一種新的肝硬化或肝纖維化標志物的制作方法

本發明屬于生物醫學領域，涉及檢測高爾基體蛋白73(GP73)濃度的物質的新用途以及高爾基體蛋白73(GP73)在制備篩查診斷肝硬化或肝纖維化疾病的產品中的應用。

背景技術：

2000年Kladney等在研究成人巨細胞肝炎時發現了高爾基體蛋白73(GP73)，至今已有16年(Kladney RD,Bulla GA,Guo L,et al.Gene.2000.249(1-2):53-65)。GP73是一個有402個氨基酸、相對分子量為73kDa的跨膜糖蛋白，又稱為II型高爾基體膜蛋白(Golgiphosphoprotein 2，Golph2)和高爾基體膜蛋白I(Golgi membraneprotein 1，Golm1)。它通常位于反式高爾基復合體中，編碼GP73蛋白的基因位于第9號染色體，全長共3080個核苷酸，編碼區位于199-1404nt。GP73在多種組織中均有表達，但強弱不等，在小腸、結腸以及胃中呈高表達，而在心臟中表達最少，在肝、腎、脾、肺、子宮及睪丸表達很弱，在正常的人體肝組織中GP73主要表達于正常肝臟組織的膽管上皮細胞，而在正常肝細胞中幾乎不表達。Kladney等在隨后的研究中發現，在病毒(HBV及HCV)感染和非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者(慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝硬化及自身免疫性肝炎導致的肝硬化)組織中GP73水平均顯著上調，高于正常肝組織70倍，然而肝病組之間的差異無統計學意義。Kladney等的進一步研究表明，GP73在正常肝組織中呈低表達，在多種原因(病毒相關性、酒精性或自身免疫性)導致的肝臟疾病中GP73表達水平均顯著升高的同時，膽管上皮細胞中GP73的表達變化并不明顯，而受損肝細胞較患病前顯著表達GP73，表明肝病中GP73的高表達是肝細胞中GP73表達上調的結果，這是GP73應用于肝臟疾病領域的病理基礎(Kladney RD,Cui X,Bulla GA,Brunt EM,Fimmel CJ.Hepatology.2002.35(6):1431-40.)。Iftikhar等研究發現GP73在急性肝炎(病毒性和自身免疫性)和進行性肝硬化(酒精性肝病和慢性丙型肝炎)中表達升高，自身免疫性肝炎在經過免疫抑制劑治療后，GP73的表達降至正常水平，表明該疾病起初的GP73高水平表達可以逆轉，Iftikhar認為GP73的表達可能存在兩種調節機制：一種是急性的肝損傷，另一種存在于慢性肝病的進展過程中(Iftikhar R,Kladney RD,Havlioglu N,et al.Am J Gastroenterol.2004.99(6):1087-95.)。2005年Block等的研究是將GP73應用于肝癌臨床領域的重要一步，他們在研究血清GP73在土撥鼠中的表達關系時發現，GP73濃度在患肝癌土撥鼠中顯著高于非肝癌土撥鼠，進而研究GP73在人肝癌中的表達也得出了相同的結論。其中發現GP73診斷肝癌的敏感性為69％，特異性為75％，提示了肝癌患者血清中GP73水平明顯增高，并且對于診斷早期肝癌，GP73可能優于AFP(Block TM,Comunale MA,Lowman M,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2005.102(3):779-84.)。Cassandra因此提出GP73可能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標志物。

Marrero(Marrero JA,Romano PR,Nikolaeva O,et al.J Hepatol.2005.43(6):1007-12.)與Hu(Hu JS,Wu DW,Liang S,Miao XY.Med Oncol.2010.27(2):339-45.)等對GP73在人肝癌中的研究較早，他們認為GP73在肝癌中的含量顯著高于肝炎及肝硬化患者，與AFP診斷肝癌相比效果較好。毛一雷等(Mao Y,Yang H,Xu H,et al.Gut.2010.59(12):1687-93.)對GP73的臨床研究較為深入，其報道的4217例大樣本臨床試驗顯示：當取GP73相對單位8.5為診斷肝癌臨界值時，其診斷靈敏度與特異度分別為74.6％和97.4％，均高于AFP檢測，GP73聯合AFP檢測效果更好，同時該研究表明，盡管GP73在肝臟良性疾病(如肝炎、肝硬化)以及肝外其它惡性腫瘤中均有不同程度升高，但其在肝癌中升高尤為顯著，毛等的研究成果極大的推動了GP73在肝癌診斷領域中的應用。GP73相較于AFP的優勢在于其提高了部分AFP陰性肝癌患者的檢出。

