受農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量方法與流程

本發明涉及化學分析檢測領域，特別是指受農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量方法。

背景技術：

二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效選擇性除草劑，屬激素型喹啉羧酸類除草劑，雜草中毒癥狀與生長素類作用相似，主要用于防治稗草且適用期很長，1-7葉期均有效。水稻安全性好。

有關研究表明二氯喹啉酸作為激素類除草劑，能夠刺激乙烯在植物體內積累。二氯喹啉酸的靶標位點位于細胞壁的生物合成中，在禾本科植物中起到細胞壁合成抑制劑的作用，不同禾本科植物作用位點對二氯喹啉酸的敏感性。乙烯可抑制細胞壁合成酶的活性從而減少細胞壁的合成，乙烯含量的提高引起了ABA的積累，ABA在調節植物生長、葉片衰老、氣孔開放起重要的作用。

二氯喹啉酸在土壤中有積累作用，對煙草生產會產生明顯的藥害。我國部分煙田曾因氯喹啉酸出現大面積煙草畸形生長現象，癥狀為新葉先出現不正常生長,葉緣下卷，葉片向背皺縮,致使葉片狹長，嚴重者呈線狀，嚴重影響煙草的產量和質量。

由于煙草這一作物的特殊性，對于其受到氯喹啉酸的影響將直接影響煙農的收成，以及煙葉的質量，因此，對于氯喹啉酸對煙草的影響，需要進行多方面的，準確的，可靠的分析，目前，對于農藥侵害植物的分析雖然有報道以及一般性的分析方法，但針對氯喹啉酸對煙草侵害的研究分析還相對較少，造成在氯喹啉酸對煙草的侵害的程度，影響等少有深入的了解，并的分析的結果上還存在較大的準確度差異。

技術實現要素：

本發明提出一種農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量方法，解決了現有技術中氯喹啉酸對煙草侵害程度難以測定，或測定不夠準確的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：受農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量方法，包括以下步驟：

(1)配制試劑，包括：pH5.0的檸檬酸緩沖液、1％水合茚三酮溶液、0.1％抗壞血酸溶液、標準谷氨酸鈉溶液；

(2)氨基酸態氮的微克數為橫坐標，以吸光密度值為縱坐標繪制標準曲線；

(3)剪取煙草第四片展開葉，清洗擦干，迅速稱取0.3g，并將其剪成碎片，加入10mL蒸餾水，加熱至沸，冷卻后過濾備用；

(4)吸取上面的樣品提取液1mL，加入1mL 1％水合茚三酮溶液，在80℃恒溫水浴中加熱15分鐘，取出后用pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋至10mL，在分光光度計610nm處測定吸光密度值，再從標準曲線上查出相應的氨基酸微克數；根據以下公式求出每克鮮樣品的含氮量：

式中：

C――由標準曲線查出每毫升提取液中氨基態氮含量；

10——比色液體積；

L——測定時取樣品液毫升數；

0.3——樣品重量。

(5)在煙草5～6片真葉期移入二氯喹啉酸添加濃度為1.04×10^-3mg/kg、2.08×10^-3mg/kg、4.17×10^-3mg/kg、8.33×10^-3mg/kg、1.67×10^-2mg/kg藥土中，分別在7d、14d、21d、28d、35d采用步驟(1)～(4)測量煙葉的氨基酸總量。

進一步，步驟(1)中，各試劑的配制，采用以下配比進行：

pH5.0的檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸4.31克及檸檬酸鈉8.68克，溶于蒸餾水中稀釋500mL。

1％水合茚三酮溶液：稱取1克水合茚三酮，將其溶于100mL 95％的乙醇中。

0.1％抗壞血酸溶液：稱取0.05克抗壞血酸，將其溶于蒸餾水中并稀釋至50mL。

標準谷氨酸鈉溶液：精確量取0.1883克食用味精在80℃下烘干，然后將烘干的食用味精溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，并定容至50mL。取此溶液5mL用pH5.0檸檬酸緩沖液稀釋至50mL，即為含氨基態氮每毫升25微克的標準液。

