一種不同親和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等離激元光學親和夾心分析中的應用的制作方法

本發明屬于生化分析、功能化材料、親和識別和光譜檢測領域，具體涉及一種不同親和配基功能化的金基萃取材料及其在表面等離激元光學親和夾心分析中的應用。

背景技術：

生命科學研究及臨床診斷等領域中經常面臨對復雜生物樣品的分析。生物樣品的組成復雜，結構類似物大量存在，目標分析物的濃度通常極低，而樣品基體干擾嚴重，這些因素為生命分析化學提出了重要的挑戰。復雜生物樣品分析中面臨兩個關鍵問題：一、目標物的專一富集，二、高靈敏檢測。免疫分析，尤其是酶聯免疫分析，是目前最常見的復雜樣品分析手段。該方法采用抗體對目標物進行專一富集，采用化學發光、熒光和放射性同位素檢測等實現高靈敏檢測。但是，通常的免疫分析法存在著分析時間長、樣品需要量大和容易受工作環境和樣品環境干擾等缺點，而且不適用于單細胞和活體動物分析。此外，通常的免疫分析法采用抗體和酶等生物分子實現專一識別和信號放大等作用，而這些生物分子的穩定性較差、價格昂貴，不僅對分析結果的可靠性存在影響而且使得分析成本較高。因此，能克服常規免疫分析法的弊端且能適用更寬樣品范圍的新穎分析方法將具有重要的價值和應用前景。

隨著分子識別、功能化材料和光學檢測等領域的發展，各種各樣的可應用于復雜生物樣品的新穎分析方法不斷出現。一方面，分子印跡聚合物(MIP)[G.Wulff，A.Sarhan，Angew.Chem.Int.Ed.《應用化學》1972，11，341-345；G.Vlatakis，L.I.Andersson，R.Müller，K.Mosbach，Nature《自然》1993，361，645-647]和核酸適配體[A.B.Iliuk，L.H.Hu，W.A.Tao，Anal.Chem.《分析化學》2011，83，4440-4452]等能專一識別特定化合物的材料和分子逐漸發展成為抗體的重要補充和替代。另一方面，表面等離激元光學[N.P.W.Pieczonka，R.F.Aroca，RF.Chem.Soc.Rev.《化學學會評論》37，946-954]等新興的檢測手段無需酶反應和聚合酶鏈式反應等步驟繁瑣的信號放大方式，可以實現單分子水平的超高檢測靈敏度。 我們已經利用分子印跡聚合物和表面增強拉曼散射(SERS)構建了免酶、免抗體的新穎免疫分析法，成功應用于人血清中痕量的糖蛋白疾病標志物的檢測(劉震，葉金，一種基于分子印跡技術和拉曼光譜的快速，高靈敏度，專一識別糖蛋白的檢測方法的應用，中國發明專利，申請號201410255065.0，申請日期：2014年6月11日)。但該方法的檢測限為10^-12摩爾/升，不能勝任濃度更低的樣品，同時也不能應用于單細胞和活體動物分析。

細胞是生命體結構和生命活動的基本單位。基于細胞的研究是生命科學研究的基礎。通常的生命科學研究主要以大量細胞為研究對象。但是，由于同種細胞的不同個體間存在著顯著的微觀不均一性，基于大量細胞的實驗結果難以精準反映生命活動的本質和規律。基于單細胞的生命科學研究將能在更深的層次上揭示生命活動的本質和規律，為探究重大疾病的起因、發展和治療提供更可靠的科學依據。2015年，美國政府推出“精準醫學計劃”。精準診斷是精準醫學的關鍵，而精準診斷離不開單細胞分析技術。活體單細胞分析技術在很多應用領域中是至關重要的，如神經科學、干細胞生物學、發育生物學、癌癥診斷和個性化藥物篩選等等。然而，活體單細胞分析技術面臨著巨大的挑戰。哺乳動物細胞一般較小(直徑通常為10-30微米)，體積為10^-13-10^-11升，所測組分含量常在10^-18-10^-15摩爾水平，有時甚至低至10^-21摩爾，一些對細胞起關鍵作用的生物分子的含量更低，使得檢測與分析變得非常困難。另一方面，活體單細胞分析要求細胞在分析后仍保持存活，目前的大多數的單細胞分析技術均難以勝任。已有的單細胞分析技術主要分為以下六類：一、微分離技術，二、微流控芯片，三、光學成像，四、質譜分析，五、流式細胞術，六、單細胞測序。這些技術中，目前只有基于激光誘導熒光檢測的微分離技術、微流控芯片和光學成像分析能適用于單細胞中低拷貝數(拷貝數≤1000/細胞)蛋白質的分析，但是這些分析技術在進行單細胞分析時，要么需要將被測細胞進行破碎，要么需要在細胞內引入標記試劑從而很難保證細胞的內部組成和狀態不受影響。

