一種鮮冬蟲夏草細胞活力的檢測方法與流程

本發明涉及農產品檢測領域，具體涉及一種快速、簡便的檢測鮮冬蟲夏草細胞活力的方法。

技術背景

冬蟲夏草是傳統的名貴中藥材，市場上多以其干品的形式存在。由于新鮮冬蟲夏草保持原生態，很好的保持了細胞活力，也更好的保存了其營養物質和功效成分，特別是活性多肽和多糖等大分子。因此，近年催生了即食新鮮冬蟲夏草的出現。冬蟲夏草的新鮮程度與其鮮脆口感和營養、功效成分的保持有很大的關系。因此，如何判斷鮮冬蟲夏草的新鮮程度也成為了一個重要的課題。目前尚沒有對鮮冬蟲夏草的新鮮度進行檢測的研究報道。

冬蟲夏草的新鮮度可以通過其細胞活力檢測來實現。四氮唑法(TTC法)廣泛應用于種子活力和發芽率的測定，主要原理是應用生物體內活細胞進行呼吸作用時脫氫酶將呼吸鏈上的氫脫去，而四氮唑為一種無色氧化態物質，在接受氫后轉變成紅色三苯基甲臜(TTF)，有活性的冬蟲夏草細胞會進行呼吸代謝，在呼吸代謝途徑中脫下來的氫可以將無色的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原成紅色的不溶于水的甲臜(TTF)，細胞活力越強，代謝活動也會越活躍，被染成的紅色程度也就越深，死亡的細胞由于沒有呼吸作用，因而不能被染色。因此通過觀察鮮冬蟲夏草切片的染色深淺以及染色均勻度可以判斷鮮冬蟲夏草的細胞活力，以便更好的進行鮮冬蟲夏草的質量控制。

在以往報道的技術文獻中，采用四氮唑法測定種子活力染色過程耗時一般都很長，一般需30小時以上，這很難滿足快速檢測的要求。如中國專利申請(公開號CN104686011A)一種測定茄子種子生活力的四氮唑染色法中，種子染色時間為15～40小時。TTC方法在中藥材活力測定方面有較少的文獻報道，也存在染色時間太長的問題。如文獻《TTC-脫氫酶還原法測定滇重樓細胞活力優化條件篩選》對超低溫保存的滇重樓用TTC法測定細胞活力的條件進行了優化，確定最佳條件是，采用pH值為7.0、濃度為0.8％的TTC溶液，在溫度為22℃的條件下對實驗材料染色21h。文獻《人參細胞TTC-脫氫酶活力測定條件的優化》對人參細胞活力測定進行了研究，得出人參細胞活力測定的最佳條件為TTC溶液濃度0.4％、pH 7.5、反應溫度25℃、反應時間18h。以上技術文獻中提到的四氮唑法除了耗時太長外，直接應用于冬蟲夏草細胞活力檢測還存在重復性和穩定性差，敏感度低；又由于耗時太長，染色溫度高于鮮冬蟲夏草存儲溫度，這些方法不能準確真實地反映冬蟲夏草細胞活力等問題。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術的缺陷和不足，采取切片的方法，選擇合適的切片厚度，加快了檢測鮮冬蟲夏草細胞活力時間；且在檢測前進行前處理，使鮮冬蟲夏草的活力得以保持，以使得檢測結果的真實、可靠性；本發明在選擇切片部位上也進行了研究，發現不同部位的靈敏度不同，選擇冬蟲夏草蟲體第4-7對足區段能更快的反映細胞活力，縮短檢測時間，增加靈敏度；現有技術中的類似檢測方法的時間都非常長，而本發明提供的方法染色時間選擇1～2小時就能反映出細胞活力，提供一種快速、便捷、準確檢測鮮冬蟲夏草細胞活力來反映冬蟲夏草新鮮程度的方法。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案包括以下步驟：

(1)將鮮冬蟲夏草從儲存環境中取出，進行前處理；

(2)將經過前處理的鮮冬蟲夏草進行切片，切片厚度為1～2mm；

(3)將鮮冬蟲夏草切片放置于裝有質量分數0.3％～0.5％的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液的小燒杯中浸透，置于37℃避光染色；

(4)根據染色的深淺以及染色的均勻度判斷鮮冬蟲夏草細胞活力的高低，顏色越紅，染色越均勻，表明鮮冬蟲夏草細胞活力越強。

優選地，步驟(1)所述的前處理方法為：將鮮冬蟲夏草浸沒在37℃的5％葡萄糖溶液15min。

優選地，步驟(2)中的切片為冬蟲夏草蟲體第4-7對足區段切片。

優選地，步驟(3)中2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色溶液質量分數為0.3％。

優選地，步驟(3)中染色時間為1～2h。

優選地，步驟(3)中所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液用pH 7.5的磷酸緩沖液配制而成。

