一種試紙條及其制備方法與在尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測中的應用與流程

本發明涉及生物化學檢測技術領域，尤其涉及一種試紙條及其制備方法與在尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測中的應用。

背景技術：

尿微量白蛋白(MAU)是指在尿中出現微量的白蛋白。白蛋白是一種血液中的正常蛋白質，人體代謝正常情況下，尿中的白蛋白極少，每升尿液中白蛋白不超過20μg(<20μg/mL)。當腎臟血管發生病變，改變了腎臟濾過蛋白質(尤其是白蛋白)的功能，尿液中白蛋白的量就會升高至20μg/mL以上。因此，臨床上通常應用尿微量白蛋白來監測腎病的發生，并將其作為檢測糖尿病、高血壓、心血管疾病、腎病血管損傷的重要指標。

β2微球蛋白(β2-MG)是由淋巴細胞、血小板、多形核白細胞產生的一種小分子球蛋白，分子質量為11800，由99個氨基酸組成的單鏈多肽。β2-MG廣泛存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液以及初乳中。正常人β2-MG的合成率及從細胞膜上的釋放量相當恒定，β2-MG可以從腎小球自由濾過，99.9％在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中分解破壞；故而正常情況下，β2-MG的排出是很微量的，通常不會超過0.2μg/mL。當近曲小管輕度受損時，尿β2-MG明顯增加。糖尿病、高血壓病人早期尿β2-MG與其腎功能損害程度顯著相關。

可見，準確的檢測尿液中白蛋白和β2-MG的含量對多種疾病的早期診斷、早期治療有重要的參考價值和臨床意義。且如能實現對尿微量白蛋白和尿β2微球蛋白聯合檢測，則能夠提高糖尿病早期腎功能損害的檢出率，可以有效的為臨床診斷高血壓和糖尿病引起的早期腎功能損傷提供重要的參考依據。

目前，市售β2-MG的檢測試紙的檢測原理多采用雙抗體夾心法。在對其它待測物檢測時，雙抗體夾心法的高靈敏性能夠對檢測結果起到更積極意義。但是，實驗表明，采用雙抗體夾心法檢測，其對白蛋白的最低檢測限可達200ng/mL，對β2-MG的檢測限為2ng/ml。該檢測限比MAU和β2-MG在正常人體內的含量還要低上百倍。試紙條判別待測物含量是否超過正常值是通過是否產生條帶實現的，產生條帶則提示待測物含量超過閾值。然而，雙抗體夾心法過低的檢測限卻給MAU和β2-MG的檢測帶來了困擾。檢測限過低，導致該試紙在使用前，需要采用特定的稀釋液對尿液樣品進行稀釋，否則健康人的檢測結果也會呈現陽性。而稀釋必須按照特定的倍數進行，不僅增加了操作的復雜程度，稀釋過程中操作誤差也容易對檢測結果產生影響。

如果能夠提供適宜檢測限的試紙條，則可更有效的為臨床診斷高血壓和糖尿病引起的早期腎功能損傷提供重要的參考依據。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種試紙條及其制備方法與在尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測中的應用。本發明提供的試紙條檢測限合理。