活體動物分析是生命科學研究的重要研究手段之一。在活體層面原位地獲取與生物功能和疾病相關的生物/化學信息，對于準確地闡述疾病發生發展的規律和機制以及實現疾病的早期診斷與治療等具有十分重要的意義。目前用于活體動物分析的主要有以下幾類：一、活體動物成像分析技術，二、選擇性光、電、生 物傳感技術，三、基于活體取樣的聯用分析技術。這些方法通常需要使用體積較大或結構較復雜的儀器設備，主要用于實驗室內的分析，難以應用于床旁檢測和現場分析。

技術實現要素：

針對活體單細胞、活體動物、血液、尿液等復雜樣品體系中痕量組分分析存在的樣品前處理與檢測方法瓶頸問題，本發明的目的在于提供一種不同親和配基功能化的金基萃取材料以及基于該金基萃取材料的表面等離激元光學親和夾心分析法，利用該萃取材料及方法在活體單細胞、活體動物、血清、尿液中的蛋白質、核酸和糖類等生物分子分析檢測中的應用，以及在其它具有重要檢測意義的可通過金基萃取材料萃取識別的化合物中的應用。

該技術包括萃取材料(含萃取陣列和萃取探針)和納米拉曼探針的制備。萃取材料、目標分析物和納米拉曼探針間通過免疫或親和作用形成三明治型復合物。萃取材料和納米拉曼探針表面的抗體、核酸或人工抗體的專一性、表面等離激元光學的高靈敏度使得該方法可以實現對復雜環境中痕量分析物進行快速識別和專一性檢測。

為了解決發明內容中的技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種不同親和配基功能化的金基萃取材料，包括萃取材料，在萃取材料的表面修飾有金薄層形成基礎萃取材料，在基礎萃取材料的表面修飾有抗體、分子印跡聚合物或核酸等親和識別配基或材料。金基萃取材料能專一識別待測化合物，且在激光照射下能產生表面等離子波，該表面等離子波能顯著增強標記到萃取材料表面的銀基納米拉曼探針的表面增強拉曼散射信號。

萃取材料形式主要有萃取探針和萃取陣列兩種形式。萃取探針分為微探針和一般探針兩種。

上述不同親和配基功能化萃取材料的制備方法，所述萃取材料的表面通過化學還原的方法修飾有金薄層，還原溫度為35-55℃，還原時間為4-5小時，得到修飾有金薄層的萃取材料為基礎萃取材料，然后在基礎萃取材料的表面修飾分子印跡聚合物(MIP)、抗體、核酸或者硼酸等具有識別特定目標分析物作用的親和配基。

所述的不同親和配基功能化的金基萃取材料在表面等離激元光學和親和夾 心分析中的應用。

該應用又稱為表面等離激元光學親和夾心分析法，原理及特征如下：利用上述不同親和配基功能化的金基萃取材料直接從待測樣品中萃取特定的目標分析物，隨后與修飾了能識別所述目標分析物的親和配基的銀基納米拉曼探針溫育，從而形成萃取材料-目標分析物-拉曼探針三明治型復合物結構，再當激光光束照射在所述三明治型復合物結構表面時會發生表面等離激元光學效應，銀基拉曼探針產生表面增強拉曼散射，金基萃取材料產生表面等離子波，該表面等離子波進一步增強銀基拉曼探針的表面增強拉曼散射信號，從而大大增強檢測靈敏度，檢測限可達單分子水平。通過檢測拉曼信號即可測定待測復雜樣品中目標分析物的含量。根據分析樣品的不同，該技術包含活體單細胞分析、活體動物分析、免疫生化分析和植物分析等亞技術。

