一種基于型特異性單抗的O型口蹄疫病毒抗體固相競爭ELISA試劑盒的制作方法

本發明涉及生物試劑盒領域，尤其涉及一種基于型特異性單抗的O型口蹄疫病毒抗體固相競爭ELISA試劑盒。
背景技術：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄類動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，會給畜牧業生產和進出口貿易造成巨大的經濟損失，該病不僅嚴重影響畜牧業的發展，也對人類健康構成很大危害。我國作為一個牛羊養殖大國，口蹄疫是危害牛羊養殖極為重要疾病，加強對口蹄疫的診斷和檢測新技術的研究和開發，突破口蹄疫診斷試劑產業化關鍵技術與工藝，是解決制約我國畜牧業快速發展的瓶頸問題的重大國家和社會需求，必將對提高我國畜牧業的整體發展水平和總體疫病防控能力，推動畜牧業的健康發展產生積極、深遠的影響，而且對食品安全和人類健康有著特殊的意義。并且要從根本上控制口蹄疫的發生與流行，必須首先加強對本病的診斷學的研究，為控制我國口蹄疫提供技術支撐。目前，口蹄疫病毒的血清型多，持續感染無癥狀帶毒嚴重，準確診斷血清型和精準監測隱性帶毒，是防控該病的首要環節。與生命領域的診斷監測技術發展同步，口蹄疫診斷監測技術的發展歷程可分為3個階段，即早期的補體結合試驗和病毒中和試驗，隨后以酶聯免疫吸附反應(ELISA)為核心的病原和抗體檢測方法，現今的以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的多種分子診斷技術。然而，隨著生物技術的發展，已有方法表現出了這樣或那樣的不足，或煩瑣費時，或沒有達到十分精準的程度。目前應用于口蹄疫診斷有病毒分離、ELISA、PCR、凝集試驗、免疫膠體金層析技術等，應用最廣泛的是液相阻斷ELISA，但LPB-ELISA程序較多、操作步驟復雜，檢測至少需要一天的時間才能獲得結果，因此在疫情突發時無法實現大量的樣品的即時檢測。要克服現狀就必須研制新型ELISA診斷技術。固相競爭ELISA方法是OIE推薦的標準方法。通過篩選和制備診斷關鍵標識物(型特異性單抗)，解決型間交叉、穩定性差的問題，突破了使用多抗交叉、不穩定的問題；通過HRP標記單抗，替代現有液相阻斷ELISA中的口蹄疫兔抗、豚鼠抗血清及抗豚鼠酶標抗體，簡化ELISA方法步驟，這樣就減少可實驗操作步驟，底物直接和一抗反應，節省了時間，提高了敏感性和特異性。提高穩定性，突破了原來ELISA需要一抗和二抗等反應過程，大幅度縮短檢測時間。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種基于型特異性單抗的O型口蹄疫病毒抗體固相競爭ELISA試劑盒。為實現上述目的，本發明提供一種基于型特異性單抗的O型口蹄疫病毒抗體固相競爭ELISA試劑盒，其特征在于，含有HRP標記的O型口蹄疫特異性單抗。進一步，所述HRP標記的O型口蹄疫特異性單抗制備方法為,脾細胞的細胞懸液的制備：采用常規免疫方法對Balb/c小鼠進行免疫，共4次，首先用卡介苗致敏小鼠，200μl/只；一周后將純化的O型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏完全佐劑等質量混勻、充分乳化后，按0.3ml/只免疫小鼠，腋窩，腹股溝注射，共免疫5只；初次免疫后每間隔3周再免疫一次，免疫的O型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏不完全佐劑等質量混勻，在小鼠頸背部皮下分次多點注射，細胞融合前3天腹腔加強免疫一次；3天后摘該小鼠眼球取血，得到脾細胞的細胞懸液；細胞融合：將處于對數生長期的骨髓瘤細胞和所述脾細胞的細胞懸液混勻，