本發明所具有的優點和積極效果在于：

(1)本發明采取的切片染色方式，選擇了合適的切片厚度，使染色時間大大縮短，提高了檢測的效率。

(2)本發明對鮮冬蟲夏草進行了前處理，較好的保存了鮮冬蟲夏草細胞活力，能夠真實的反映儲存環境中樣品的新鮮程度。

(3)本發明在大量實驗過程中，通過分析發現，同一根鮮冬蟲夏草的不同部位染色有較大的差異，選取了冬蟲夏草蟲體，且為蟲體第4-7對足區段進行切片，染色，大大的提高了測定方法的靈敏度、準確性、穩定性和重現性。

(4)本發明方法操作簡單，成本低廉，無需儀器檢測，能夠快速直觀的對樣品新鮮程度進行判斷，適用于大規模推廣使用。

附圖說明

圖1是鮮冬蟲夏草整體圖，冬蟲夏草蟲體具有8對足，胸足3對，靠近頭部，腹足4對，尾足1對，其中A是子座區段，B是蟲體頭部至第4對足區段，C是蟲體第4-7對足區段，D是蟲體第7對足至尾部區段。

圖2是不同染色時間的鮮冬蟲夏草細胞活力測定結果，其中圖中A是染色0.5小時后的切片，B是染色1小時后的切片，C是染色2小時后的切片，D是染色4小時后的切片，E是染色8小時后的切片。

圖3是不同處理方法對鮮冬蟲夏草細胞活力測定結果，其中圖A是經過前處理的冬蟲夏草染色切片，B是未經過前處理的冬蟲夏草染色切片。

圖4是不同部位的鮮冬蟲夏草細胞活力測定結果，其中圖A是子座染色切片，B是蟲體頭部至第4對足區段染色切片，C是蟲體第4-7對足區段染色切片，D是蟲體第7對足至尾部區段染色切片。

圖5是不同濃度的TTC溶液染色后的鮮冬蟲夏草細胞活力測定結果，其中圖A是經0.1％TTC溶液染色的切片，B是經0.2％TTC溶液染色的切片，C是經0.3％TTC溶液染色的切片，D是經0.4％TTC溶液染色的切片，E是經0.5％TTC溶液染色的切片。

圖6是不同儲藏時間的鮮冬蟲夏草細胞活力測定結果，其中圖A是儲存1個月后的染色切片，B是儲存2個月后的染色切片，C是儲存3個月后的染色切片，D是儲存4個月后的染色切片，E是儲存5個月后的染色切片，F是儲存6個月后的染色切片。

具體實施例

本發明實施例是用以說明本發明的技術方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細的說明，所屬領域的普通技術人員應當理解：依然可以對本發明的具體實施方式進行修改或者對部分技術特征進行等同替換；而不脫離本發明技術方案的精神，其均應涵蓋在本發明請求保護的技術方案范圍當中。

實施例1

(1)將鮮冬蟲夏草從儲存環境中取出，進行前處理，方法為：放置于預熱到37℃的5％葡萄糖溶液浸沒，37℃水浴15min；

(2)將步驟(1)處理的鮮冬蟲夏草蟲體部分進行切片，且切片部位為蟲體第4-7對足區段，切至1～2mm薄片，切10片；

(3)將鮮冬蟲夏草切片放置于裝有0.3％的TTC溶液的小燒杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色時間為0.5小時、1小時、2小時、4小時、8小時時分別取出2片染色后的鮮冬蟲夏草切片，吸干表面水分，觀察顏色，拍照。

結果如圖2所示，由結果可以看出，經過五個不同時間的染色，染色0.5小時后，蟲草切片開始著色，但是顏色不均勻，呈淡紅色；染色1小時后的切片著色均勻且顏色很深，呈深紅色；染色2小時后顏色也呈現深紅色；染色4小時后切片的紅色有所變淡，經過8小時染色后，染色的切片顏色呈淡紅色，甚至有白色斑點。以上結果表明，長時間的染色會褪色，最佳染色時間是1～2小時。

實施例2

(1)將鮮冬蟲夏草從儲存環境中取出2根，一根進行前處理，方法為：放置于預熱到37℃的5％葡萄糖溶液浸沒，37℃水浴15min；另外一根不做前處理，直接待用；

(2)分別將步驟(1)處理的鮮冬蟲夏草和不做前處理的冬蟲夏草蟲體相同部位進行切片，且切片部位為蟲體第4-7對足區段，切至1～2mm薄片，每根分別切4片；

(3)將2根鮮冬蟲夏草切片分別放置于裝有質量分數為0.3％的TTC溶液的小燒杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色時間為2小時時分別取出2根鮮冬蟲夏草的切片，吸干表面水分，觀察顏色，拍照。