所述不同親和配基功能化的銀基納米拉曼探針是由能有效增強拉曼信號的銀納米粒子、拉曼活性分子以及能識別目標分析物的親和配基組成。具體結構為：所述的不同親和配基功能化的銀基納米拉曼探針的內核為銀納米顆粒，所述納米拉曼探針的表面修飾了具有拉曼活性分子并用不同的親和配基(抗體、核酸、硼酸等)進一步修飾，該納米拉曼探針能專一識別目標化合物，并能產生顯著的表面增強拉曼散射信號。

上述銀基納米拉曼探針制備方法為：以檸檬酸鈉還原AgNO₃形成的粒徑一般為30-100nm的銀納米粒子為納米拉曼探針的核，在銀核的表面修飾一層具有拉曼增強作用的報告分子與能對萃取出的目標分析物具有識別作用的親和配基。

所述表面等離激元光學親和夾心分析法中，萃取材料萃取時間為2-30分鐘；納米拉曼探針的溫育時間為2-30分鐘。

該發明所述的待測樣品，不僅包括活體單細胞、活體動物、血清、尿液，還包括其它具有重要檢測意義的可通過親和夾心法識別的化合物，例如食品、果蔬、植物、中成藥等典型的復雜待測樣品。

該發明所述的目標分析物，不僅包括蛋白質(糖蛋白、非糖蛋白)、核酸(DNA、RNA)、糖類等生物分子，還包括其它類型的具有重要檢測意義的痕量組分分子，例如蔬菜瓜果的農殘組分、食品中的摻雜組分、植物中的活性成分等。

本發明中，通過雙抗體或人工抗體的使用，以確保檢測的高專一性。由于常 規抗體制備困難、穩定性差且價格昂貴，因此，本發明中采用人工抗體(分子印跡聚合物)替代常規抗體。分子印跡技術作為一種既能模擬抗體又能克服抗體缺陷的方法逐漸發展起來。分子印跡技術是先將模板分子與功能單體按一定比例形成配合物，再加入交聯劑形成聚合物從而將模板分子固定并包裹在聚合物中，然后采用合適的方法將模板分子去除，從而在聚合物中留下形狀與模板分子互補的空腔及選擇性的結合位點。分子印跡技術具有以下優點：一、預定性，可以根據使用目的的不同而制備不同的分子印跡聚合物；二、專一性，能專一地識別模板分子，與模板分子間形成類似于抗體與抗原間的相互作用(分子印跡聚合物因此被稱為“塑料抗體”或“人工抗體”)；三、實用性，分子印跡聚合物可以通過化學合成大規模制備，價格低廉，而且適用于各種反應條件、穩定性高、使用壽命長。近年來，劉震等在分子印跡技術方面取得了重要的進展，發展了一系列硼親和分子印跡仿生材料作為抗體的替代品[劉震，李澧，一種專一結合指定糖蛋白的分子印跡聚合物及其制法和應用。中國發明專利，專利號：2011104161988，授權日期：2014.01.08；劉震，王雙壽，畢曉東，一種可控、通用的定向表面印跡方法以及所得分子印跡聚合物生物應用。中國發明專利，申請號：201310339600.6；Xiaodong Bi，Zhen Liu，Anal.Chem.《分析化學》2014，86，12382-12389；Zijun Bie，Yang Chen，Jin Ye，Shuangshou Wang，Zhen Liu，Angew.Chem.Int.Ed.《德國應用化學》2015，54，1-6]，不但很好地保留了類似于抗體的專一性與結合力，同時比抗體穩定、廉價。本發明中所述人工抗體是指通過硼親和可控定向表面印跡法[S.S.Wang，J.Ye，Z.J.Bie，Z.Liu，Chem.Sci.《化學科學》2014，5，1135-1140；X.D.Bi，Z.Liu，Anal.Chem.《分析化學》2014，86，959-966]制備而成的分子印跡聚合物。