離心棄上清；將融合管置手掌中來回摩擦，使細胞塊松動，用滴管往玻璃管中緩慢加入0.7ml37℃預熱的50％PEG1000，90s內加完，靜置60s，在5min內先慢后快逐滴加入37℃預熱的無血清DMEM，共加10ml，輕搖混勻后，離心棄上清；用HAT培養液重懸細胞，隨即移入60mlHAT培養液中，輕輕混勻，然后按100μl/孔轉入96孔細胞培養板中，置于5％CO2、37℃恒溫培養箱中培養；雜交瘤細胞的篩選：培養第六天用HAT培養液進行半量換液，待細胞長到孔底的1/4～1/3時吸出上清進行間接ELISA檢測；P/N≥2.1的細胞即為雜交瘤細胞；雜交瘤細胞的克隆化培養；單克隆抗體的制備：每只小鼠腹腔注入0.5mL1x106～6x106/mL的雜交瘤細胞，待小鼠腹部慢慢隆起，小鼠精神沉郁、不走動、瀕臨死亡時，頸椎脫臼處死小鼠，收集腹水，室溫、10000r/min離心10min，收集中間透亮液體即為單克隆抗體；HRP標記純化的單克隆抗體：將飽和硫酸銨純化之后濃度為5.284mg/ml的單克隆抗體0.3mL與0.1mL過氧化物酶加入管中，輕輕吹打混勻，4℃過夜；再加入40μL的三乙醇胺，混勻，加入50μL的硼氫化鈉，混勻，4℃放置30min后，加入10μL甘氨酸混勻；之后將混合液置于透析袋中透析，透析液為PH7.2的PBS，所得即為HRP標記的O型口蹄疫特異性單抗。進一步，所述細胞融合步驟中，脾細胞數與骨髓瘤細胞數的比例為5:1到10:1。本發明還保護使用所述固相競爭ELISA試劑盒進行O型口蹄疫病毒抗體水平監測的用途。本發明所涉及的檢測方法以輕簡化或精準為目標的新型定性定量技術。本發明針對口蹄疫現有診斷技術存在費時、交叉嚴重、穩定性差等技術缺陷，通過篩選和制備診斷關鍵標識物(型特異性單抗)，解決型間交叉、穩定性差、費時、步驟繁瑣等問題，突破了使用多抗交叉、不穩定、費時、步驟繁瑣的問題；通過HRP標記該單抗，替代現有ELISA中口蹄疫兔抗、豚鼠抗血清及抗豚鼠酶標抗體，簡化ELISA方法步驟，提高穩定性、大幅度縮短檢測時間，從24h縮短至1.5小時內，突破了原來ELISA需要一抗和二抗等反應過程。該方法可為檢測O型口蹄疫的免疫和感染狀況提供一種更好的確診方法。本發明所制備的檢測試劑可為O型口蹄疫流調及抗體水平監測提供支持。附圖說明圖1是抗體效價測定(定量)檢測10份樣品布局圖。圖2是抗體測定(定性)檢測20份樣品布局圖。圖3是檢測實施例1中腹水單抗的特異性結果圖。圖4是未純化和純化的腹水單抗的SDS-PAGE電泳圖。圖5是5E5-HRP的特異性的ELISA檢測結果圖。圖6是5E5-HRP的效價的檢測結果圖。圖7是型特異性單抗5E5的抗原反應譜檢測結果圖。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1：1.1材料1.1.1實驗動物、抗原及細胞8周齡SPF級BALB/c雌鼠，購買于中國農業科學院蘭州獸醫研究所；SP/20及BHK-21細胞購自中科院武漢病毒所國家典藏物保存中心。O型口蹄疫病毒滅活抗原，A型口蹄疫病毒滅活抗原，Asia1型口蹄疫病毒滅活抗原均購自中農威特生物科技股份有限公司。1.1.2主要試劑液體石蠟，山羊抗小鼠IgG-HRP購自Sigma公司，96孔酶標板購自Costar公司，2mol/L的H2SO4由蘭州獸醫研究所檢測組提供，胎牛血清購自GIBICO公司，TMB購自SurModics公司,改良型RPMI-1640購自Hyclone公司，碳酸鹽緩沖液膠囊購自Sigma公司，未預染蛋白Marker購自Fermentas。1.2方法1.2.1動物免疫采用常規免疫方法對Balb/c小鼠進行免疫，共4次，首先用卡介苗致敏小鼠，200μl/只。