用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及使用方法與流程

本發明涉及免疫測定法，具體是一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及使用方法。

背景技術：

前列腺癌是男性泌尿系統最常見的惡性腫瘤，在歐美國家較為常見，是男性最常見的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的第二位。我國是傳統的前列腺癌發病率較低的國家，但是近年來隨著人民生活水平的提高，環境的改變，以及疾病篩查普及率的提高，我國的前列腺癌發病率正在逐年上升。前列腺癌已成為威脅我國男性健康的一種重要疾病，正在受到越來越多的關注和重視。

前列腺癌最重要的治療方式之一就是去勢療法，包括藥物抗雄激素治療以及手術去勢治療，以阻止雄激素結合到雄激素受體上的方式來抑制腫瘤的生長。在前列腺癌早期，去勢治療有較好的效果，但是經過一段時間的治療之后，前列腺癌逐漸轉變為雄激素非依賴性的，對去勢治療不再敏感，病情再度惡化，即去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）階段。去勢抵抗性前列腺癌的發病機制目前尚不清楚，也沒有較好的治療方法，是前列腺癌基礎與臨床領域的難題。

目前對于去勢抵抗性前列腺癌的診斷并沒有很好的方法，主要是依靠監測前列腺特異性抗原和睪酮的變化，以及根據臨床表現來綜合判斷，缺乏較好的特異性，不能準確地判斷出去勢抵抗性前列腺癌。及早地發現去勢抵抗性前列腺癌，對后期治療策略的制定和對前列腺癌更加深入地從分子水平認識，有著非常重要的意義。

技術實現要素：

本發明就是為了解決現有技術中檢測去勢抵抗性前列腺癌的產品或方法特異性差、準確性不高的問題，所提出的一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及使用方法。

本發明是按照以下技術方案實現的。

一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括β-actin抗體，以及雙抗體夾心ELISA法所需的檢測試劑。

一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括包被β-actin抗體的ELISA 酶標板、標準品、標準品&樣品稀釋液、生物素標記的β-actin抗體、親和素標記的辣根過氧化物酶、洗滌液、底物溶液、反應終止液、覆膜中的一種或幾種。

檢測樣本為前列腺癌患者的血清。

一種上述用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

Ⅰ.采集前列腺癌患者全血樣品，離心取上清；

Ⅱ.分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，空白孔加標準品&樣品稀釋液，余孔分別加標準品或待測樣品，混勻；酶標板加覆膜，孵育；

Ⅲ.棄去孔內液體，甩干；每孔加入生物素標記的β-actin抗體，酶標板加覆膜，溫育；

Ⅳ.棄去孔內液體，甩干，洗滌酶標板，再甩干；

Ⅴ.每孔加入親和素標記的辣根過氧化物酶，酶標板加覆膜，溫育；

Ⅵ. 棄去孔內液體，甩干，洗滌酶標板，再甩干；

Ⅶ.每孔加入底物溶液，酶標板加覆膜，避光孵育；

Ⅷ.每孔加入反應終止液；

Ⅸ. 450nm波長下測量各孔的OD值；

Ⅹ.根據標準品的OD值計算血清樣本β-actin的檢測值，并判斷其與判定閾值的大小關系。

所述步驟Ⅰ中全血樣品于室溫放置0~4小時或0~8℃過夜后于500~1500×g離心10~30分鐘。

所述步驟Ⅳ中洗滌酶標板1~5次，每次浸泡1-2分鐘；步驟Ⅵ中洗滌酶標板3~7次，每次浸泡1-2分鐘。

所述步驟Ⅳ中洗滌酶標板3次，每次浸泡1.5分鐘；步驟Ⅵ中洗滌酶標板5次，每次浸泡1.5分鐘。

所述判定閾值為350.98mg/ml~438.88 mg/ml。

所述判定閾值為389.98mg/ml。

本發明獲得了以下有益效果。

本發明有效的解決了現有技術中檢測去勢抵抗性前列腺癌的產品或方法特異性差、準確性不高的問題。本發明試劑盒根據血清中β-actin的含量來診斷去勢抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。本發明試劑盒操作簡單快速、合理可行，可提高去勢抵抗性前列腺癌的診斷效率，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1是本發明非去勢抵抗性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌患者血清中β-actin檢測值的統計學結果圖；

圖2是本發明以血清β-actin水平來診斷去勢抵抗性前列腺癌的ROC曲線圖。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發明做進一步的說明。

一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括β-actin抗體，以及雙抗體夾心ELISA法所需的檢測試劑。

一種用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括包被β-actin抗體的ELISA 酶標板、標準品、標準品&樣品稀釋液、生物素標記的β-actin抗體、親和素標記的辣根過氧化物酶、洗滌液、底物溶液、反應終止液、覆膜中的一種或幾種。

檢測樣本為前列腺癌患者的血清。

一種上述用于檢測去勢抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

Ⅰ.采集前列腺癌患者血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

包被β-actin抗體的ELISA 酶標板：包被抗體的濃度為1～100μg/ml，優選10μg/ml。

標準品：β-actin 10 ng，配制成以下濃度： 10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0ng/mL。

標準品&樣品稀釋液：100ml PBS，加入BSA 2g，至終濃度2%

生物素標記的β-actin抗體：0～100μg/ml，優選10μg/ml。

親和素標記的辣根過氧化物酶：0.0001～0.0005 mg/ml

洗滌液: 0.05%Tween-20 0.5ml加入PBS緩沖液1000ml中。

底物溶液：TMB(四甲基聯苯胺)。

反應終止液：2M H₂SO₄。

Ⅱ.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL，余孔分別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。

Ⅲ. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素標記的β-actin抗體100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。

Ⅳ. 棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。

Ⅴ. 每孔加親和素標記的辣根過氧化物酶，加上覆膜， 37℃溫育 30 分鐘。

Ⅵ. 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟Ⅳ。

Ⅶ. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。

Ⅷ. 每孔加反應終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

Ⅸ. 立即用酶標儀（SPECTRA max plus384）在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。

Ⅹ. 根據標準品的OD值代入方程算出血清樣本β-actin的檢測值，并判斷其與判定閾值的大小關系。

若β-actin檢測值大于等于判定閾值時，則判斷患者已進展為去勢抵抗性前列腺癌，若β-actin檢測值小于判定閾值則判斷患者未進展為去勢抵抗性前列腺癌。以血清中β-actin檢測值為350.98mg/ml~438.88 mg/ml、優選389.98mg/ml為判定閾值。

實施例1

本實施例以β-actin檢測值389.98mg/ml為判斷閾值，若β-actin檢測值大于等于389.98mg/ml時，則判斷患者已進展為去勢抵抗性前列腺癌，若β-actin檢測值小于389.98mg/ml則判斷患者未進展為去勢抵抗性前列腺癌。在本實施例的87例樣本中，使用本發明試劑盒診斷去勢抵抗性前列腺癌的敏感性為72.1%，特異性為93.2%。

本實施例的血清樣本的檢查值繪制在圖1中，兩組比較P<0.05，差別具有統計學意義。

圖2為β-actin作為去勢抵抗性前列腺癌診斷的ROC曲線，橫坐標為1-特異度，縱坐標為靈敏度，AUC=0.884，其中ROC表示曲線下面積。從圖中可以看出，靈敏度達到72.1%，特異度達到93.2%。

可見，采用本發明檢測前列腺癌患者血清中β-actin的含量，可快速準確地診斷去勢抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。