一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的方法及裝置與流程

本發明主要涉及一種結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)全自動檢測與分離的方法和裝置，特別涉及在微流控芯片上實現熒光量子點與免疫學反應結合的方法對痰液樣品中結核分枝桿菌的全自動檢測裝置。

背景技術：

21世紀以來全球每年約出現8百萬結核新病例，中國每年死于結核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多，結核病成為了威脅人類健康的全球性衛生問題。結核分枝桿菌是一種細長略帶彎曲的桿菌，無芽孢，無鞭毛，不產生內、外毒素。結核分枝桿菌的致病性與細菌在組織細胞內大量繁殖引起的炎癥，菌體成分和代謝物質的毒性以及機體對菌體成分產生的免疫損傷有關。結核分枝桿菌是結核病的病原菌，可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。結核病成為威脅人類健康的全球性衛生問題，因此選擇一種檢測結核分枝桿菌的簡便，準確方法，協助臨床診斷和治療是非常必要的。

目前對結核分枝桿菌檢測的方法主要有：結核菌素實驗、細菌的直接檢查法、聚合酶鏈反應技術等。

結核菌素實驗是基于Ⅳ型變態反應原理的一種皮膚試驗，可用來檢測機體有無感染過結核桿菌。方法是取結核菌素5個單位注射一側前臂皮內，48～72h后紅腫硬結超過5mm者為陽性，≥15mm為強陽性，對臨床診斷有意義。若受試者未感染過結核桿菌，則注射局部無變態反應發生。但結核菌素試驗會出現多種假陰性結果，比如結核菌感染早期，使用免疫抑制劑者，營養不良、嚴重結核病和各種危重病人，其他如淋巴細胞免疫系統缺陷(如淋巴瘤、白血病、結節病、艾滋病等)病人和老年人的結素反應也常為陰性。

細菌的直接檢查法包括齊尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法、濃縮集菌和分離培養。抗酸染色法是診斷結核分枝桿菌的最可靠的方法，但存在需要將染料加熱，操作繁瑣費時的弊端。濃縮集菌的步驟是先集菌后檢查，從而提高檢出率，但操作過程復雜，標本常需特殊處理才可檢驗。結核分枝桿菌生長緩慢，進行分離培養時一般需2～4周才可長成肉眼可見的落菌，使用這種方法常常使患者得不到盡快的診療。細菌的直接檢查雖是結核分枝桿菌檢測的金標準，但對標本中細菌的數量也有要求，一般涂片檢查菌數需達到5x10³～5x10⁴/ml，分離培養菌數需達到1x10²/ml，標本中菌數少于此數時不易獲得陽性結果。以上這些方法給就診患者帶來不便，同時操作過程中人為因素影響較大。

聚合酶鏈反應技術應用于結核分枝桿菌DNA鑒定，每ml標本中只需幾個細菌即可獲得陽性。但實際操作中實驗器材的易遭污染，難免出現假陽性。

綜上分析，全面、快速、準確的結核分枝桿菌的檢測與分離方法是醫學領域中亟待解決的重要問題之一，對結核病的篩查、診斷和治療，都有重要意義。

技術實現要素：

根據上述提出的技術問題，而提供一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的方法及裝置。本發明采用的技術手段如下：

一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的方法，具有如下步驟：

S1、分別制備表面帶有結核分枝桿菌抗體的磁珠、生物素化的結核分枝桿菌單抗(二抗)、結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)；

S2、將生物素化的結核分枝桿菌單抗(二抗)、結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)、痰液樣品和清洗液分別放入到微流控芯片的不同的儲液池中；

S3、驅動所述痰液樣品與所述磁珠在所述微流控芯片的微通道內充分混合，得到了的磁珠抗原抗體復合物；

S4、用電流將所述磁珠抗原抗體復合物固定，電動控制清洗液清洗除去其他未結合物質；

S5、驅動所述結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)與所述磁珠抗原抗體復合物充分混合、反應，得到帶有結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)的磁珠抗原抗體復合物，驅動所述清洗液對所述帶有結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)的磁珠抗原抗體復合物進行清洗，去除其上的未結合的結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)，得到含有反應產物的磁珠，此時磁珠載體上帶有的熒光量子點(QDs)的量與樣品中TB的量相關；

S6、激光誘導熒光儀對所述含有反應產物的磁珠進行照射，并測量熒光信號的有無、數量和強度；

S7、當測量到熒光信號時，利用微流控芯片電泳技術將能夠產生熒光信號的磁珠分離出來，分析待測樣品中的結核分枝桿菌的含量。

所述步驟S6中，根據熒光信號的數量得到結核分枝桿菌的個數，根據熒光信號的強度得到結核分枝桿菌的濃度。

所述清洗液為PBS緩沖液。

本發明還公開了一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的裝置：

包括平臺結構、微流控芯片、驅動組件、激發光源、熒光檢測器和數據處理組件，所述驅動組件包括多個驅動電機，所述數據處理組件包括微處理器和數據采集卡，

所述微流控芯片包括載玻片和聚二甲基硅氧烷層，所述聚二甲基硅氧烷層上設有微溝道，所述微溝道與所述載玻片相配合形成微通道，

所述微通道包括四個樣品儲液池、分離樣品儲液池、廢液儲液池和主通道，所述主通道包括檢測區域、與所述分離樣品儲液池連通的分離通道和與所述廢液儲液池連通的廢液通道，所述四個樣品儲液池分別通過微通道與所述檢測區域的一端連通，所述檢測區域的另一端分別與分離通道和廢液通道連通，所述四個樣品儲液池、所述分離樣品儲液池和所述廢液儲液池內均設有所述驅動電極，