GP73在預測肝癌預后中的作用同樣值得探討，Sun等(Sun Y,Yang H,Mao Y,et al.J Gastroenterol Hepatol.2011.26(7):1207-12.)研究結果表明，血清中GP73濃度與患者年齡、性別、腫瘤數目、肝功能、腫瘤大小、門靜脈侵犯無關，而腫瘤組織中GP73濃度與腫瘤直徑、門靜脈侵犯、腫瘤分化程度密切相關，提示組織中GP73濃度與腫瘤惡性程度有關，但未能揭示GP73與患者生存期的關系。

GP73在評價腫瘤治療效果中的作用也需要我們關注。Harm等(Hann HW,Wang M,Hafner J,et al.Cancer Biomark.2010.7(6):269-73.)認為接受首次療后GP73濃度下降患者可獲得近6年的無瘤生存期，而在首次治療后GP73濃度上升患者在5年內出現復發可能性大。毛等研究者也探討了肝癌術后血清中GP73表達水平與腫瘤復發的關系，結果顯示患者術后GP73濃度進行性下降，在術后第14天出現低峰，而當疾病復發時GP73濃度再次顯著升高。以上研究提示GP73可能在肝癌患者術后隨訪、監測疾病復發中有一定作用。

目前，大量文獻已顯示GP73可作為肝癌診斷的血清標志物，聯合AFP檢測可以提高診斷靈敏度與特異度，已有研究結果顯示其可能在肝癌術后監測中有一定意義。但事實上，國內外學者對GP73在肝癌臨床中的作用意見也并不統一。Morota(Morota K,Nakagawa M,Sekiya R,et al.Clin Chem Lab Med.2011.49(4):711-8.)與Gu等(Gu Y,Chen W,Zhao Y,Chen L,Peng T.Ann Clin Biochem.2009.46(Pt 1):38-43.)認為GP73可以作為肝臟疾病的診斷標記物，其在肝硬化及肝癌患者中濃度顯著高于肝炎患者及健康受試者，但不推薦其單獨作為肝癌診斷標記物。Yamamoto等(Yamamoto K,Imamura H,Matsuyama Y,et al.J Gastroenterol.2010.45(12):1272-82.)的研究顯示患者手術前后GP73濃度變化不大，不建議其作為術后檢測的臨床指標。同時，前發表的成果多來源于回顧性臨床研究，因此，GP73是否對肝癌真正具有診斷價值，仍亟需大規模、前瞻性、多中心合作以獲取更高級別的證據支持。另外，盡管GP73在某些肝臟疾病例如急性肝炎(病毒性和自身免疫性)和進行性肝硬化(酒精性肝病和慢性丙型肝炎)中表達升高，然而肝病組之間的差異無統計學意義，是否GP73可以作為未發生肝癌之前的病情的診斷標志物，也亟待揭示。

技術實現要素：

本發明的目的是提供了一種用于檢測高爾基體蛋白73含量的物質的新用途。

本發明所提供的用于檢測高爾基體蛋白73含量的物質新用途具體為用于檢測高爾基體蛋白73含量的物質制備篩查、輔助診斷肝臟疾病或輔助判定肝臟疾病預后的產品中的應用。

在本發明中，高爾基體蛋白73(GP73)可用作從健康人以及肝纖維化、肝硬化患者中篩查判別診斷肝纖維化、肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的標志物，且依靠檢測篩查對象樣本中的GP73蛋白濃度進行篩查診斷不同程度肝纖維化或肝硬化(主要為非乙型肝炎病毒感染的)的方法結果準確、操作簡便。同時，根據對現有技術的理解，標志物通常可用于疾病的診斷、治療及預后；GP73在不同疾病程度組中的變化和良好區分也充分說明本領域技術人員可以基于本發明實驗結果將GP73作為肝臟疾病(例如，非乙型肝炎病毒感染的肝臟疾病)輔助治療或預后判斷的標志物。

上述應用中，所述檢測高爾基體蛋白73含量的物質包括高爾基體蛋白73和/或高爾基體蛋白73的抗體；

所述高爾基體蛋白73為人高爾基體蛋白73，所述高爾基體蛋白73的抗體為人高爾基體蛋白73的抗體；

所述人高爾基體蛋白73的抗體具體為人高爾基體蛋白73單克隆抗體、多克隆抗體或基因工程抗體。

上述任一所述應用中，所述的檢測高爾基體蛋白73的物質還包括除高爾基體蛋白73和/或高爾基體蛋白73的抗體以外的測定高爾基體蛋白73含量所需的試劑和所需儀器。

含有高爾基體蛋白73編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌作為制備高爾基體蛋白73所需的生物材料在制備篩查、輔助診斷肝臟疾病或輔助判定肝臟疾病預后的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。