進一步，步驟(3)中，煙草碎片的長度≤1mm。

本發明的所述農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量方法，針對煙草的特性，結合對氯喹啉酸的侵害機理研究，對農藥侵害過程氨基酸總量測定中，試劑的選配，操作環境、參數等進行了較為嚴格的調整與控制，使得到的氯喹啉酸侵害煙葉的氨基酸總量的測量更加準確，可靠，為合理使用氯喹啉酸以及消除影響，提供科學的依據。

附圖說明

圖1為氨基態氮標準曲線；

圖2為二氯喹啉酸處理的不同時期，煙草氨基酸含量。

具體實施方式

下面將結合本發明的實施例及附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

煙草種子采用品種為K326。溫室播種，育苗，于五至六片真葉期移栽，進行農藥侵害煙葉的氨基酸總量測量

(1)試劑配制

pH5.0的檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸4.31克及檸檬酸鈉8.68克，溶于蒸餾水中稀釋500mL。

1％水合茚三酮溶液：稱取1克水合茚三酮，將其溶于100mL 95％的乙醇中。

0.1％抗壞血酸溶液：稱取0.05克抗壞血酸，將其溶于蒸餾水中并稀釋至50mL。

標準谷氨酸鈉溶液：精確量取0.1883克食用味精(含谷氨酸鈉80％，而谷氨酸鈉含氮8.3％)在80℃下烘干(大約2小時)，然后將烘干的食用味精溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，并定容至50mL。取此溶液5mL用pH5.0檸檬酸緩沖液稀釋至50mL，即為含氨基態氮每毫升25微克的標準液。

(2)標準曲線的制作

表1氨基酸標準曲線

取6支試管，按表1依次加入試劑，置于80℃恒溫水浴上保溫15分鐘，取出冷卻后用pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋至10mL，立即按0、5、10、15、20、25微克的順序在分光光度計610nm處測定吸光密度值。以氨基酸態氮的微克數為橫坐標，以吸光密度值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

(3)氨基酸的提取

剪取煙草第四片展開葉，清洗擦干，迅速稱取0.3g，并將其剪成碎片(≤1mm)，加入10mL蒸餾水，加熱至沸，冷卻后過濾備用。

(4)氨基酸總量的測定

吸取上面的樣品提取液1mL，加入1mL 1％水合茚三酮溶液，在80℃恒溫水浴中加熱15分鐘，取出后用pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋至10mL，在分光光度計610nm處測定吸光密度值，再從標準曲線上查出相應的氨基酸微克數。根據以下公式求出每克鮮樣品的含氮量。

式中C――由標準曲線查出每毫升提取液中氨基態氮含量(mg)；

10——比色液體積(mL)；

L——測定時取樣品液毫升數；

0.3——樣品重量(g)。

(5)在煙草5～6片真葉期移入二氯喹啉酸添加濃度為1.04×10^-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg藥土中，分別在7d、14d、21d、28d、35d采用步驟(1)～(4)測量煙葉的氨基酸總量。

根據上述方法測定氯喹啉酸對煙草葉片氨基酸含量的影響，測定結果如圖2所示，在二氯喹啉酸處理的不同時期，煙草氨基酸含量都有升高的趨勢。在移植后7d，正常煙草和處理煙草氨基酸含量差異不顯著。移植后14d，二氯喹啉酸處理煙草葉片氨基酸含量均高于對照，并且隨著施藥量的增加，煙草氨基酸含量有升高趨勢。移植后21d，二氯喹啉酸濃度為1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg處理的煙草葉片氨基酸含量分別較對照煙草提高28.98％、44.49％、64.15％、81.92％、129.19％。結果表明，煙草經二氯喹啉酸處理葉片中氨基酸含量有升高趨勢。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。