1.一種同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:包括如下步驟:
(一)將全血樣本離心,取上清液得血清或血漿,備用;
(二)標準溶液的標定:三個以上濃度的標準品的混合標準工作液200ul分別和10ul混合內標工作液以渦旋混勻,制作標準曲線系列溶液;所述標準曲線系列溶液在檢測前必須進行紫外分光光度計重新標定維生素A的準確濃度;所述標準品為視黃醇、25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3,所述混合內標工作液為維生素A同位素內標和25-羥基維生素D同位素內標的混合液;
(三)樣品前處理:
(1)精密移取步驟(二)中所述混合內標工作液加入到步驟(一)中所述血清或血漿中,渦旋混勻;
(2)再加入純水或甲酸水稀釋后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液,渦旋混勻后高速離心;
(3)再加入正己烷萃取,渦旋混勻后離心;
(4)然后取上清液后常溫N2吹干;
(5)加復溶液,渦旋混勻,超聲,高速離心后取上清液樣品待測;
(四)取步驟(3)中處理后的待測上清液樣品80μL放入自動進樣瓶中經液相色譜串聯(lián)質譜法進行分析,同時定量檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的含量;
液相色譜條件:
色譜柱:ZORBAX XDB C82.1*50mm 5μm;
等度或梯度洗脫:流動相為甲醇和水,甲醇和水均含體積比為0.1%甲酸
分析時間:4min;
柱溫:25℃;
進樣量:20μl;
流速:0.35ml/min;
串聯(lián)質譜條件:
采用電噴霧離子源ESI或大氣壓化學離子源APCI,正離子模式,選擇反應監(jiān)測模式,霧化氣溫度:350℃;霧化氣氣流:6L/min;霧化氣壓:35psi;毛細管電壓:4500v;Delta EMV(+):300。
2.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(二)中25-羥基維生素D包括25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3,所述視黃醇、25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3的同位素內標分別為[2H3]視黃醇、[2H3]25-OH-VD2和[2H6]25-OH-VD3。
3.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(三)中所述血清、乙醇和正己烷的體積比為1:1:6。
4.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(二)中標準溶液的標定,包括以下步驟:(1)維生素A的標準工作液的制備:制備濃度分別為0.014mg/L、0.028mg/L、0.056mg/L、0.113mg/L、0.225mg/L、0.45mg/L和0.90mg/L的維生素A標準工作液;(2)25-羥基維生素D的標準工作液的制備:25-OH-VD2的濃度分別為1.5ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,80ng/ml,160ng/ml和320ng/ml,25-OH-VD3的濃度分別為1.5ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,80ng/ml,160ng/ml和320ng/ml;(3)混合內標工作液的配制:制備含有400ng/ml的[2H3]視黃醇、73.5ng/ml的[2H3]25-OH-VD2和108.5ng/ml的[2H6]25-OH-VD3混合內標工作液。
5.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(四)中所述流動相中甲醇和水的體積比為87:13。
6.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(5)中所述復溶液為甲醇、乙醇或乙腈。
7.根據(jù)權利要求1-6任意一項所述的同時檢測血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法,其特征在于:步驟(一)中離心速度為3500-4000r/min,離心時間為10-15min。