所述微流控芯片位于所述平臺結構內，所述驅動電極通過繼電器模塊與所述微處理器電氣連接，所述微處理器分別與顯示器、數據采集卡和所述激發光源電氣連接，所述數據采集卡與所述熒光檢測器電氣連接。

所述熒光檢測器為光電倍增管或單光子計數模塊。

所述聚二甲基硅氧烷層上通過軟光刻形成所述微溝道。

所述微溝道與所述載玻片分別通過表面等離子體處理后貼附。

本發明具有以下優點：

1、本發明主要是通過在微流控芯片上使用熒光量子點實現全自動快速完成結核分枝桿菌TB的檢測與分離，隨著納米生物材料和納米技術的發展，熒光量子點由于具有較有機熒光素優越的許多獨特的光學特性，其激發光波長范圍很寬，且穩定性遠高于有機染料，適合于體內和體外對病原體和其他目標分子的檢測。通過熒光密度進行定量檢測，不僅減少了樣品和試劑的消耗量，而且避免了多個分析步驟或過程導致的操作繁瑣、分析時間過長和樣品損失，提高了分析速度、檢測準確度和靈敏度；微流控方法檢測自動化程度高、操作程序簡單，克服了傳統方法(例如分離培養)中人工操作帶來的耗時長、操作程序復雜以及對操作人員須具備豐富的醫學、生物學知識的要求等人為因素的影響；

2、本發明的最主要的特點是采用微流控芯片作為結核分枝桿菌TB檢測的微平臺，同時所需的相關電動操控、光電檢測與分離設備亦采用體積較小、結構精密的操控設備和檢測裝置，比如使用光電倍增管或單光子計數模塊代替CCD或ICCD；用電極驅動代替泵驅動；用微處理器代替PC機等，因此，本發明的檢測與分離的裝置具有體積小巧、重量輕便、便于攜帶，可手持使用、用于現場檢測等優點。

基于上述理由本發明可在結核分枝桿菌全自動檢測與分離等領域廣泛推廣。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

圖1是本發明的實施例2中一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的裝置的結構示意圖。

圖2是本發明的實施例2中微流控芯片的結構示意圖。

具體實施方式

實施例1

一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的方法，具有如下步驟：

S1、分別制備表面帶有結核分枝桿菌抗體的磁珠、生物素化的結核分枝桿菌單抗(二抗)、結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)；

S2、將生物素化的結核分枝桿菌單抗(二抗)、結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)、痰液樣品和清洗液分別放入到微流控芯片的不同的儲液池中；

S3、驅動所述痰液樣品與所述磁珠在所述微流控芯片的微通道內充分混合，得到了的磁珠抗原抗體復合物；

S4、用電流將所述磁珠抗原抗體復合物固定，電動控制清洗液清洗除去其他未結合物質；

S5、驅動所述結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)與所述磁珠抗原抗體復合物充分混合、反應，得到帶有結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)的磁珠抗原抗體復合物，驅動所述清洗液對所述帶有結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)的磁珠抗原抗體復合物進行清洗，去除其上的未結合的結合鏈霉親和素的熒光量子點(QDs)，得到含有反應產物的磁珠，此時磁珠載體上帶有的熒光量子點(QDs)的量與樣品中TB的量相關；

S6、激光誘導熒光儀對所述含有反應產物的磁珠進行照射，并測量熒光信號的有無、數量和強度；

S7、當測量到熒光信號時，利用微流控芯片電泳技術將能夠產生熒光信號的磁珠分離出來，分析待測樣品中的結核分枝桿菌的含量。

所述步驟S6中，根據熒光信號的數量得到結核分枝桿菌的個數，根據熒光信號的強度得到結核分枝桿菌的濃度。

所述清洗液為PBS緩沖液。

實施例2

如圖1和圖2所示，一種微流控芯片上基于熒光量子點磁性富集并分離結核分枝桿菌TB的裝置，包括平臺結構1、微流控芯片2、驅動組件、激發光源3、熒光檢測器4和數據處理組件，

所述微流控芯片2包括載玻片21和聚二甲基硅氧烷層22，所述聚二甲基硅氧烷層22上設有微溝道，所述微溝道與所述載玻片21相配合形成微通道，

所述微通道包括四個樣品儲液池23、分離樣品儲液池24、廢液儲液池25和主通道26，所述主通道包括檢測區域261、與所述分離樣品儲液池24連通的分離通道262和與所述廢液儲液池25連通的廢液通道263，所述四個樣品儲液池23分別通過微通道27與所述檢測區域261的一端連通，所述檢測區域261的另一端分別與分離通道262和廢液通道263連通，所述四個樣品儲液池23、所述分離樣品儲液池24和所述廢液儲液池25內均設有所述驅動電極28，

所述微流控芯片2位于所述平臺結構1內，所述驅動電極28通過繼電器模塊5與所述微處理器6電氣連接，所述微處理器6分別與顯示器7、數據采集卡8和所述激發光源3電氣連接，所述數據采集卡8與所述熒光檢測器4電氣連接。

所述數據處理組件包括所述微處理器6和所述數據采集卡8，

所述熒光檢測器4為光電倍增管或單光子計數模塊。

所述聚二甲基硅氧烷層22上通過軟光刻形成所述微溝道。

所述微溝道與所述載玻片21分別通過表面等離子體處理后貼附。

所述檢測區域261中含有表面帶有結核分枝桿菌抗體的磁珠。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。