一周后將純化的O型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏完全佐劑等質量混勻、充分乳化后，按0.3ml/只免疫小鼠，腋窩，腹股溝注射，共免疫5只；初次免疫后每間隔3周再免疫一次，免疫的O型口蹄疫病毒滅活抗原與福氏不完全佐劑等質量混勻，在小鼠頸背部皮下分次多點注射，細胞融合前3天腹腔加強免疫一次。1.2.2篩選方法的建立篩選時采用間接ELISA檢測法，用方陣滴定試驗選擇最佳抗原包被濃度。辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG作為二抗，最佳二抗濃度采用本實驗室通用工作濃度1:1000。具體步驟如下：(1)將抗原作1:250，1:500和1:1000的稀釋，100μl/孔包被，37℃作用2h，4℃過夜。(2)次日，將酶標板中包被液拍干，用封閉液按120μl/孔封閉，37℃作用2h后，拍干待測。(3)陽性血清自1:40開始倍比稀釋至第9列(1:10240)，同時設1組陰性對照(即為未免疫O型口蹄疫抗原的老鼠血清)，一組空白對照(即為不加任何血清的對照孔)；加樣后37℃作用0.5h，洗滌3次。(4)加入酶標辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗，50μl/孔，37℃作用30min，洗滌3次。(5)加入底物A,B各50μl/孔，于37℃下顯色10min，用終止液終止反應，50μl/孔。用酶標檢測儀測定OD450值。用間接ELISA檢測法篩選時，選擇陽性血清和陰性血清的比值最大，且OD450值接近于1的抗原稀釋度作為間接ELISA反應體系的最佳工作濃度。篩選雜交瘤細胞時用該體系對細胞上清液進行檢測，當P/N≥2.1時，判為陽性。1.2.3小鼠效價的測定間接ELISA方法建立后，選用最佳包被濃度檢測免疫小鼠的抗體效價。選取免疫效價檢測值最高的小鼠腹腔追加免疫一次，三天后取該鼠的脾臟進行細胞融合。1.2.4.雜交瘤細胞株的建立1.2.4.1骨髓瘤細胞的準備于融合前兩周復蘇骨髓瘤細胞SP/20((購自中科院武漢病毒所國家典藏物保存中心)。將凍存管自液氮中取出，立即放到37℃溫水中，讓其溶解，待完全溶解后，1000rpm離心10min，棄上清，沉淀用含20％胎牛血清的DMEM完全培養液小心混懸，混勻后加入細胞培養瓶中，置于5％CO2、37℃恒溫培養箱中傳代培養。培養過程在培養液中加入8-氮鳥嘌呤，按100μl/瓶細胞加入，每日處理一次，連續處理三次。使SP/20細胞對HAT培養液更加敏感。傳至8瓶，并使融合當天的骨髓瘤細胞處于對數生長期，備用。1.2.4.2飼養細胞的準備細胞融合當天準備飼養細胞，方法如下：(1)取一只8～10周齡健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制備陰性血清。斷頸處死，用75％的酒精消毒處理。(2)將小鼠置于超凈工作臺中，腹面向上，用鑷子提起小鼠腹部皮膚，在下腹部剪一小口，縱向剝離，充分暴露腹膜，并用酒精消毒。(3)用一次性滅菌注射器抽取5mlHAT培養液注入小鼠腹腔內，右手注射器保持不動，輕搖小鼠，隨后抽取細胞懸液。(4)將細胞懸液加入60mlHAT培養基中，混勻后計數，調整細胞濃度至1～5×105個/ml。如細胞數量過少，可再按上述步驟制備飼養細胞。(5)按100μl/孔轉入到96孔細胞培養板中，置于5％CO2、37℃恒溫培養箱中培養備用。1.2.4.3脾細胞的準備(1)取三天前加強免疫的小鼠，摘眼球取血，制備陽性血清。斷頸處死，用75％的酒精消毒處理。(2)在超凈工作臺內，無菌摘取脾臟，去除脂肪和結締組織，置于200目滅菌金屬網上，用滅菌玻璃注射器芯輕輕研磨脾臟，同時緩慢滴加無血清DMEM。