結果如圖3所示，由結果可以看出，經過前處理的鮮冬蟲夏草切片顏色呈深紅色，切片斷面都全部染色，未經過前處理的鮮冬蟲夏草切片斷面紅色相對較淺，且斷面染色不完全，有白色斑點。以上結果表明，經過前處理能夠較好的保持從儲存環境取出的鮮冬蟲夏草細胞活力，從而更加真實準確的反映鮮冬蟲夏草樣品細胞活力和新鮮度。

實施例3

(1)將鮮冬蟲夏草從儲存環境中取出，進行前處理，方法為：放置于預熱到37℃的5％葡萄糖溶液浸沒，37℃水浴15min；

(2)將步驟(1)處理的鮮冬蟲夏草分為4個區段進行切片，分別為冬蟲夏草子座區段、蟲體頭部至第4對足區段、第4-7對足區段和第7對足至尾部，4個區段中每個區段取4片，每片切成1～2mm薄片；

(3)將4個不同區段的鮮冬蟲夏草切片分別放置于裝有質量分數為0.3％的TTC溶液的小燒杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)染色2小時后取出鮮冬蟲夏草切片，吸干表面水分，觀察顏色，拍照。

結果如圖4所示，由結果可以看出，子座區段只有邊緣呈淺紅色，中心部位未能染色，蟲體頭部至第4對足區段染色很淺，中心有白斑未染色，蟲體第4-7對足區段染色最深，斷面全部染色呈深紅色，第7對足至尾部區段染色較淺，也有少量白斑未染色。以上結果表明，蟲體第4-7對足區段能夠最好的體現鮮冬蟲夏草細胞活力，提高檢測的靈敏度，從而更加真實準確的反映鮮冬蟲夏草樣品細胞活力和新鮮度。

實施例4

(1)將鮮冬蟲夏草從儲存環境中取出一根進行前處理，方法為：放置于預熱到37℃的5％葡萄糖溶液浸沒，37℃水浴15min；

(2)將步驟(1)處理的鮮冬蟲夏草進行切片，且切片部位為蟲體第4-7對足區段，切至1～2mm薄片，切10片；

(3)將10片鮮冬蟲夏草切片分成5組，分別放入五個裝有適量質量分數為0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％TTC溶液的小燒杯中浸透，并置于37℃水浴中避光染色2小時；

(4)在染色時間為2小時后取出鮮冬蟲夏草的切片，吸干表面水分，觀察顏色，拍照。

結果如圖5所示，由結果可以看出，經質量分數為0.1％和0.2％的TTC溶液染色的切片斷面紅色相對較淺，且斷面染色不完全，有少量白色斑點，而經質量分數為0.3％、0.4％和0.5％的TTC溶液染色的切片顏色均勻，且呈深紅色，以質量分數為0.3％的TTC濃度更好。以上結果表明，使用質量分數為0.3％-0.5％的TTC溶液能夠較好的檢測從儲存環境取出的鮮冬蟲夏草細胞活力，從而更加真實準確的反映鮮冬蟲夏草樣品細胞活力和新鮮度。

實施例5

(1)取經過不同儲藏時間的鮮冬蟲夏草6根(儲存時間分別為1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月)，進行前處理，方法為：放置于預熱到37℃的5％葡萄糖溶液浸沒，37℃水浴15min；

(2)將步驟(1)處理的6根不同儲存時間的鮮冬蟲夏草進行切片，且切片部位為距離蟲體第4-7對足區段，切至1～2mm薄片，每根鮮冬蟲夏草分別切4片；

(3)將6根鮮冬蟲夏草切片分別放置于裝有質量分數為0.3％的TTC溶液的小燒杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色時間為2小時后取出鮮冬蟲夏草的切片，吸干表面水分，觀察顏色，拍照。

結果如圖6所示，由結果可以看出，6根不同儲存時間的鮮冬蟲夏草染色有顯著的差異，其中儲存1個月的鮮冬蟲夏草染色呈深紅色，且斷面染色均勻，沒有白色斑點；儲存2個月的鮮冬蟲夏草染色呈深紅色，但斷面有少量白色斑點，斑點面積很小；儲存3個月的鮮冬蟲夏草染色呈淺紅色，斷面有少量白色斑點略多；儲存4個月的鮮冬蟲夏草染色呈淺紅色，斷面白色斑塊，面積較大；儲存5個月的鮮冬蟲夏草僅外緣小面積呈淺紅色，中心部位基本未染色；儲存6個月的鮮冬蟲夏草全部未染色，斷面呈白色。以上結果表明，本發明方法能夠快速、簡便的檢測鮮冬蟲夏草的細胞活力，判斷鮮冬蟲夏草的大致儲存時間。