含有高爾基體蛋白73抗體編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌或高爾基體蛋白73抗體的免疫原或抗原作為制備高爾基體蛋白73抗體所需的生物材料在制備篩查、輔助診斷肝臟疾病或輔助判定肝臟疾病預后的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述任一所述的應用中，所述的疾病為肝硬化或肝纖維化，優選所述的肝硬化或肝纖維化為非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纖維化。

上述任一所述的應用中，所述產品的篩查或診斷對象為肝硬化、肝纖維化患者或健康人。

上述任一所述的應用中，所述產品以血清、血漿或組織間隙液位待測樣本，優選以人血清、血漿或組織間隙液位待測樣本。

上述任一所述的應用中，所述產品為試劑盒。

本發明還提供了一種篩查或輔助診斷肝臟疾病或輔助判斷肝臟疾病的預后的試劑盒，該試劑盒包括檢測高爾基體蛋白73含量的物質。

上述試劑盒中，所述的檢測高爾基體蛋白73含量的物質包括高爾基體蛋白73和/或高爾基體蛋白73的抗體。

上述任一所述的試劑盒中，所述的疾病為肝硬化或肝纖維化，優選所述的肝硬化或肝纖維化為非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纖維化。

上述任一項所述的試劑盒中，使用所述試劑盒的檢測方法包括酶聯免疫吸附法、化學發光法、電化學發光、酶促化學發光、時間分辨熒光或上轉發光法。

發明的有益效果

本發明的有益效果在于發明GP73對肝癌的診斷價值較為一般，并不能將肝癌患者與肝炎、肝硬化患者區別開，其區分能力還不及AFP的效果好。相反，GP73診斷肝硬化的靈敏度高于血清AFP，區分肝炎或肝硬化患者的能力較強。

附圖說明

圖1示出的是GP73對肝細胞癌的診斷價值ROC曲線的圖。(A)非肝硬化的慢性肝病組、肝硬化組、肝細胞癌HCC、非肝硬化的HCC、由肝硬化轉變的HCC組中分別檢測GP73在樣本中的濃度。(B)區別HCC和非肝硬化的慢性肝病的靈敏度。(C)區別HCC和肝硬化的靈敏度。(D)-(E)不同程度疾病下肝臟的免疫組化圖。

圖2示出的是GP73對肝硬化的診斷價值ROC曲線的圖。(A)GP73對所納入人群肝硬化的診斷價值(B)慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)中不同標志物的ROC曲線。(C)慢性酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)中不同標志物的ROC曲線。(D)GP73對所其他人群肝硬化的診斷價值(自身免疫性肝病、非酒精性脂肪肝及原發性膽汁性肝硬化等)

圖3示出的是血清GP73對肝纖維化診斷價值比較的圖。(A)不同程度的肝纖維化組(F＝0、1、2、3、4)中分別檢測GP73在樣本中的濃度。(B)-(D)不同程度的肝纖維化組中的ROC曲線。(E)不同程度肝纖維化下肝臟的免疫組化圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式及實驗數據對本發明作進一步的說明。盡管為了清楚的目的，在下文中使用了專用術語，但這些術語并不意味著定義或限制本發明的范圍。

如本文中所使用，術語“靈敏度”也叫“真陽性率”，指代實際有病而按試驗標準被正確判斷為有病的百分率，靈敏度越大越好，理想靈敏度為100％，

如本文中所使用，術語“特異性”也叫“真陰性率”，指代實際無病而按試驗標準被正確判斷為無病的百分率，特異度越大越好，理想特異度為100％。

約登指數(Youden Index)也叫正確診斷指數，其取值范圍在(0～1)之間，越接近于1代表診斷準確性越好，本發明方法中將診斷標準定在正確診斷指數最大處。

受試者工作特征(receiver(relative)operating characteristic,ROC)反映了靈敏度與特異度間的平衡，ROC曲線下面積是重要的試驗準確度指標。分別計算各個試驗的ROC由線下的面積(AUCROC)進行比較，面積大者，試驗的診斷價值大。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可以從商業途徑買到。

具體實施例：

實施例1血清GP73、AFP、AFP-L3、AFP-L3對原發性肝癌診斷價值的比較

1)研究對象和樣本的基線資料

血液樣本來自：肝炎患者805例；肝硬化患者2015例；肝癌患者1102例，共3922名患者，患者具體信息見表1。

其中樣本均為臨床確診病人的血清，這三種臨床樣本由解放軍第302醫院提供，患者于2013年12月至2014年12月就診于解放軍第302醫院。

2)統計學方法

應用SPSS21.0(SPSS，Chicago，Illinois，USA)統計軟件進行統計學分析，連續變量根據其分布特征選擇描述方法，近似服從正態分布的定量資料采用表示，呈偏態分布的定量資料采用中位數(M)及四分位間距描述其分布特征，定性資料組間比較采用χ2檢驗，兩獨立樣本間比較采用Mann-WhitnyU檢驗，多組樣本之間采用Kruskal Wallis檢驗。建立受試者工作特征曲線(ROC曲線)，根據曲線下面積比較不同指標對原發性肝癌診斷的價值，以為α＝0.05檢驗水準。