本發明金基萃取材料的可應用性已從以下幾個方面得到實驗證實：第一、活體單細胞分析。已經成功檢測到單個活細胞中低拷貝數的目標蛋白質和核酸，根據蛋白質或核酸癌癥標志物表達量的差異，可以區分正常細胞和癌細胞。該技術可以應用于單細胞質量分析、單細胞疾病標志物分析，以及單細胞生化研究。第二、活體動物分析。已經實現活體動物中的癌癥標志物蛋白質和核酸的檢測和表達差異分析。該技術可以用活體動物疾病標志物檢測，以及基于活體動物的生化及醫學研究。第三、免疫生化分析。已經實現了血清中的疾病標志物堿性磷酸酶 的專一靈敏檢測。常規的免疫分析采用抗體識別目標蛋白質，而本技術除抗體外，還可以通過分子印跡聚合物或核酸對目標蛋白實現專一識別。常規的免疫分析采用紫外-可見光吸收、熒光或化學發光等方式檢測，存在著分析步驟長和易受樣品及工作環境的影響等不利因素，而本技術采用表面等離增強拉曼散射檢測，可克服這些不利因素，而且具有靈敏度高的優點。該技術可以用于基于血液、尿液等復雜生化樣品的分析。第四、體育運動興奮劑檢測。體育運動中的很多違禁藥品在檢測時的濃度極低，是對檢測方法的嚴重挑戰。利用本方法，實現了人體尿樣中人促紅細胞生成素的快速、專一、靈敏檢測。可以擴展到其他蛋白質興奮劑的檢測。第五、蘋果等水果內單糖等糖類化合物的分析。該技術與便攜式拉曼光譜儀結合，可以用于床旁檢測和現場分析。

在免疫生化分析方面的應用，萃取陣列可專一萃取和富集添加到其表面的血液、尿液等生化樣品中的目標化合物，萃取陣列經標記后，通過讀取探針表面的拉曼信號測定目標物的含量。該技術可以用于血液、尿液等生化樣品中的疾病標志物的分析，還可以用于體育運動中興奮劑的檢測。

在所述的植物分析方面，萃取探針可直接插入到植物的果實、根、莖、葉等部位，其表面修飾的親和識別材料或配基能高效地萃取和富集待測部位內的目標化合物，萃取探針經標記后，通過讀取探針表面的拉曼信號測定目標物的含量。該技術可以應用于果蔬農藥殘留檢測、植物活性成分分析和相關研究等領域。

有益效果：本發明首次描述了一種基于親和萃取和表面等離激元光學的高專一性、高靈敏度的快速親和夾心法及相關材料(適用于活體單細胞、活體動物、復雜待測樣品中痕量目標分析物檢測分析的萃取材料和納米拉曼探針)的制備技術。與其它分析技術相比，該方法具有以下顯著優點：第一、使用了抗體、核酸、人工抗體以及對應的二抗或親和配基雙重識別特定分析物分子，方法特異性很強；第二、采用獨特的金屬微、納探針組合獲得特殊的表面等離激元光學效應，極大地放大了拉曼光譜信號，檢測限達單分子水平，可檢測到活體單細胞、活體動物、復雜樣品中極低濃度的特定分析物分子(蛋白、核酸、糖類等)；第三、該方法的分析速度快，從特定分析物的萃取到最終信號的讀取，僅需要5-60分鐘；第四、該分析方法對活體單細胞、活體動物的損傷極小，進行分析后單細胞和動物仍存活。該方法可應用于基于單細胞和活體動物的疾病標志物分析，藥物 篩選以及基于活體動物分析的相關研究，細胞質量控制分析、個性化藥物篩選和基于活體單細胞分析的相關應用，血液、尿液等中的疾病標志物或違禁成分的分析；第五、該技術可以用于床旁檢測和現場分析。

本發明提出了一種基于親和微萃取及表面等離激元光學檢測的高專一性、高靈敏度、分析速度快的表面等離激元親和夾心法。該方法利用抗體、分子印跡聚合物和核酸等作為親和配基，可實現從活體單細胞和活體動物等復雜樣品體系中的痕量目標化合物的高專一性萃取。該方法采用新穎的表面等離激元光學檢測，檢測靈敏度達到單分子檢測水平，可以檢測活體單細胞及活體動物中低拷貝數的蛋白質以及血清等復雜樣品中的痕量蛋白質、核酸或糖類等物質。現有的表面等離激元光學檢測技術需要使用粗糙的表面和特殊的納米結構，不適用于對活體單細胞和活體動物的活體萃取。而能適用于活體單細胞和活體動物的活體萃取需要表面光滑的微萃取探針，不利于高靈敏度的獲得。為了解決該問題，本技術創造性地利用光滑的金基微萃取探針與銀基納米拉曼探針相結合，利用金基萃取材料產生的表面等離子波增強銀基納米拉曼探針的表面增強拉曼散射信號(表面等離增強拉曼散射，PERS)，從而達到高靈敏度檢測和活體萃取的和諧與統一。為了達到技術的通用性，本發明采用抗體、分子印跡聚合物和核酸等作為親和萃取配基，適用的目標分析物包括(但不限于)蛋白、micro RNA和糖類化合物。