(3)收集脾細胞懸液，并轉移到10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，重懸于5ml無血清DMEM培養液中，脾細胞計數后備用。1.2.4.4細胞的融合(1)選擇狀態良好且呈對數生長的SP/20細胞6～8瓶，將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來并轉移到50ml離心管中，1000rpm離心10min。棄上清，用5ml無血清DMEM懸浮，計數。(2)將上述所得SP/20細胞和脾細胞懸液混勻，脾細胞數與骨髓瘤細胞數的比例應維持在5:1到10:1之間。(3)1000rpm離心5min，棄上清。(4)將融合管置手掌中來回摩擦，使細胞塊松動，此步為融合關鍵步驟。(5)用滴管往玻璃管中緩慢加入0.7ml37℃預熱的50％PEG(1000)，90s內加完，靜置60s。(6)在5min內先慢后快逐滴加入37℃預熱的無血清DMEM，共加10ml，輕搖混勻后，1000rpm離心5min，棄上清。(7)用HAT培養液重懸細胞，隨即移入60mlHAT培養液中，輕輕混勻，然后按100μl/孔轉入96孔細胞培養板中，置于5％CO2、37℃恒溫培養箱中培養。1.2.4.5雜交瘤細胞的篩選融合后注意觀察雜交瘤細胞生長狀況，一般培養三天左右即有小克隆出現。第六天用HAT培養液進行第1次半量換液，第8～10天左右，待細胞長到孔底的1/4～1/3時吸出上清進行間接ELISA檢測。以P/N≥2.1作為陽性判斷標準，用SP/20細胞培養上清及正常小鼠血清作陰性對照。對檢測為陽性的細胞進行擴大培養，同時進行克隆化培養。第一次亞克隆時換用HT培養液，兩周后換為普通完全培養液。1.2.4.6雜交瘤細胞的克隆化培養對ELISA檢測陽性的雜交瘤細胞及時進行克隆化培養，采用有限稀釋法。步驟如下：(1)制備飼養細胞，方法如前所述。HT培養液中，制備飼養細胞層，每孔100μl。(2)用移液器將ELISA檢測陽性孔中雜交瘤細胞輕輕吹打混勻，取樣，于血細胞計數板上作細胞計數，然后用HT培養液調整細胞數。首次亞克隆時一般調整細胞數至15～20個/ml，第二、第三次亞克隆時一般調整細胞數至10個/ml。(3)將雜交瘤細胞懸液接種于含飼養細胞層的96孔細胞培養板中，每孔100μl。在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養。(4)每天觀察并記錄每孔細胞克隆數，待細胞長到孔底的1/4～1/3時半量換液，并對細胞上清進行間接ELISA檢測。(5)選擇克隆數少、OD450值高的陽性孔，將其再次克隆。經3～4次克隆化操作，直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率達100％時，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細胞株即抗O型FMDV單克隆抗體的雜交瘤細胞(5E5)，應及時擴大培養并凍存。1.2.5雜交瘤細胞的復蘇從液氮罐中取出一支抗O型FMDV單克隆抗體的雜交瘤細胞(5E5)凍存管，用鑷子夾住后迅速放入37℃水浴鍋中，不停的晃動使細胞迅速融化，無菌打開凍存管，將管內細胞液移入盛有10mL改良型RPMI-1640培養基中，置于含5％CO2的37℃培養箱中等雜交瘤細胞完全貼壁后對細胞進行換液。1.2.6單克隆抗體的大量制備選取8周齡的Balb/c雌鼠，在無菌條件下，每只腹腔注射0.5mL滅菌的液體石蠟。兩周后，將準備好的雜交瘤細胞培養液(改良型RPMI-1640)注入小鼠的腹腔內。