本發明提供的試紙條，在底板上依次設置有的樣品墊、金標墊、層析膜、吸水紙；

金標墊擔載膠體金標記的白蛋白抗體和膠體金標記的β2微球蛋白抗體；

膠體金標記的白蛋白抗體的量以白蛋白抗體的量計為0.33μg/cm²；

膠體金標記的β2微球蛋白抗體的量以β2微球蛋白抗體的量計為0.11μg/cm²；

層析膜設置T1線和T2線，T1線劃有白蛋白；T2線劃有β2微球蛋白；

白蛋白的量以白蛋白計為3.5μg/cm；

β2微球蛋白的量以β2微球蛋白計為1.17μg/cm。

C線為質控線，本發明提供的試紙條的層析膜上還設置C線；所述C線劃有羊抗鼠。

層析膜上延層析方向依次設置T2線、T1線、C線。

本發明中，底板的材質為PVC；樣品墊的材質為玻璃纖維；金標墊的材質為玻璃纖維；層析膜的材質為硝酸纖維素。

本發明提供的試紙條的寬度為3.5mm。

本發明提供的試紙條的原理為通過競爭法對尿液中白蛋白和β2微球蛋白同時進行檢測。通過調整試紙條上負載的抗體、抗原和樣品墊上樣品稀釋液的濃度，從而良好的控制試紙條的檢測限恰為白蛋白和β2微球蛋白的cut off值。進而實現對尿液樣品直接檢測而不需進行特殊的前處理(稀釋或濃縮)。并且，本發明提供的試紙條采用的抗體濃度使得白蛋白與β2微球蛋白的檢測能夠同時進行而不互相干擾。因此，本發明提供的試紙條能夠提高對白蛋白和β2微球蛋白檢測的準確性，更有效的判斷尿液樣本內的白蛋白和β2微球蛋白是否超過正常含量。其操作簡便、反應快速、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。

本發明所述試紙條的制備方法，包括：

步驟1：以含有酪蛋白的PB溶液處理樣品墊；

步驟2：將膠體金標記的白蛋白抗體和膠體金標記的β2微球蛋白抗體鋪至金標墊；

步驟3：將白蛋白和β2微球蛋白分別劃線至層析膜；

步驟4：步驟1～3獲得的所述樣品墊、金標墊、層析膜依次鋪設至底板上，再鋪設吸水紙后，經切割制得試紙條；

膠體金標記的白蛋白抗體的量以白蛋白抗體的量計為0.33μg/cm²；

膠體金標記的β2微球蛋白抗體的量以β2微球蛋白抗體的量計為0.11μg/cm²；

白蛋白的量為3.5μg/cm；

β2微球蛋白的量為1.17μg/cm。

本發明中，步驟1包括：將樣品稀釋液鋪至樣品墊；

樣品稀釋液為包含酪蛋白的PB溶液，其中酪蛋白的質量分數為0.5％，PB的濃度為0.02mol/L；

樣品稀釋液的用量為5mL/90cm²。

所述樣品稀釋液的pH值為7.4。

PB溶液為磷酸鹽緩沖液，由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉與水配制而成。

所述鋪至樣品墊具體為，使樣品墊與樣品稀釋液接觸反應5min，瀝干后，37℃反應16h。

本發明中，步驟2包括：

步驟A：將白蛋白以含有海藻糖的PB溶液溶解至白蛋白的濃度為3mg/ml；制得A液；

步驟B：將β2微球蛋白以含有海藻糖的PB溶液溶解至β2微球蛋白的濃度為1mg/ml；制得B液；

步驟C：將所述A液、B液劃線至層析膜；

所述A液的使用量為35μL/30cm；所述B液的使用量為35μL/30cm。

所述含有海藻糖的PB溶液中PB的濃度為0.01mol/L；海藻糖的質量分數為3％。

所述劃至為采用劃膜儀進行劃膜后42℃反應2h。

步驟2還包括劃C線的步驟，具體為：將羊抗鼠以含有海藻糖的PB溶液溶解至羊抗鼠的濃度為1mg/ml；以35μL/30cm的用量劃線至層析膜；所述含有海藻糖的PB溶液中PB的濃度為0.01mol/L；海藻糖的質量分數為3％。

本發明中，步驟3包括：

步驟a：制備膠體金溶液；

步驟b：將所述膠體金溶液、白蛋白抗體、β2微球蛋白抗體與碳酸鉀溶液混合后靜置20min；制得溶液a；

步驟c：所述溶液a與穩定劑混合，靜置10min后，經離心、棄除上清液后，與懸浮液混合，制得溶液b；

步驟d：將所述溶液b鋪至金標膜上，37℃反應4h。

所述溶液a中白蛋白抗體的濃度為5μg/mL；β2微球蛋白抗體的濃度為3μg/mL；

所述懸浮液與溶液a的體積比為1:1；

所述溶液b鋪至金標膜的用量為5mL/90cm²。

膠體金溶液的制備采用檸檬酸三鈉還原法。

具體的，膠體金溶液的制備方法為：將15mL～20mL質量分數為1％的檸檬酸三鈉水溶液與1L水混合煮沸2min后，加入10mL質量分數為2％～4％的氯金酸水溶液，加熱沸騰反應10min，冷卻后定容至1L。

