本發明涉及蛋白質絕對定量技術領域，尤其涉及一種非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法。
背景技術：
規模化的蛋白質定量技術主要分為四大類：(1)基于雙向電泳光密度的定量；(2)基于穩定同位素標記與質譜分析的定量；(3)基于質譜分析的無標記定量；(4)基于免疫印跡和蛋白質芯片的定量，近年來質譜多反應監測技術正逐步受到蛋白質組學研究者們關注，成為定量蛋白質組學研究中的重要技術。
但現有技術中，相對定量分析只能比較各組蛋白質之間量的變化，無法確定其真正的蛋白濃度，傳統的蛋白質絕對定量最常用酶聯免疫吸附劑測定其抗體的種類有限且價格昂貴，并非所有蛋白都能進行定量，而且該方法每次只能對一個蛋白進行定量，難以適應蛋白質組學高通量分析的要求，同位素標記法與MRM技術相結合的蛋白質絕對定量需要合成昂貴的同位素標記肽段，應用前提是被選擇作為內標肽段模板的肽段是唯一肽段，且目標蛋白的酶解要充分，對于多個的蛋白標記物驗證需要合成多個標記肽段，其費用也相對較高。
技術實現要素：
基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法。
本發明提出的一種非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優化；首先通過UNIPROT數據庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優化MRM質譜方法；
S2：非同位素標記肽段加入法結合MRM技術的絕對定量新方法建立；(1)標準肽段標準溶液制備：將蛋白的標準肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用30-35％的乙腈、0.1-0.5％的甲酸和70-75％的水溶液溶解配置成為100-110pmol/L的儲備液；(2)血清樣本制備：首先取血清10-15μL，然后加入190-200μL的AgilentBuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心10-15min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心30-40s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1-1.5min，收集濾液，計算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后根據測得溶液的蛋白濃度吸取50-60μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心15-20min，接著加入200-210μL的Urea和100-110μL的DTT，在37-42℃下于混勻儀中攪拌60-70min，接著加入20-25μL的IAA，暗反應30-35min，離心10-15min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37-42℃下酶切過夜，離心10-15min后凍干；3)分析方法驗證；定量標準曲線：首先配制混合標準肽段血清樣品溶液：取10-15pmol/μL的混合同位素標記肽段儲備液和10-15pmol/μL的混合非標記肽段儲備液等體積混合，然后用流動相A稀釋成標準肽段水溶液，接著加入等體積的1-3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標準肽段血清樣品溶液，在標準肽段血清樣品溶液中分別加入100-110fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，然后用建立的MRM-MS方法進行測定；方法精密度：分別配制1-5、10-15和50-55fmol/μL的低中高三種濃度的混合標準肽段血清樣品溶液，然后分別加入50-55fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，用建立的MRM-MS方法進行測定，用內標多肽校正測得的血清中標準多肽的濃度，用外推法血清中標準多肽的濃度，并計算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度；(4)用建立的MRM-MS方法對各樣品進行液相色譜分離和質譜分析,每份樣品均加入三種不同濃度的標準多肽和內標多肽β半乳糖苷酶酶切產物，加入的標準多肽濃度為樣品濃度的1、2、4倍。用內標多肽校正測得的血清中標準多肽的濃度。以測出的各標準多肽濃度匯制一條曲線，曲線外推至橫軸所得濃度即為樣本濃度。
優選地，所述S1中，通過Skyline軟件建立和優化MRM質譜方法的步驟為：(1)多肽選擇初步建立MRM質譜方法；(2)離子對選擇；(3)碰撞能量CE選擇；(4)DP選擇；(5)結合建立優化后的MRM質譜方法，并驗證之。
優選地，所述S2中，(1)標準肽段標準溶液制備：將蛋白的標準肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用31-34％的乙腈、0.2-0.4％的甲酸和71-74％的水溶液溶解配置成為101-109pmol/L的儲備液。
優選地，所述S2中，(2)血清樣本制備：首先取血清11-14μL，然后加入191-199μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心11-14min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心31-39s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1.1-1.4min，收集濾液，計算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后根據測得溶液的蛋白濃度吸取51-59μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心16-19min，接著加入201-209μL的Urea和101-109μL的DTT，在38-41℃下于混勻儀中攪拌61-69min，接著加入21-24μL的IAA，暗反應31-34min，離心11-14min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在38-41℃下酶切過夜，離心11-14min后凍干。