附圖說明

圖1為本發明中親和萃取材料用于表面等離激元光學親和夾心分析法的原理示意圖。

圖2為本發明中不同形式的萃取材料表征及其在不同分析對象中的應用。圖2a為適用于活體單細胞分析的微萃取探針外觀表征圖；圖2b為微萃取探針插入活體單細胞中萃取特定目標分析物的靜態顯微圖片；圖2c為適用于活體動物分析的微萃取探針外觀表征圖；圖2d為微萃取探針插入活體動物體中特定部位萃取目標分析物的照片；圖2e為適用于血清、尿液等臨床復雜樣品的微萃取陣列，其中，左圖為未萃取樣品前的陣列外觀表征圖，右圖為萃取樣品后的陣列外觀圖。

圖3為本發明中納米拉曼探針掃面電鏡表征圖，其中，圖3a為適用于分子 印跡聚合物功能化萃取材料的納米拉曼探針；圖3b為適用于抗體功能化萃取材料的納米拉曼探針；圖3c為適用于核酸功能化萃取材料的納米拉曼探針。

圖4為不同材質萃取材料、納米拉曼探針組合的拉曼信號強度柱狀圖。

圖5為用于不同分析對象的萃取材料的干擾性實驗。其中，圖5a為分子印跡聚合物萃取材料的干擾性實驗，干擾物質分別為：牛血清白蛋白(BSA)、轉鐵蛋白(TRF)、辣根過氧化物酶(HRP)、果糖(Fru)及葡萄糖(Glu)，濃度均為1mg/mL，干擾物濃度為目標蛋白堿性磷酸酶(ALP)(1500U/L，5.95×10^-9M)濃度的3300倍；圖5b為抗體功能化萃取材料的干擾性實驗，干擾物質分別為：牛血清白蛋白、轉鐵蛋白、辣根過氧化物酶、果糖及葡萄糖，濃度均為1mg/mL，約為目標蛋白survivin(100ng/mL)的10000倍；圖5c為核酸修飾的萃取材料的干擾性實驗，干擾物質分別為：單堿基錯配序列(miR-21A)、雙堿基錯配序列(miR-21B)以及四堿基錯配序列(miR-21C和miR-21D)。

圖6為不同類型萃取材料對不同濃度目標分析物的相應曲線。其中，圖6a為ALP印跡萃取材料檢測ALP的信號強度與濃度的關系；圖6b為anti-survivin功能化萃取材料檢測survivin的信號強度與濃度的關系；圖6c為核酸功能化材料檢測microRNA的信號強度與濃度的關系。

圖7為本發明中不同親和配基功能化萃取材料在活體單細胞中的分析應用。圖7a為萃取微探針插入單個細胞中的示意圖；圖7b為ALP印跡聚合物萃取微探針對HeLa細胞中的ALP進行萃取后，經納米拉曼探針標記之后，從針尖開始進行掃描得到的拉曼信號分布情況；圖7c和圖7d，分子印跡聚合物萃取微探針對正常細胞(L-02)、肝癌細胞(HepG-2)、海拉細胞(HeLa)和乳腺癌細胞(MCF-7)中堿性磷酸酶(ALP)的分析結果及數據統計結果；圖7e和圖7f，抗體功能化的微探針在正常細胞(L-02)、肝癌細胞(HepG-2)、海拉細胞(HeLa)、乳腺癌細胞(MCF-7)中對survivin蛋白的分析結果及數據統計結果。