所述碳酸鉀溶液中碳酸鉀的濃度為0.2mol/L。

所述膠體金溶液與碳酸鉀溶液的體積比為5:0.03。

步驟c中所述穩定劑為PEG20000溶液，其中PEG20000的質量分數為1％。穩定劑與溶液a的體積比為5:0.1。

步驟c中所述離心的轉速為12000轉，溫度為4℃，時間為25min。

所述懸浮液為含有蔗糖、PEG20000和酪蛋白的PB溶液。

懸浮液的pH值為7.4；蔗糖的質量分數為5％；PEG20000的質量分數為1％；酪蛋白的質量分數為1％。PB溶液的濃度為0.02mol/L。

本發明提供的試紙條設置兩條檢測線，分別為T1和T2，分別用于檢測白蛋白和β2微球蛋白，實現了二者的同步檢測。本發明提供的試紙條的制備方法操作簡便，在制備過程中，嚴格控制各溶液的濃度和用量，從而使得制備的試紙條能夠具有適宜的檢測限，從而能夠實現對樣本中白蛋白和β2微球蛋白是否超過正常值快速準確的進行檢測。

本發明提供的試紙條在制備尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測產品中的應用。

本發明提供的試紙條對尿微量白蛋白的檢測原理為，將尿液樣品直接滴加于樣品墊上后，樣品沿層析方向進入金標膜，樣品中的白蛋白和β2微球蛋白與金標膜上的抗原競爭結合金標抗體，如果待檢樣品中無抗原存在，金標抗體在泳動過程中先和T線(T1線和T2線)包被抗原結合，形成肉眼可見紅線，多余金標抗體繼續泳動和質控線(C線)的羊抗鼠二抗結合，也形成一條肉眼可見紅線，此結果判為陰性。如果待檢樣品中有抗原存在，則樣品中的抗原、包被抗原競爭和金標抗體結合，包被抗原被抑制，樣品中的抗原和金標抗體結合后繼續泳動，直到和C線的二抗再次結合，此時，T線(T1線或T2線)不顯色，而C線顯紅色，結果判為陽性(T1線或T2線無色，C線紅色，為陽性)；如果結果中C線不顯色，則試紙條已失效，不能再使用。

本發明還提供了一種尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測試劑盒，包括本發明提供的的試紙條。

本發明還提供了一種聯合檢測尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合的方法以本發明提供的試紙條對待測樣品進行檢測；所述待測樣品為不經稀釋的尿液。

本發明提供的試紙條，在底板上依次設置有的樣品墊、金標墊、層析膜、吸水紙；其中，金標墊、層析膜上包被有特定含量的抗體或抗原，從而使得良好的控制試紙條的檢測限恰為白蛋白和β2微球蛋白的cut off值。并且，本發明提供的試紙條采用的抗體濃度使得白蛋白與β2微球蛋白的檢測能夠同時進行而不互相干擾。因此，采用本發明的試紙條能夠實現對尿液樣本的直接檢測，節省了前處理的步驟，且其檢測更加快速、可靠。實驗表明，本發明提供的試紙條準確率較高，且該試紙條的制備方法十分簡單。

附圖說明

圖1示陽性檢測結果；

圖2示陰性檢測結果。

具體實施方式

本發明提供了一種試紙條及其制備方法與在尿微量白蛋白和β2微球蛋白聯合檢測中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

本發明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結合實施例，進一步闡述本發明：

實施例1

膠體金顆粒制備：取1L水加入圓底燒瓶內，放置電熱套中加熱至沸騰，取1％檸檬酸三鈉15mL～20mL加入煮沸2分鐘，加入2％～4％氯金酸溶液10mL，使其加熱沸騰反應10min冷卻后定容至1L等待使用。

