點，把之前處理獲取的模擬信號轉化成數字信號；并把每個檢測點的數字信號按照順序傳遞給儀器的客戶端軟件，拼成一條采樣曲線（即：原始檢測數據，如圖2），以便進一步的算法處理。

3、濾波處理：主要是對硬件模塊傳遞過來的原始檢測數據，進行濾波計算處理；用于進一步濾除實際檢測過程中，存在的暗電流、雜散光、試劑條的背景熒光噪聲、電流噪聲、光子噪聲、電機的電磁噪聲、等等。本方案針對上述噪聲大都是隨機信號的特點，采取滑動窗口平均濾波算法，可以很好的衰減高頻信號，對數據起到平滑作用，去除大部分的毛刺信號，可以在最大限度抑制噪聲的同時保存有用信號，從而提高信噪比。濾波后的曲線如圖3。

4、基線擬合處理：對濾波后的數據需要進一步的去除基線的處理操作。在實際檢測過程中由于溫度變化、試劑條熒光物濃度不均勻等各種噪聲原因，曲線會出現嚴重漂移，嚴重影響濃度值的計算。需要通過基線擬合算法來解決；經過綜合考慮本系統選用最小二乘法擬合來濾除基線漂移，可以有效減少噪聲干擾以及基線漂移對分析結果造成的影響。基線擬合后的曲線如圖4。

5、尋峰處理：對基線擬合后的曲線，還需要進一步的尋峰處理，即尋找T峰和C峰的位置。本方案采用在特定的波峰范圍內，尋找最大值的方法獲取T峰（對應檢測線）和C峰（對應控制線）。尋峰后的曲線如圖5。

6、計算面積：即計算T/C面積比值；理論上可以選擇T、C峰的光強值作為待測物濃度的參考點，但是為了進一步消除隨機噪聲，本方案選擇在基線擬合后的T、C峰左右各M個點范圍內求面積的方法，得到光強特征值；針對本試劑條的峰特點，M值設置為35（峰面積取值范圍如圖6）。計算得到的T峰面積為：3217878，C峰面積為：14013014。在實際測量過程中總會存在各種不穩定因素，包括點擊的震動、光源不穩定、試劑條熒光信號衰減等，導致T與C面積值整體的波動，所以采用在同一狀態下兩者的比值----T/C面積比值作為最終結果判斷，進一步減少了噪聲干擾，保證了測量精度。計算得T/C值為：0.229635。

7、計算濃度：即根據T/C光強特征值與濃度標準曲線；每批次的試劑條都會在出廠前標定標準曲線，本實驗的試劑條對應的標準曲線點為：（0，0.041317）（1.5，0.056911）（6.25，0.214792）（12.5，0.399957）（25，0.72784）（50，1.225726）（100，2.188615）（200，3.749999）（濃度單位為：μg/L）標準曲線如圖7。將第6步中計算得到T/C值0.229635帶入本標準曲線，計算得到的待測樣本濃度是：6.2617μg/L。而實驗中使用的待測樣本溶液的實際濃度是6.25μg/L，本試劑條的誤差僅為0.19%，誤差范圍很小，檢測精度很高。

以上所述實施方式僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。