利用多酚類化合物在材料表面實現血小板圖案化的方法與流程
本發明涉及生物材料表面修飾技術和表面微型圖案制備技術，特別涉及在材料表面調控血小板粘附行為的技術。
背景技術：
血小板是由骨髓中巨核細胞產生的具有生物活性的小塊細胞質，在生理情況下血小板發揮黏附、聚集等功能保證正常止血過程順利進行，同時血小板粘附還與病理性血栓形成、腫瘤轉移、炎癥及免疫反應等相關。因此在臨床上常需要對功能正常或異常血小板的粘附性能進行檢測，然而在體外的研究中，血小板的粘附行為受到諸多因素的影響，如空間幾何構型的限制，血小板與基底的相互作用以及血小板之間的相互作用等。因而目前臨床對血小板粘附的檢測還無法有效的評估。構建圖案化的表面可以在限定的空間范圍內有效控制血小板的粘附，從而對血小板的粘附激活機理進行研究以及對病變的血小板和抗血小板藥物進行有效的檢測。如文獻Anal.Chem.2013,85,6497-6504中，Ana Lopez-Alonso等人利用構建的血小板圖案化表面實現了血小板粘附功能的檢測，并對抗血小板藥物進行了有效評估。
目前，在材料表面實現血小板圖案化的方法主要依賴于化學圖案的構建和微納加工技術(如微接觸印刷術、光刻術等)。其中最常見的策略是首先在目標材料表面修飾一層惰性的親水表面(如聚乙烯醇、兩親性高分子等)用于排斥血小板粘附，然后在惰性表面引入生物活性蛋白(如纖維蛋白原、纖粘蛋白等)來引導血小板的粘附。如文獻Langmuir 2011,27,8316–8322中，Lindsey E.Corum等人利用聚乙烯醇和纖維蛋白原，并結合微接觸印刷術在材料表面成功實現了血小板圖案化調控。雖然這些方法能夠成功制備血小板圖案化表面，但是需要復雜多步的化學修飾以及蛋白分子的偶聯，從而限制了其在臨床上的應用和拓展。因此，構建快速、有效、低廉的血小板圖案化方法具有十分重要的意義。
多酚類化合物是指植物中一組化學物質統稱，因含有多個酚基團而得名，存在于許多普通水果和蔬菜中，來源廣泛，成本低廉，而且多酚類化合物最近報道能與多種金屬離子通過螯合作用在材料表面快速成膜。如文獻Science2013,341,154–157和文獻Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,5546-5551中，Frank Caruso等人使用多種金屬離子做為螯合交聯劑，將多酚類化合物單寧酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯成功修飾在材料表面。
目前尚未見到將多酚類材料轉移至目標材料表面而調控血小板粘附行為的類似報道。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種利用多酚類化合物在材料表面實現血小板圖案化的方法，整個制備過程中無需引入親水分子和生物活性蛋白，方法簡單快速且成本低廉。
本發明實現以上目的采用的技術方案為：
一種利用多酚類化合物在材料表面實現血小板圖案化的方法，包含以下步驟：
A)分別配置多酚化合物溶液和金屬離子溶液，然后將兩種溶液混合，得到多酚-金屬離子的混合溶液；
B)將多酚-金屬離子溶液滴加到帶有微型圖案的印章表面，得到多酚材料的圖案印章；
C)將含有多酚材料的圖案印章與目標材料表面相貼合，使多酚材料轉移至目標材料表面，揭掉印章，獲得圖案化的多酚材料表面；
D)將圖案化的多酚材料表面與富血小板血漿相接觸，血小板選擇性粘附在沒有多酚材料覆蓋的區域，實現對血小板粘附的圖案化調控。
進一步地，在上述技術方案中，在步驟A)中所述的多酚化合物溶液中多酚化合物濃度為1～40mg/mL。
進一步地，在上述技術方案中，在步驟A)中所述的多酚-金屬離子的混合溶液中多酚化合物和提供所述金屬離子的金屬鹽的濃度比為1:1-4:1。其中所述濃度比是指質量濃度比，濃度單位為mg/mL。
進一步地，步驟A)中所述的多酚化合物為單寧酸、表兒茶素沒食子酸酯或表沒食子兒茶素沒食子酸酯中的一種；所述的金屬離子為鐵離子(Fe3+)、鋁離子(Al3+)、銅離子(Cu2+)、錳離子(Mn2+)、鋅離子(Zn2+)、鈷離子(Co2+)、鎳離子(Ni2+)、鎘離子(Cd2+)、釩離子(V3+)、鉻(Cr3+)、鋯離子(Zr4+)、鉬離子(Mo2+)、銠離子(Rh3+)、釕離子(Ru3+)、鈰離子(Ce3+)、銪離子(Eu3+)、釓離子(Gd3+)或鋱離子(Tb3+)中的一種，優選為鐵離子(Fe3+)、鋁離子(Al3+)、銅離子(Cu2+)、鋅離子(Zn2+)、鈷離子(Co2+)、鋯離子(Zr4+)中的一種，更優選為鐵離子(Fe3+)、鋁離子(Al3+)、銅離子(Cu2+)、鋯離子(Zr4+)中的一種。在本發明中，所述金屬離子溶液是將提供該金屬離子的金屬鹽溶解于溶劑中制備得到，對于所述提供所述該金屬離子的金屬鹽以及溶劑不做特別限定，本領域技術人員可以采用可以提供本發明所述金屬離子的鹽類，溶解于能夠溶解該金屬鹽的溶劑中，制備得到含有適量金屬離子的金屬離子溶液，所述金屬鹽的陰離子的種類不影響本發明的技術效果。所述能夠溶解金屬鹽的溶劑可優選為去離子水、無水乙醇。