雜交瘤細胞的準備：挑選生長狀況良好的雜交瘤細胞采用培養瓶傳代培養，無菌條件下，倒掉細胞瓶內培養基，加入適量的胰酶消化細胞使其脫落，加入5mL無血清改良型RPMI-1640培養基，輕輕吹起細胞，全部移入離心管中，室溫、1000r/min離心10min，棄上清，加入適量無血清改良型RPMI-1640培養基懸起細胞，臺盼蘭細胞計數，調整細胞數量至1x106～6x106/mL，每只小鼠腹腔注入0.5mL所得細胞，每天觀察小鼠，小鼠腹部慢慢隆起，約7～10d小鼠精神沉郁、不走動、瀕臨死亡時，頸椎脫臼處死小鼠，收集腹水，室溫、10000r/min離心10min，收集中間透亮液體即為5E5也即為單克隆抗體。1.2.7腹水特異性的檢測將滅活的抗原O(0.31μg/mL)、A(0.36μg/mL)和Asia-I(0.29μg/mL)包被于酶標板，100μL/孔，4℃過夜。采用間接ELISA方法對腹水的特異性進行測定：每孔加入100μLPBS稀釋的所述5E5(1:2000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μLPBS稀釋好的山羊抗小鼠IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μLTMB，37℃孵育15min，加入2MH2SO4，用酶標儀讀取OD450值。1.2.8型特異性單抗5E5的反應譜分析將今年來我國流行的O型口蹄疫滅活抗原(購自中農威特生物科技有限公司)包被ELISA板，100μL/孔，4℃過夜。采用間接ELISA方法對O型單抗的型內反應譜進行測定：每孔加入100μLPBS稀釋的5E5(1:2000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μLPBS稀釋好的山羊抗小鼠IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μLTMB，37℃孵育15min，加入2MH2SO4，用酶標儀讀取OD450值。1.2.9HRP標記純化的單克隆抗體將飽和硫酸銨純化之后濃度為5.284mg/ml的5E50.3mL與0.1mL過氧化物酶加入1.5mL的EP管中，輕輕吹打混勻，4℃過夜。向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混勻，加入50μL的硼氫化鈉，混勻，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混勻。之后將混合液置于透析袋中透析(PH7.2的PBS)。1.2.10O型口蹄疫病毒兔抗血清的制備1.2.10.1病毒純化用無RNase的蔗糖(Sigma公司生產)制備150、250、350、450g/L的蔗糖密度梯度，4℃靜置平衡過夜。次日將樣品加于頂部，10℃35000r/min(日立CP70VB離心機)離心150min，以0.5mL為1個級分，從低濃度到高濃度進行收集。根據Bachrach等的研究，取蔗糖密度處于350～450g/L，此處為口蹄疫病毒有效滅活抗原富集區域，-80℃保存備用1.2.10.2免疫程序取上述充分乳化的弗氏完全佐劑抗原，于每只兔兩后腿足部皮下，腘淋巴結處及背部皮下多點接種，接種總量為2ml，14日后仍以上述抗原和劑量由背部皮下多點接種，進行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐劑抗原，由每只兔肩部肌肉兩點，背部皮下多點接種，接種總量為2ml，為其第三次免疫。1.2.10.3試血第三次免疫之后采血，通過O型口蹄疫液相阻斷ELISA測定兔抗血清效價，若效價達到1:1024，則采用頸動脈分離兔抗血清，若沒有達到，則進行第四次免疫，直到血清效價達到1:1024，采血分離血清備用。1.3基于酶標抗體的固相競爭ELISA方法的建立1.3.1各試劑最佳使用濃度的確定本發明利用O型口蹄疫病毒兔抗血清(1.2.10制備的O型兔抗血清)和HRP標記的O型口蹄疫特異性單抗(也就是1.2.9制備得到的HRP標記純化的單克隆抗體)建立固相競爭ELISA方法。