一種采用高效液相色譜法同時(shí)檢測乳中克拉維酸和他唑巴坦的方法與流程

本發(fā)明涉及一種采用高效液相色譜法同時(shí)檢測乳中克拉維酸和他唑巴坦的方法，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

克拉維酸和他唑巴坦都是競爭性β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可以與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合后使其失活，具有抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用。

抗生素的大量應(yīng)用，導(dǎo)致其在乳中的殘留問題受到廣泛關(guān)注。為了躲避抗生素的檢出，有些人在乳中添加β-內(nèi)酰胺酶，用以降解抗生素，從而無法判斷乳中是否含有抗生素。所以，針對(duì)這一現(xiàn)象，建立了關(guān)于乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法。但是，有些人又利用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑能不可逆地與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合的性質(zhì)，在乳中添加β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，使β-內(nèi)酰胺酶失去活性，導(dǎo)致陽性奶不能被檢測出來。

關(guān)于乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法在國內(nèi)外還沒有現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，國外由于其文化發(fā)展程度的差異，主要將目標(biāo)放在臨床醫(yī)療中的使用情況，并沒有看到克拉維酸和他唑巴坦在乳中的報(bào)道；而國內(nèi)對(duì)于克拉維酸和他唑巴坦的檢測方法的報(bào)道很少，文獻(xiàn)報(bào)道的方法又主要集中在微生物法、酶法、毛細(xì)管電泳法等。

由于目前尚無良好有效的檢測手段，建立乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦的檢測方法非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種采用高效液相色譜法同時(shí)檢測乳中克拉維酸和他唑巴坦的方法，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用高效液相色譜法同時(shí)檢測乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦的方法，該方法步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱；檢測波長為210nm-220nm；流動(dòng)相為磷酸溶液-甲醇；流速為0.7mL/min-1.2mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時(shí)間為10min。

優(yōu)選地，所述前處理，是稱取1份牛奶與乙腈混合，震蕩混勻后離心，取上清液與正己烷混合，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相復(fù)溶，最后過微孔濾膜。

優(yōu)選地，所述磷酸溶液濃度為0.01％-0.03％；pH為3.5-4.5。

更優(yōu)選地，所述磷酸溶液濃度為0.02％；pH為4。

優(yōu)選地，所述磷酸溶液-甲醇，體積比為95:5-90:10。

更優(yōu)選地，所述磷酸溶液-甲醇，體積比為90:10。

優(yōu)選地，所述C18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，5μm。

優(yōu)選地，具體步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理：稱取1份牛奶與3份-5份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與4份-6份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在35℃-45℃氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相復(fù)溶，最后過微孔濾膜；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為4.6mm×250mm，5μm的C18色譜柱；檢測波長為210-220nm；流動(dòng)相為體積比為95:5-90:10的磷酸溶液-甲醇；流速為0.7mL/min-1.2mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時(shí)間為10min；所述磷酸溶液濃度為0.01％-0.03％，pH為3.5-4.5。

更優(yōu)選地，具體步驟如下：

1)將樣品進(jìn)行前處理：稱取1份牛奶與4份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與5份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在40℃氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相復(fù)溶，最后過微孔濾膜；

2)按照如下色譜條件利用高效液相色譜進(jìn)行測定；所述色譜條件為：色譜柱為4.6mm×250mm，5μm的C18色譜柱；檢測波長為215nm；流動(dòng)相為體積比為90:10的磷酸溶液-甲醇；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL；洗脫時(shí)間為10min；所述磷酸溶液濃度為0.02％，pH為4。

以上所述任一方法在同時(shí)檢測克拉維酸和他唑巴坦中的應(yīng)用。

本發(fā)明對(duì)采用HPLC法同時(shí)檢測乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得最佳色譜條件，然后針對(duì)此條件進(jìn)行克拉維酸和他唑巴坦方法學(xué)驗(yàn)證。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明采用高效液相色譜法建立了乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸的同時(shí)檢測方法，樣品采用乙腈除蛋白，正己烷脫脂的方法，最佳色譜條件為：色譜柱為Hypersil ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為0.02％磷酸溶液(pH4)-甲醇(90:10)，檢測波長為215nm，流速為1mL/min。該方法的線性范圍為12.5～200μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9990和0.9992，平均回收率在81％～92％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.650％。本發(fā)明方法操作簡便，結(jié)果可靠，對(duì)于保證產(chǎn)品的質(zhì)量，保護(hù)消費(fèi)者健康具有十分重要的作用，具有一定的現(xiàn)實(shí)和指導(dǎo)意義。適用于乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦的同時(shí)檢測。

附圖說明

圖1最佳色譜條件下克拉維酸和他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

圖2最佳色譜條件下原料乳中添加克拉維酸和他唑巴坦的色譜圖。

圖3克拉維酸和他唑巴坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

實(shí)施例1：

一、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精確稱取克拉維酸和他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，將其配成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用流動(dòng)相稀釋成所需的濃度，所有溶液使用前需過0.45μm的微孔濾膜。

二、液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長：210-220nm(優(yōu)選為215nm)；流動(dòng)相：0.02％磷酸溶液(pH4)-甲醇(90:10)；流速：0.7mL/min-1.2mL/min(優(yōu)選為1mL/min)；進(jìn)樣量：10μl；梯度洗脫時(shí)間：10min。

三、樣品前處理方法

稱取1份牛奶與3份-5份乙腈混合于離心管中，震蕩混勻后離心，取上清液與4份-6份正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻后離心，棄去正己烷層，在35℃-45℃氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相復(fù)溶，最后過微孔濾膜。