圖8為本發明中不同親和配基功能化萃取材料用于活體單細胞檢測分析中，ALP印跡微探針在不同細胞系的不同單個細胞中檢測ALP的拉曼光譜圖。圖8a，正常肝細胞(L-02)；圖8b，肝癌細胞(HepG-2)；圖8c，海拉(HeLa)細胞；圖8d，乳腺癌細胞(MCF-7)。

圖9為本發明中不同親和配基功能化萃取材料用于活體單細胞檢測分析 中，anti-survivin抗體功能化的微探針在不同細胞系中不同單個細胞檢測survivin蛋白的拉曼光譜圖。圖9a，正常肝細胞(L-02)；圖9b，肝癌細胞(HepG-2)；圖9c，海拉(HeLa)細胞；圖9d，乳腺癌細胞(MCF-7)。

圖10為萃取探針在活體小動物中的應用。其中圖10a為anti-survivin抗體功能化的微探針對正常裸鼠、腋下種植了HepG-2細胞、乳腺癌細胞(MCF-7)、海拉細胞(HeLa)和胃癌細胞(MGC-803)的裸鼠腫瘤部位中survivin蛋白的檢測；圖10b為用anti-survivin抗體功能化的微探針檢測上述組織中survivin蛋白后的平均拉曼信號強度；圖10c為ALP印跡微探針對正常裸鼠、腋下種植了HepG-2細胞、乳腺癌細胞(MCF-7)、海拉細胞(HeLa)和胃癌細胞(MGC-803)的裸鼠腫瘤部位中ALP的檢測；圖10d表示用ALP印跡微探針檢測上述組織中ALP后的平均拉曼信號強度。

圖11為本發明中采用不同親和配基功能化萃取材料檢測種植了不同腫瘤的裸鼠的腫瘤部位中ALP的拉曼光譜圖。圖11a，正常裸鼠；圖11b，種植了HepG-2細胞的裸鼠；圖11c，種植了MCF-7細胞的裸鼠；圖11d，種植了HeLa細胞的裸鼠；圖11e，種植了MGC-803細胞的裸鼠。

圖12為本發明中采用不同親和配基功能化萃取材料檢測種植了不同腫瘤的裸鼠的腫瘤部位中survivin蛋白的拉曼光譜圖。圖12a，正常裸鼠；圖12b，種植了HepG-2細胞的裸鼠；圖12c，種植了MCF-7細胞的裸鼠；圖12d，種植了HeLa細胞的裸鼠；圖12e，種植了MGC-803細胞的裸鼠。

圖13為本發明中采用不同親和配基功能化萃取材料在血清樣品中的檢測分析。其中，圖13a為ALP印跡的微萃取陣列對血清樣品中ALP以及標準加入法檢測的拉曼信號柱狀圖；圖13b為相應的拉曼光譜圖。

圖14為本發明中采用不同親和配基功能化萃取材料分析人尿及加標人尿樣品中的人促紅細胞生成素(EPO)。其中，圖14a為EPO印跡的微萃取陣列對人尿及加標人尿樣品中EPO進行分析的拉曼光譜圖；圖14b為EPO印跡的微萃取陣列對人尿及加標人尿樣品中EPO進行分析的拉曼信號柱狀圖。

圖15為本發明中不同親和配基功能化萃取材料用于正常乳腺細胞(MCF-10A)和乳腺癌細胞(MCF-7)的不同活體單細胞中microRNA-21分析的信號強度比較。

圖16為本發明中不同親和配基功能化萃取材料用于不同細胞系中microRNA-21檢測的拉曼光譜圖，其中16a為海拉(HeLa)細胞系中不同個體活體單細胞中microRNA-21檢測的拉曼光譜圖；圖16b為MCF-7細胞系中不同個體活體單細胞中microRNA-21檢測的拉曼光譜圖。

圖17為本發明中采用不同親和配基功能化萃取材料分析蘋果中果糖的分布。其中，圖17a為果糖印跡的萃取探針插入蘋果中的縱剖面示意圖；圖17b為果糖印跡的萃取探針對蘋果中果糖進行萃取后，經過納米拉曼探針標記之后，將萃取探針置于拉曼光譜儀中，從針尖開始掃描得到的拉曼信號分布圖譜。

具體實施方式

下面通過圖1以及具體實施例來進一步闡明本發明基于表面等離激元光學的高專一性、高靈敏度快速親和夾心法，應該說明的是，下面的實施例不以任何形式限定本發明，凡是用等同替換或等效方式所獲得的技術方案，均在本發明的保護范圍之內。