采用方陣滴定法確立該方法中包被的多抗、抗原和競爭抗體的最佳使用濃度。1.3.2O型口蹄疫固相競爭ELISA方法的建立◆準備根據不同的需要，選擇表1-2中的一種布局來設定相應的檢測目的。圖1.抗體效價測定(定量)檢測10份樣品布局圖；圖2.抗體測定(定性)檢測20份樣品布局圖。◆稀釋血清建議在血清稀釋板上按照實驗需求稀釋血清，之后整體移至包被板反應板中。在血清稀釋板中，以60μL/孔的量用樣品稀釋液2倍連續稀釋血清，被檢血清在第1～10列從1:4(即A1～A10孔，75μL樣品稀釋液加25μL被檢血清)稀釋至1:512；在第11列稀釋陽性對照血清，方法同稀釋待檢血清；在第12列稀釋陰性對照血清，從A12～D12，方法同稀釋待檢血清；E12～H12為空白對照(僅為樣品稀釋液)。注：由于本方法是競爭ELISA方法，當稀釋血清移至反應板后，再加入等量的酶標抗體工作液，此時血清的稀釋度加倍，被檢血清從1:8～1:1024，由于陽性對照血清已經預先做了1:8倍稀釋，則變為1:32～1:4096。◆加樣將稀釋板整體平移至包被反應板中，每孔50μL；隨后給所有反應孔加50μL，標抗體工作液，輕輕震蕩，37℃反應30分鐘。◆洗滌取出酶標板，將其甩干，用洗滌液洗滌3～5次，在吸水紙上甩干。◆顯色每孔加入底物溶液50μL，于37℃溫箱靜置避光反應5～10分鐘。◆終止每孔加入50μL終止液。◆結果計算及判定在酶標儀450nm波長處，測定酶標板的每孔光吸收值，求出每份被檢血清和同板單抗對照的平均光吸收值，根據公式計算各樣品抑制率(PI)值，PI＝[1－樣品孔OD/競爭抗體對照孔OD]x100％。以競爭抗體對照孔平均OD450值介于0.9～2.2，陰性對照血清PI值＜40％，陽性對照血清PI值＞50％時，空白對照PI值＜5％，試驗成立。判斷標準：PI＞60％，抗體陽性；PI＜60％，抗體陰性；PI＝60％，判定陽性可疑，重復檢測一次，如果仍然為60，判定為陽性，如果不等于60需再次檢測，或用其它方法檢測。1.3.2固相競爭臨界值的確定對56份陽性血清樣品和27份陰性血清樣品分別進行和倍稀釋，用已建立的競爭ELISA方法檢測，統計每個樣品不同稀釋度的PI值(抑制率)，確定血清也就是抗原的最佳稀釋倍數。根據結果中各個樣品的每個稀釋度的檢測結果，最終確定為最佳臨界值。1.3.3固相競爭ELISA方法的特異性利用所建立的ELISA方法檢測口蹄疫A型、Asia1型、豬瘟、豬藍耳及羊口瘡等傳染病陽性血清樣品。同時,用該ELISA方法檢測已知O型口蹄疫陽性的血清(10份)，統計檢測結果，分析試劑盒特異性。1.3.4固相競爭ELISA方法的符合率應用商品化檢測O型口蹄疫病毒血清抗體試劑盒檢測O型口蹄疫陰、陽性血清，共計60份，商品化的試劑盒為荷蘭的PrioCHECK及韓國的VDproO型口蹄疫抗體檢測試劑盒。1.3.5固相競爭ELISA方法的重復性批內重復：用同一批次制備的多抗、抗原、HRP標記的競爭抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對7份血清樣品進行檢測獨立檢測5次，統計檢測結果，計算標準差和變異系數。批間重復：用三個批次制備的多抗、抗原、HRP標記的競爭抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對7份血清樣品進行檢測獨立檢測1次，統計檢測結果，計算標準差和變異系數2.結果2.1檢測腹水特異性結果經間接ELISA的檢測，制備的Mab與O型抗原反應性很好，與A和Asia-I型抗原及BHK-21細胞均不反應，具有良好的特異性，結果見圖3。