本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)白酒中γ-氨基丁酸的方法，具體涉及一種利用超高效液相色譜串接三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀快速檢測(cè)白酒中γ-氨基丁酸的方法，屬于酒類分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(GABA)作為一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，是白酒中的重要營(yíng)養(yǎng)成分。其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有極其豐富的生理功能，如：(1)鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮。(2)降低血壓。GABA能作用于脊髓的血管運(yùn)動(dòng)中樞，有效促進(jìn)血管擴(kuò)張，達(dá)到降低血壓的目的。據(jù)報(bào)道，黃芪等中藥的有效降壓成分即為GABA。(3)治療疾病。(4)降低血氨。(5)提高腦活力。GABA能進(jìn)入腦內(nèi)三羧酸循環(huán)，促進(jìn)腦細(xì)胞代謝，同時(shí)還能提高葡萄糖代謝時(shí)葡萄糖磷酸酯酶的活性，增加乙酰膽堿的生成，擴(kuò)張血管增加血流量，并降低血氨，促進(jìn)大腦的新陳代謝，恢復(fù)腦細(xì)胞功能。(6)促進(jìn)乙醇代謝。以嗜酒者為對(duì)象，服用GABA再飲用60mL威士忌后采血測(cè)定血中乙醇及乙醛濃度，發(fā)現(xiàn)后者濃度明顯比對(duì)照組低。(7)最新的研究表明，GABA還具有防止皮膚老化、消除體臭、改善脂質(zhì)代謝，防止動(dòng)脈硬化高效減肥等功能。
鑒于γ-氨基丁酸的上述強(qiáng)大功能，研究γ-氨基丁酸的檢測(cè)方法迫在眉睫。目前γ-氨基丁酸的檢測(cè)多采用比色法或者液相色譜-衍生化法。其中，比色法只能半定量，液相-衍生法不穩(wěn)定，操作費(fèi)時(shí)、麻煩，且衍生化試劑有毒，不利于人體健康。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)白酒中γ-氨基丁酸的方法，旨在利用超高效液相色譜儀串接三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀對(duì)白酒中的γ-氨基丁酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
本發(fā)明解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：
本發(fā)明快速檢測(cè)白酒中γ-氨基丁酸的方法，其特點(diǎn)在于：利用超高效液相色譜串接三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀對(duì)白酒中的γ-氨基丁酸進(jìn)行檢測(cè)；
所用儀器為配有三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的超高效液相色譜儀；
所述方法包括如下步驟：
(1)對(duì)待測(cè)白酒酒樣進(jìn)行前處理：
準(zhǔn)確量取50mL待測(cè)白酒酒樣于100mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至3-5mL，去除待測(cè)白酒中的醇類物質(zhì)，然后用超純水定容至10mL，最后經(jīng)0.22μm濾膜針頭過濾器過濾，獲得待測(cè)樣品；
(2)設(shè)定超高效液相色譜儀的條件為：
色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱；
柱溫為30～45℃；
樣品室溫度為10～20℃
流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為體積濃度為0.1％的乙酸水溶液；
流速為0.2～0.5mL/min；
洗脫方式為等度洗脫；
進(jìn)樣量為1～5μL；
檢測(cè)所用時(shí)間為2min；
三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器的條件設(shè)定為：
離子化方式：ESI+；
監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM；
錐孔電壓：30～50V；
毛細(xì)管電壓：3.00～5.00kV；
脫溶劑氣溫度：400～600℃；
脫溶劑氣流量：500～1000L/h；
錐空氣流量：50～100L/h；
離子源溫度：150～500℃；
質(zhì)譜方法參數(shù)表如表1：
表1：質(zhì)譜方法參數(shù)表
(3)γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取γ-氨基丁酸配制質(zhì)量濃度范圍在50～500ng/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(至少配樣5個(gè))，然后按照步驟(2)所設(shè)定的儀器的條件取1.5mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣，用超高效液相色譜串接三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)物的峰面積或者待測(cè)物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值對(duì)其所相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，獲得γ-氨基丁酸的線性回歸方程，所述線性回歸方程所對(duì)應(yīng)的曲線，即為γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以待測(cè)物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值為例，γ-氨基丁酸對(duì)應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r2見表2，方程中X為γ-氨基丁酸的濃度，Y為對(duì)應(yīng)的待測(cè)物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值。
表2：γ-氨基丁酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限
(4)待測(cè)白酒酒樣的檢測(cè)