進一步地，步驟B)中所述的印章的材料為金屬或非金屬，其中金屬可以為金、銀、銅等，非金屬可以為高分子塑膠、氧化鈦等。
進一步地，步驟C)中所述的目標材料為硅片、玻璃片或石英片。
在本發明中，所述的多酚化合物溶液是將多酚化合物溶解于能夠完全溶解該多酚化合物的溶劑中制備得到。所述溶劑可優選去離子水、無水乙醇。
在本發明中，將多酚-金屬離子溶液滴加到帶有微型圖案的印章表面，其中，對于多酚-金屬離子溶液的滴加量不做特別限定，本領域技術人員可以按常規選擇適量的滴加量，優選采用1mL/mm2印章表面的量來滴加，修飾時間1～10min，以達到在節省成本的前提下完成多酚化合物對印章表面的修飾。
在本發明中，對所述的印章表面的微型圖案不做特別限定，可以采用常規的矩形條陣或者點陣。
本發明的有益效果：
本發明利用多酚類化合物與金屬離子的螯合溶液制備得到具有圖案分布的多酚類材料表面，被多酚材料覆蓋的區域具有抗血小板粘附的功能，而未被多酚材料覆蓋的區域則含有血小板粘附的特性。因而當圖案化的多酚材料表面與血小板接觸之后，血小板選擇性的粘附在未被多酚材料覆蓋的區域，從而實現對血小板的圖案化調控。本發明與現有實現血小板圖案化的方法相比，無需引入親水高分子和生物活性蛋白，且具有成本低廉、操作簡單快速的特點。所制備的血小板圖案化表面有望用于血小板粘附檢測、抗血小板藥物治療和評估等領域。
附圖說明
圖1為本發明方法中制備多酚材料的微型圖案印章(a)和實現血小板圖案化表面(b)的示意圖；
圖2為硅橡膠印章的掃描電鏡照片，比例尺為20微米；
圖3為硅片表面上單寧酸微型圖案的掃描電鏡照片(A)以及表面的能譜分析(B、C)結果，其中區域1為覆蓋單寧酸材料的區域；區域2為未覆蓋單寧酸材料的區域，比例尺為20微米；
圖4為硅片表面上單寧酸微型圖案的原子力顯微鏡照片(A)以及對目標區域的高度分析(B)；
圖5為利用單寧酸微型圖案表面與富血小板血漿接觸后的掃描電鏡照片，比例尺為20微米；
圖6為抗血小板藥物(欣維寧)處理之后的血小板在單寧酸微型圖案表面的粘附情況，其中插圖是粘附血小板的熒光染色圖像，比例尺為20微米。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。
實施例1
1)以50％的乙醇水溶液為溶劑，分別配置濃度為3.2mg/mL的單寧酸溶液和0.8mg/mL的三氯化鐵溶液，然后將兩種溶液等體積混合，得到單寧酸-鐵離子溶液(圖1a)；
2)將單寧酸-鐵離子溶液滴加到具有微型圖案(條帶間隔為20微米)的硅橡膠印章表面(圖2)，利用旋涂儀對印章表面進行修飾(圖1a)，旋涂儀的參數控制在2000rpm/min，單寧酸-鐵離子溶液的總滴液量為1mL/mm2，修飾時間為3min；
3)將修飾有單寧酸材料的印章表面與目標材料硅片表面相貼合，使單寧酸材料轉移至硅片表面，10分鐘后揭掉印章，獲得具有單寧酸微型圖案的硅片表面；
4)將具有單寧酸微型圖案的硅片與富血小板血漿相接觸，從而獲得血小板圖案化的表面。
圖3為在步驟(3)中得到的具有單寧酸微型圖案的硅片表面掃描電鏡照片(A)以及其表面的能譜分析(B、C)結果，其中區域1為覆蓋單寧酸材料的區域；區域2為未覆蓋單寧酸材料的區域。圖4為硅片表面上單寧酸微型圖案的原子力顯微鏡照片(A)以及對目標區域的高度分析(B)，由圖3和圖4中可見，單寧酸微型圖案成功轉移到硅片表面，圖案高度約為80nm。
圖5為在步驟(4)中，利用單寧酸微型圖案表面與富血小板血漿接觸后得到的硅片表面的掃描電鏡照片，血小板選擇性粘附在無單寧酸材料覆蓋的區域。
實施例2
1)以50％的乙醇水溶液為溶劑，分別配置濃度為0.8mg/mL的表兒茶素沒食子酸酯溶液和0.8mg/mL的三氯化鐵溶液，然后將兩種溶液等體積混合，得到表兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液；