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛奶與乙腈的最佳體積比為1:4，牛奶與正己烷的最佳體積比為1:5時(shí)，氮?dú)獯蹈勺罴褱囟葹?0℃，即稱取1份(如1mL)牛奶與4份(如4mL)乙腈混合于離心管中，震蕩混勻(如1min)后離心(如4000r/min，15min)，取上清液與5份(如5mL)正己烷混合于另一離心管中，震蕩混勻(如1min)后離心(如4000r/min，8min)，棄去正己烷層，重復(fù)除脂2次，在40℃氮?dú)獯蹈珊螅昧鲃?dòng)相復(fù)溶，最后過微孔濾膜(如0.45μm)。

四、色譜條件的優(yōu)化

1、流動(dòng)相選擇及配比的優(yōu)化

本試驗(yàn)首先考察了同等條件下甲醇-水(10：90)和乙腈-水(10：90)兩種流動(dòng)相對(duì)物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水時(shí)，色譜峰拖尾；當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，峰型好，分離度高，待測物質(zhì)可得到好的洗脫效果。因此，本試驗(yàn)確定甲醇-水為流動(dòng)相。

確定甲醇-水為流動(dòng)相后，考察甲醇與水以不同的比例存在時(shí)，對(duì)待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，甲醇比例從5％到35％的變化過程中，隨著甲醇濃度的降低，保留時(shí)間逐漸延長(表-1)。但當(dāng)甲醇濃度低于10％時(shí)，分離條件沒有達(dá)到最佳狀態(tài)，雜質(zhì)和克拉維酸與他唑巴坦沒有完全分開。因此甲醇-水最佳體積比＝10:90。

表1流動(dòng)相配比與保留時(shí)間的關(guān)系

2、緩沖溶液的選擇及濃度的優(yōu)化

在色譜分析中，向水相中添加緩沖溶液，達(dá)到防止樣品解離，峰型拖尾，增加方法的可靠性等作用。本試驗(yàn)考察四丁基氫氧化銨和磷酸氫二鉀兩種緩沖溶液對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，以四丁基氫氧化銨為緩沖溶液時(shí)，克拉維酸的色譜峰出現(xiàn)包峰現(xiàn)象，分離效果較差；而選擇磷酸氫二鉀時(shí)，克拉維酸得到較好的洗脫，且分離度好。因此，本試驗(yàn)選擇以磷酸作為緩沖溶液。

在水相中添加磷酸，配制成不同濃度的磷酸溶液，按照前面確定的甲醇與水的最佳體積比進(jìn)行混合，考察緩沖溶液的濃度對(duì)待測物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),流動(dòng)相的離子強(qiáng)度越高,則保留時(shí)間越長(表-2),但考慮液相色譜對(duì)濃度的限制,在保證有效分離的前提下,應(yīng)選擇離子強(qiáng)度相對(duì)較低的緩沖液體作為流動(dòng)相。因此，本試驗(yàn)確定磷酸的最佳濃度為0.02％。

表2磷酸濃度與保留時(shí)間的關(guān)系

3、緩沖溶液pH值的優(yōu)化

緩沖溶液pH值的選擇對(duì)于試驗(yàn)的結(jié)果非常重要，若pH值的選擇不恰當(dāng)會(huì)導(dǎo)致分裂峰、不對(duì)稱峰、肩峰或?qū)挿宓?。本試?yàn)考察了不同的pH值對(duì)保留時(shí)間及分離效果的影響。結(jié)果顯示，pH值的改變對(duì)保留時(shí)間影響不大(表-3)，但可以影響色譜峰的峰型以及實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。當(dāng)pH值為4時(shí)，色譜峰峰型好，分離效果也好，并且與0.02％磷酸時(shí)的pH值最為接近。因此，本試驗(yàn)最佳pH為4。

表3 pH值與保留時(shí)間的關(guān)系

五、方法學(xué)的驗(yàn)證

1、系統(tǒng)適用性

由圖1、圖2可以看出，溶劑不干擾主峰和有關(guān)物質(zhì)峰的測定,克拉維酸和他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液在最佳色譜條件下的保留時(shí)間與原料乳中克拉維酸和他唑巴坦的保留時(shí)間基本一致。綜上表明，此最佳色譜條件適用于乳品中克拉維酸和他唑巴坦的同時(shí)檢測應(yīng)用。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

分別精密稱取克拉維酸和他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品25mg置于25mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻；然后分別精密量取上述溶液，用流動(dòng)性逐步稀釋濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述最佳色譜條件進(jìn)樣測定。每個(gè)濃度平行測定5次，按所得峰面積平均值(y)對(duì)克拉維酸和他唑巴坦的濃度(μg/mL)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出克拉維酸和他唑巴坦的回歸方程與相關(guān)系數(shù)(圖3)。

3、回收率與精密度

本試驗(yàn)采用空白加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率和精密度測定。將5、50、100μg/mL 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白樣品中，按照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度樣品測定5次，記錄峰面積，分別帶入回歸方程，并依據(jù)公式：回收率＝樣品測定值/標(biāo)準(zhǔn)加入量×100％進(jìn)行測定，結(jié)果如表4。由表中結(jié)果可以看出，該方法的平均回收率在81％～92％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.650％。

表4乳中克拉維酸和他唑巴坦的加標(biāo)回收率及精密度

4、實(shí)際樣品的測定

按照本試驗(yàn)所建立的高效液相色譜的方法對(duì)市場銷售的15種液態(tài)奶進(jìn)行測定，暫未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。