本發明中，該非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法能夠利用高靈敏度質譜進行目標蛋白的特異性選擇而不需進行特異性抗體的合成，簡便、經濟、選擇性好、準確度高，能有效地去除基質的干擾。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步解說。
實施例一
本實施例提出的一種非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優化；首先通過UNIPROT數據庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優化MRM質譜方法；
S2：非同位素標記肽段加入法結合MRM技術的絕對定量新方法建立；(1)標準肽段標準溶液制備：將蛋白的標準肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用30％的乙腈、0.1％的甲酸和70％的水溶液溶解配置成為100pmol/L的儲備液；(2)血清樣本制備：首先取血清10μL，然后加入190μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心10min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心30s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1min，收集濾液，計算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后根據測得溶液的蛋白濃度吸取50μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心15min，接著加入200μL的Urea和100μL的DTT，在37℃下于混勻儀中攪拌60min，接著加入20μL的IAA，暗反應30min，離心10min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37℃下酶切過夜，離心10min后凍干；(3)進行液相色譜分離和質譜分析；(4)分析方法驗證；定量標準曲線：首先配制混合標準肽段血清樣品溶液：取10pmol/μL的混合同位素標記肽段儲備液和10pmol/μL的混合非標記肽段儲備液等體積混合，然后用流動相A稀釋成標準肽段水溶液，接著加入等體積的1μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標準肽段血清樣品溶液，在標準肽段血清樣品溶液中分別加入100fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，然后用建立的MRM-MS方法進行測定；方法精密度：分別配制1、10和50fmol/μL的低中高三種濃度的混合標準肽段血清樣品溶液，然后分別加入50fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，用建立的MRM-MS方法進行測定，計算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
實施例二
本實施例提出的一種非同位素標記肽段加入法結合MRM的蛋白質定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優化；首先通過UNIPROT數據庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優化MRM質譜方法；
S2：非同位素標記肽段加入法結合MRM技術的絕對定量新方法建立；(1)標準肽段標準溶液制備：將蛋白的標準肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用35％的乙腈、0.5％的甲酸和75％的水溶液溶解配置成為110pmol/L的儲備液；(2)血清樣本制備：首先取血清15μL，然后加入200μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心15min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心40s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1.5min，收集濾液，計算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后根據測得溶液的蛋白濃度吸取60μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心20min，接著加入210μL的Urea和110μL的DTT，在42℃下于混勻儀中攪拌70min，接著加入25μL的IAA，暗反應35min，離心15min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在42℃下酶切過夜，離心15min后凍干；(3)進行液相色譜分離和質譜分析；(4)分析方法驗證；定量標準曲線：首先配制混合標準肽段血清樣品溶液：取15pmol/μL的混合同位素標記肽段儲備液和15pmol/μL的混合非標記肽段儲備液等體積混合，然后用流動相A稀釋成標準肽段水溶液，接著加入等體積的3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標準肽段血清樣品溶液，在標準肽段血清樣品溶液中分別加入110fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，然后用建立的MRM-MS方法進行測定；方法精密度：分別配制5、15和55fmol/μL的低中高三種濃度的混合標準肽段血清樣品溶液，然后分別加入55fmol的β半乳糖苷酶酶切產物作為內標多肽，用建立的MRM-MS方法進行測定，用內標多肽校正測得的血清中標準多肽的濃度，用外推法血清中標準多肽的濃度，并計算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。