劃膜：取羊抗鼠，尿微量白蛋白抗原(購自HYTEST)，β2微球蛋白抗原(購自桂林英美特生物)，分別用0.01mol/L的PB+3％海藻糖將羊抗鼠、尿微量白蛋白抗原和β2微球蛋白抗原依次稀釋成1mg/mL、3mg/mL和1mg/mL使用量為35μL/30cm，用劃膜儀劃膜至硝酸纖維素膜(賽多利斯2cm，140膜)上，42℃反應2h。

標記：取5mL膠體金溶液用0.2mol/L碳酸鉀溶液30μL混合均勻，取尿微量白蛋白抗體(HYTEST 6B11)30μg，β2微球蛋白抗體(英美特1E9)10μg，混合均勻靜止20分鐘，加入100μL的1％PEG20000，靜止10分鐘，12000轉4℃離心25分鐘，棄上清，加入膠體金懸浮液(pH值7.4的0.02mol/L的PB+5％蔗糖+1％PEG20000+1％酪蛋白)5mL，鋪至3cm×30cm的玻璃纖維上，37℃反應4h。

裝條：將樣品墊，金標墊，劃好的層析膜，以及吸水紙依次貼到PVC底板上，均勻切成3.5mm寬的的膜條。

對比例1

膠體金顆粒制備：取1L水加入圓底燒瓶內，放置電熱套中加熱至沸騰，取1％檸檬酸三鈉15mL～20mL加入煮沸2分鐘，加入2％～4％氯金酸溶液10mL，使其加熱沸騰反應10min冷卻后定容至1L等待使用。

劃膜：取羊抗鼠，尿微量白蛋白抗原(購自HYTEST)，β2微球蛋白抗原(購自桂林英美特生物)，分別用0.01mol/L的PB+3％海藻糖將羊抗鼠、尿微量白蛋白抗原和β2微球蛋白抗原依次稀釋成1mg/mL、3mg/mL和1mg/mL使用量為35μL/30cm，用劃膜儀劃膜至硝酸纖維素膜(賽多利斯2cm，140膜)上，42℃反應2h。

標記：取5mL膠體金溶液用0.2mol/L碳酸鉀溶液30μL混合均勻，取尿微量白蛋白抗體(HYTEST 6B11)50μg，β2微球蛋白抗體(英美特1E9)20μg，混合均勻靜止20分鐘，加入100μL的1％PEG20000，靜止10分鐘，12000轉4℃離心25分鐘，棄上清，加入膠體金懸浮液(pH值7.4的0.02mol/L的PB+5％蔗糖+1％PEG20000+1％酪蛋白)5mL，鋪至3cm×30cm的玻璃纖維上，37℃反應4h。

裝條：將樣品墊，金標墊，劃好的層析膜，以及吸水紙依次貼到PVC底板上，均勻切成3.5mm寬的的膜條。

對比例2

膠體金顆粒制備：取1L水加入圓底燒瓶內，放置電熱套中加熱至沸騰，取1％檸檬酸三鈉15mL～20mL加入煮沸2分鐘，加入2％～4％氯金酸溶液10mL，使其加熱沸騰反應10min冷卻后定容至1L等待使用。

劃膜：取羊抗鼠，尿微量白蛋白抗原(購自HYTEST)，β2微球蛋白抗原(購自桂林英美特生物)，分別用0.01mol/L的PB+3％海藻糖將羊抗鼠、尿微量白蛋白抗原和β2微球蛋白抗原依次稀釋成1mg/mL、3mg/mL和1mg/mL使用量為35μL/30cm，用劃膜儀劃膜至硝酸纖維素膜(賽多利斯2cm，140膜)上，42℃反應2h。