3)結果

采用北京熱景生物技術股份有限公司商品化的ELISA試劑盒，根據試劑盒說明書的具體實驗過程，檢測血清樣本中GP73的含量。結果顯示，慢性肝炎，肝硬化以及肝癌中GP73含量分別為45.20±0.78ng/mL、150.32±1.78ng/mL、121.32±2.47ng/mL，見表1。而慢性肝炎，肝硬化以及肝癌中甲胎蛋白AFP3的含量分別是3.12±0.23ng/mL、33.51±4.64ng/mL、567.36±40.71ng/mL。

表1研究對象的檢測結果

注：ALT是谷丙轉氨酶；AST是谷草轉氨酶；PLT是血小板；APRI是一種評分方法，是天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和血小板(PLT)比率指數；FIB-4是肝病評價指數。

4)血清GP73，AFP，AFP-L3與AFP-L3對原發性肝癌診斷價值的比較

以病理診斷結果為金標準運用ROC曲線分別計算血清GP73，AFP，AFP-L3與AFP-L3的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、假陽性率、Youden指數，并計算其最佳診斷值，結果顯示血清高爾基體蛋白73(GP73)，甲胎蛋白(AFP)與甲胎蛋白異質體(AFP-L3)的ROC曲線下面積分別為0.527(95％CI，0.503-0.552)，0.826(95％CI，0.808-0.843P<0.001)和0.824(95％CI，0.806-0.841P<0.001)，見圖1，表2。

表2 AFP、AFP-L3、AFP-L3(％)與GP73對肝細胞癌的診斷價值

實施例2血清GP73，AFP，AFP-L3(％)在肝炎，肝硬化及肝癌患者的分布特征

研究對象和統計方法與實施例1相同。實驗中，以四分位間距描述AFP，AFP-L3(％)與GP73在肝炎，肝硬化以及肝癌患者中的變化趨勢，結果顯示GP73在肝炎、肝硬化以及肝癌中的變化趨勢都較為明顯，但不能很好的將肝癌與肝炎及肝硬化患者區分開來，AFP及AFP-L3(％)僅在肝癌患者中變化明顯，能夠很好的將肝癌與肝炎及肝硬化患者區分開來，見表3。

表3 GP73，AFP，AFP-L3(％)在肝炎，肝硬化及肝癌患者中的四分位間距

實施例3血清GP73與LSM，FIB4，APRI對肝硬化診斷價值的比較

研究對象和統計方法與實施例1相同。

本部分結果表明GP73診斷肝硬化的靈敏度與特異度分別為83.97％和93.54％，曲線下面積為0.927(95％CI，0.917-0.937)(圖2)，其診斷價值優于肝臟硬度測定LSM、FIB-4指數、血小板(PLT)比值指數APRI，見表4，說明GP73區分肝硬化患者的能力較強。

表4 GP73，LSM，APRI與FIB4對肝硬化的診斷價值

實施例4血清GP73對肝纖維化診斷價值的比較

血清GP73可以很好的區分顯著肝纖維化(F≥2)、嚴重肝纖維化(F≥3)及早期肝硬化(F＝4)，血清GP73水平(Means±SE)隨著肝纖維化程度升高而升高F0(n＝21，5.74％)：35.18±2.95；F1(n＝97,26.50％)：42.73±2.57；F2(n＝67,18.31％)：50.59±3.48；F3(n＝66,18.03％)：79.93±5.67；F4(n＝115,31.42％)：169.26±7.31(P<0.001)。血清GP73對F≥2、F≥3及F＝4診斷的靈敏度，特異度及AUROC分別為F≥2：64.92％，90.68％，0.828(95％CI:0.785–0.865)；F≥3：80.66％，86.49％，0.895(95％CI:0.859–0.924)；F＝4：82.61％，91.24％，0.933(95％CI:0.902–0.956)，見圖3。

上述結果說明GP73可用作從健康人以及肝纖維化、肝硬化患者中篩查判別診斷肝纖維化、肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的潛在標志物，且依靠檢測篩查對象樣本中的GP73蛋白濃度進行篩查診斷不同程度肝纖維化或肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的方法結果準確、操作簡便。

以上，基于本發明的實施方式進行了說明，但本發明不限定于此，本領域的技術人員應該明白，在本發明的主旨的范圍內能夠以進行變形和變更的方式實施，這樣的變形和變更的方式，理應屬于本發明的保護范圍。