將待測(cè)白酒酒樣按步驟(1)的方式進(jìn)行前處理獲得待測(cè)樣品后，取1.5mL按步驟(2)所設(shè)定的條件進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品的色譜圖，根據(jù)母離子對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性分析，然后根據(jù)γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。
對(duì)本發(fā)明方法作如下靈敏度測(cè)試：靈敏度測(cè)試包括儀器的靈敏度與方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，取信噪比≥3的γ-氨基丁酸的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的最小濃度為儀器檢出限；方法的靈敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥9的γ-氨基丁酸的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的最小濃度為方法定量限。所得的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。
對(duì)本發(fā)明方法作如下準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：選用同一個(gè)白酒樣品經(jīng)前處理后作為空白樣品，分為3份，分別加入一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率；選取1個(gè)白酒樣品按照同一前處理方法處理6個(gè)，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的范圍來判斷分析方法的重現(xiàn)性。所述的準(zhǔn)確性用回收率來表示，見表3，方法的重現(xiàn)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示，見表4。可以看出回收率在80～120％，RSD<10％。
表3：γ-氨基丁酸的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)
表:4：γ-氨基丁酸的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
1、本發(fā)明建立了一種利用超高效液相色譜串接三重四級(jí)桿質(zhì)譜快速檢測(cè)白酒中γ-氨基丁酸的方法，能夠準(zhǔn)確地對(duì)白酒中的γ-氨基丁酸進(jìn)行定性、定量，為白酒中γ-氨基丁酸的準(zhǔn)確判定、快速檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。
2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。
3、本發(fā)明ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱與0.1％的乙酸水溶液和乙腈流動(dòng)相的選擇對(duì)白酒中γ-氨基丁酸達(dá)到了優(yōu)異的分離效果。
4、本發(fā)明的前處理操作步驟少，從而降低了實(shí)驗(yàn)誤差并提高了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
5、本發(fā)明通過降低檢測(cè)時(shí)間可以節(jié)約人力、物力以及財(cái)力。
6、本發(fā)明采用多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，靈敏度以及較大跨度的線性范圍能夠滿足酒類樣品的檢測(cè)要求。
7、本發(fā)明測(cè)試了加標(biāo)樣品回收率以及實(shí)際樣品中γ-氨基丁酸的含量。結(jié)果表明，γ-氨基丁酸的檢出限與定量限完全能夠滿足酒類樣品的測(cè)定要求，化合物回收率、重現(xiàn)性均滿足定量測(cè)試要求。
具體實(shí)施方式
為驗(yàn)證本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性，取已知γ-氨基丁酸含量的幾個(gè)白酒樣品按本發(fā)明的方法進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：
(1)對(duì)待測(cè)白酒酒樣進(jìn)行前處理：
準(zhǔn)確量取50mL待測(cè)白酒酒樣于100mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至3-5mL，去除待測(cè)白酒中的醇類物質(zhì)，然后用超純水定容至10mL，最后經(jīng)0.22μm濾膜針頭過濾器過濾，獲得待測(cè)樣品；
(2)設(shè)定超高效液相色譜儀的條件為：
色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱；
柱溫為40℃；
樣品室溫度為20℃
流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為體積濃度為0.1％的乙酸水溶液；
流速為0.2mL/min；
洗脫方式為等度洗脫(流動(dòng)相A相與B相的體積比為20％：80％)；
進(jìn)樣量為2μL；
檢測(cè)所用時(shí)間為2min；
三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器的條件設(shè)定為：
離子化方式：ESI+；
監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM；
錐孔電壓：30V；
毛細(xì)管電壓：3.00kV；
脫溶劑氣溫度：400℃；
脫溶劑氣流量：1000L/h；
錐空氣流量：50L/h；
離子源溫度：150℃；
質(zhì)譜方法參數(shù)表如表1：
表1：質(zhì)譜方法參數(shù)表
(3)、待測(cè)白酒酒樣的檢測(cè)
將待測(cè)白酒酒樣按步驟(1)的方式進(jìn)行前處理獲得待測(cè)樣品后，按步驟(2)所設(shè)定的條件取1.5mL進(jìn)樣檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品的色譜圖，根據(jù)母離子對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性分析，然后根據(jù)γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析，即獲得待測(cè)白酒中所含有的γ-氨基丁酸及相應(yīng)含量。
各白酒樣品中γ-氨基丁酸的實(shí)際含量與通過本實(shí)施例方法測(cè)得的含量見表5。
表5