標記：取5mL膠體金溶液用0.2mol/L碳酸鉀溶液30μL混合均勻，取尿微量白蛋白抗體(HYTEST 6B11)15μg，β2微球蛋白抗體(英美特1E9)5μg，混合均勻靜止20分鐘，加入100μL的1％PEG20000，靜止10分鐘，12000轉4℃離心25分鐘，棄上清，加入膠體金懸浮液(pH值7.4的0.02mol/L的PB+5％蔗糖+1％PEG20000+1％酪蛋白)5mL，鋪至3cm×30cm的玻璃纖維上，37℃反應4h。

裝條：將樣品墊，金標墊，劃好的層析膜，以及吸水紙依次貼到PVC底板上，均勻切成3.5mm寬的的膜條。

對比例3

膠體金顆粒制備：取1L水加入圓底燒瓶內，放置電熱套中加熱至沸騰，取1％檸檬酸三鈉15mL～20mL加入煮沸2分鐘，加入2％～4％氯金酸溶液10mL，使其加熱沸騰反應10min冷卻后定容至1L等待使用。

劃膜：取羊抗鼠，尿微量白蛋白抗體(HYTEST 1C8)，β2微球蛋白抗體(英美特生物6D11)，分別用0.01mol/L的PB+3％海藻糖將羊抗鼠、尿微量白蛋白抗體和β2微球蛋白抗體依次稀釋成1mg/mL、1mg/mL和1mg/mL使用量為35μL/30cm，用劃膜儀劃膜至硝酸纖維素膜(賽多利斯2cm，140膜)上，42℃反應2h。

標記：取5mL膠體金溶液用0.2mol/L碳酸鉀溶液30μL混合均勻，取尿微量白蛋白抗體(HYTEST 6B11)25μg，β2微球蛋白抗體(英美特1E9)15μg，混合均勻靜止20分鐘，加入100μL的1％PEG20000，靜止10分鐘，12000轉4℃離心25分鐘，棄上清，加入膠體金懸浮液(pH值7.4的0.02mol/L的PB+5％蔗糖+1％PEG20000+1％酪蛋白)5mL，鋪至3cm×30cm的玻璃纖維上，37℃反應4h。

裝條：將樣品墊，金標墊，劃好的層析膜，以及吸水紙依次貼到PVC底板上，均勻切成3.5mm寬的的膜條。

實施例2

將尿微量白蛋白抗原和β2微球蛋白抗原稀釋成0.1ng/ml，0.5ng/ml，2ng/ml，20ng/ml，200ng/ml，1μg/ml，2μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml分別取30條，每個條件用3條進行檢測實施例1和對比例1～3的試紙條將抗原加入樣品墊后直接反應，5分鐘后看結果。結果如表1：

表1試紙條檢測限

而尿微量白蛋白(MAU)和β2微球蛋白(β2-MG)的cut off值分別為20μg/ml和0.2μg/ml。

由表1可知：

實施例1試紙條對尿微量白蛋白和β2微球蛋白檢測限分別為20μg/ml和200ng/ml，與cut off值一致。

對比例1尿微量白蛋白和β2微球蛋白的檢測限分別為50μg/ml以上和1μg/ml，

對比例2尿微量白蛋白和β2微球蛋白的檢測限分別為10ug/ml和200ng/ml，

對比例3(雙抗體夾心法，現有技術)尿微量白蛋白和β2微球蛋白的檢測限分別為200ng/ml和2ng/ml，低于cut off值100倍。

從靈敏度上看實施例1制得的試紙條的檢測限最為適宜，樣品無需前處理即可直接用于檢測。

實施例3

取尿微量白蛋白和β2微球蛋白陽性標本各10份，正常人標本10份進行檢測，以實施例1的試紙條進行檢測。5分鐘看結果。檢測結果如表2：

表2檢測結果

表2顯示，尿微量白蛋白為陽性的標本中β微球蛋白有一部分為陽性，而β2微球蛋白為陽性的標本尿微量白蛋白同樣也有一部分為陽性。而陰性標本中，則二者的檢測結果皆為陰性。該結果與預期完全相符，說明本發明提供的試紙條準確率很高。

其中，陽性結果如圖1，陰性結果如圖2。

以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。