2.2純化后5E5的SDS-PAGE分析將經飽和硫酸銨沉淀純化的5E5進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖4，其中泳道M為蛋白分子Marker；泳道1為未純化的5E5腹水電泳結果；泳道2為純化后的5E5腹水電泳結果。從圖中可以看出，純化后的5E5有兩條帶，分別是IgG的重鏈和輕鏈，大小分別約為45kDa和25kDa，與預期結果相符，使用紫外分光光度計測得抗體的濃度為5.284mg/mL。2.3標記后Mab特異性及效價的檢測結果結果見圖5和圖6。從圖5中可以看出，O型特異性單抗標記HRP后，只與O型口蹄疫病毒發生反應，與A型、Asia1型口蹄疫及BHK細胞培養上清均不發生反應，說明該標記抗體特異性很高。從圖6中可以看出，標記后的O型單抗在稀釋到1:12800時，其OD450值仍接近1.5。2.4抗O型口蹄疫的型特異性單抗5E5的反應譜分析從圖7中可以看出5E5可以與近年來流行的O型口蹄疫病毒均能發生反應，由此可以看出5E5不但具有良好的型間特異性，而且在同一型內具有很好的反應廣譜性，是作為檢測用的最佳抗體。圖5的X軸代表O型不同抗原，Y軸代表492nm處的OD值。2.5各試劑最佳使用濃度及臨界值的確定應用兔抗O型口蹄疫多抗血清及HRP酶標單抗建立的固相競爭ELISA方法。用方陣滴定法確定的兔抗多抗(效價1:1024)最佳使用濃度(1:1000)，抗原(TCID500.1ml＝7.2)的最佳稀釋度為1:15檢測單克隆抗體的最佳使用濃度稀釋(1:7000)。用已建立的方法對56份陽性血清樣品和27份陰性血清樣品進行檢測分別進行，根據結果中各個切點的敏感性及特異性結果，所以最終確定為最佳臨界值為：：當抗體稀釋度≥1:64，且PI大于60％，判定抗體陽性；小于60％，判定抗體陰性。2.6固相競爭ELISA方法的特異性利用所建立的ELISA方法檢測口蹄疫O型、A型、Asia1型、豬瘟、豬藍耳及羊口瘡等傳染病陽性血清樣品,根據判定方法均為陰性(表1)。這些數據表明,所建立的ELISA方法具有良好的特異性，血清抗體之間不存在交叉反應。同時,用該ELISA方法檢測已知O型口蹄疫陽性的血清(10份)均為陽性。由此可見所建立的O型口蹄疫血清抗體檢測方法具有良好的特異性。表1.特異性檢測結果表2.7固相競爭ELISA方法的符合率應用商品化檢測O型口蹄疫病毒血清抗體試劑盒檢測O型口蹄疫陰、陽性血清，共計60份，商品化的試劑盒為荷蘭的PrioCHECK的符合率為96.7％，商品化的試劑盒為韓國的VDproO型口蹄疫抗體檢測試劑盒的符合率為91.7％。符合率＝兩種相互比對的試劑盒檢測結果一致的血清數/待檢血清數×100％。具體見表2。表2.符合率實驗結果表PrioCHECKVDproOO型SPEC陽性份數151117陰性份數454943總計606060O型SPEC符合率96.7％91.7％2.8固相競爭ELISA方法的重復性批內重復：用同一批次制備的多抗、抗原、HRP標記的競爭抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對7份血清樣品(其中陽性血清5份，陰性血清2份)進行獨立檢測，統計檢測結果，計算標準差和變異系數。結果見表3。從表3可以看出，本發明的試劑盒批內重復性好。表3.批內重復實驗結果表批間重復：用三個批次制備的多抗、抗原、HRP標記的競爭抗體及其他同試劑，在相同條件下用所建立的方法對7份血清樣品(其中陽性血清5份，陰性血清2份)進行獨立檢測，統計檢測結果，計算標準差和變異系數，結果見表4，從表4可以看出，批間變異系數小于10％，說明本發明的試劑盒批間重復性好。表4.批間重復結果表盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁1 2 3