2)將表兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液滴加到具有微型圖案(條帶間隔為20微米)的硅橡膠印章表面，利用旋涂儀對印章表面進行修飾，旋涂儀的參數控制在2000rpm/min，表兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液的總滴液量為1mL/mm2，修飾時間為3min；
3)將修飾有表兒茶素沒食子酸酯材料的印章表面與目標材料硅片表面相貼合，使表兒茶素沒食子酸酯材料轉移至硅片表面，10分鐘后揭掉印章，獲得具有表兒茶素沒食子酸酯微型圖案的硅片表面；
4)將具有表兒茶素沒食子酸酯微型圖案的硅片與富血小板血漿相接觸，血小板選擇性粘附在無表兒茶素沒食子酸酯材料覆蓋的區域，從而獲得血小板圖案化的表面。
實施例3
1)以50％的乙醇水溶液為溶劑，分別配置濃度為3.2mg/mL的表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液和0.8mg/mL的三氯化鐵溶液，然后將兩種溶液等體積混合，得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液；
2)將表沒食子兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液滴加到具有微型圖案(條帶間隔為20微米)的硅橡膠印章表面，利用旋涂儀對印章表面進行修飾，旋涂儀的參數控制在2000rpm/min，表沒食子兒茶素沒食子酸酯-鐵離子溶液的總滴液量為1mL/mm2，修飾時間為3min；
3)將修飾有表沒食子兒茶素沒食子酸酯材料的印章表面與目標材料硅片表面相貼合，使表沒食子兒茶素沒食子酸酯材料轉移至硅片表面，10分鐘后揭掉印章，獲得具有表沒食子兒茶素沒食子酸酯微型圖案的硅片表面；
4)將具有表沒食子兒茶素沒食子酸酯微型圖案的硅片與富血小板血漿相接觸，從而獲得血小板圖案化的表面。
實施例4
1)以50％的乙醇水溶液為溶劑，分別配置濃度為3.2mg/mL的單寧酸溶液和0.8mg/mL的氯化銅溶液，然后將兩種溶液等體積混合，得到單寧酸-銅離子溶液；
2)將單寧酸-銅離子溶液滴加到具有微型圖案(條帶間隔為20微米)的硅橡膠印章表面，利用旋涂儀對印章表面進行修飾，旋涂儀的參數控制在2000rpm/min，單寧酸-銅離子溶液的總滴液量為1mL/mm2，修飾時間為3min；
3)將修飾有單寧酸材料的印章表面與目標材料硅片表面相貼合，使單寧酸材料轉移至硅片表面，10分鐘后揭掉印章，獲得具有單寧酸微型圖案的硅片表面；
4)將具有單寧酸微型圖案的硅片與富血小板血漿相接觸，從而獲得血小板圖案化的表面。
實施例5
現利用制備的單寧酸微型圖案的表面來檢測抗血小板藥物(欣維寧)的效果。
1)以50％的乙醇水溶液為溶劑，分別配置濃度為3.2mg/mL的單寧酸溶液和0.8mg/mL的三氯化鐵溶液，然后將兩種溶液等體積混合，得到單寧酸-鐵離子溶液；
2)將單寧酸-鐵離子溶液滴加到具有微型圖案(條帶間隔為20微米)的硅橡膠印章表面，利用旋涂儀對印章表面進行修飾，旋涂儀的參數控制在2000rpm/min，單寧酸-鐵離子溶液的總滴液量為1mL/mm2，修飾時間為3min；
3)將修飾有單寧酸材料的印章表面與目標材料硅片表面相貼合，使單寧酸材料轉移至硅片表面，10分鐘后揭掉印章，獲得具有單寧酸微型圖案的硅片表面；
4)配置不同濃度(0、5、20和50μg/ml)的欣維寧藥物水溶液，將其分別滴加到富血小板血漿中，敷育30分鐘。然后將藥物處理后的血小板與具有單寧酸微型圖案的表面相接觸，待血小板粘附完成后，利用羅丹明標記的鬼筆環肽對粘附在表面的血小板進行熒光染色(圖6)。利用ImageJ軟件分析熒光圖像，得到血小板粘附區域的熒光強度和無血小板粘附區域的熒光強度的比值(Fluorescence intensity ratio，FIR)，定義無藥物處理血小板時，FIR的值為100％。由圖6可見，當藥物濃度為5μg/ml時，FIR值下降到76％，說明有24％的血小板受到了藥物刺激而不能粘附在表面；當藥物濃度提高到20μg/ml時，FIR值進一步下降到30％，表明此時約有70％的血小板受到了藥物刺激；當藥物濃度等于50μg/ml時，FIR值為9％，證明藥物對91％的血小板起到了效果。由此可見，可以利用血小板圖案化的表面對抗血小板藥物進行定性定量的評估和檢測。
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