如圖1所示，該方法的工作原理為：利用不同親和配基(不同親和配基包括MIP、抗體、核酸、硼酸等)功能化的金基萃取材料直接從復雜待測樣品中萃取特定的痕量目標分析物，專一性萃取至微萃取材料表面，清洗除去非特異吸附的干擾物后，將修飾了能識別該目標分析物的親和配基(能識別該目標分析物的親和配基包括二抗、核酸、硼酸等)的銀基納米拉曼探針溫育，即銀基納米拉曼探針對目標分析物進行標記；清洗除去過量的納米拉曼探針后，從而形成萃取材料-特定目標分析物-拉曼探針三明治型復合物結構，當激光光束照射在三明治結構表面時會發生表面等離激元光學效應，極大地增強拉曼探針的拉曼光譜信號，通過檢測放大后的拉曼信號即可檢測待測復雜樣品中目標分析物的濃度。

為了適用于活體單細胞、活體動物及血清、尿液等復雜待測樣品，萃取材料的形式分為萃取陣列和萃取微探針兩種形式。微探針的尖端直徑一般為0.5-3微米，由玻璃棒、玻璃管或金屬絲拉制后經后續化學處理而成，主要用于活體單細胞的萃取。一般探針的尖端直徑一般為100-400微米，可直接用中醫針灸針或 由金屬絲拉制后經后續化學處理而成，主要用于活體動物萃取，也可用于植物果實、根莖、葉片等的萃取。萃取陣列由尺寸合適的玻璃片、塑料片或金屬片等二維基片經后續化學處理而成，也可設計為與酶標儀等高通量讀取儀聯用的高通量陣列或孔板形狀，主要用于血液、尿液等樣品的萃取和富集。

實施例1：萃取材料與納米拉曼探針材質的考察

萃取材料的材質和納米拉曼探針的材質對拉曼信號有很大的影響，金、銀是常用的兩種貴金屬，因此用這兩種金屬分別作為萃取材料和拉曼探針，選擇拉曼信號最強的一種金屬組合。

不同材質萃取材料的制備：將直徑為0.2mm的金絲、銀絲剪切成長度約為0.5cm的小段分別作為兩種材質的抓取基底，將小段的金絲、銀絲分別浸入150μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，150uL二次純水和3.7mL無水乙醇的混合溶液中，室溫反應12小時，使得金絲、銀絲的表面修飾上氨基，然后用乙醇清洗兩次，再將表面已經修飾上氨基的金絲、銀絲分別浸入10mg/mL醛基苯硼酸甲醇溶液中，室溫反應24小時，最后分別用純水、無水乙醇清洗兩次，40℃真空干燥。

不同材質納米拉曼探針的制備[制備方法參見但不限于以下文獻Yu-Ju Liao，Yen-Chun Shiang，Chih-Ching Huang and Huan-Tsung Chang，Langmuir，《蘭格繆爾》2012，28，8944-8951；p.c.1ee，d.mesel，J.Phys.Chem.《物理化學雜志》1982，86，3391-3395]：合成粒徑約為60nm的金、銀納米粒子，取金、銀納米粒子溶液各1mL，分別往金、銀納米粒子溶液中加入1mM巰基苯硼酸溶液8μL，室溫下反應1小時。

以1mg/mL葡萄糖標準溶液為樣品，將兩種材質的硼酸功能化的萃取材料分別浸入其中，萃取30分鐘，取出萃取探針后用pH 8.5的磷酸鹽緩沖溶液清洗兩次，然后浸入納米拉曼探針溶液中標記2分鐘，標記后再用pH 8.5的磷酸鹽緩沖溶清洗兩次，將萃取材料置于拉曼顯微鏡下進行檢測。結果如圖4示，當以金為萃取材料，銀納米粒子為納米拉曼探針，檢測葡萄糖時的拉曼信號明顯強于其它組合，和常規的SERS檢測比較(金、銀基的納米拉曼探針在玻璃表面檢測)，信號強度增強20-40倍。

實施例2：基礎萃取材料的制備

基礎萃取材料采用酸還原反應制備。將不同形式的萃取材料(萃取材料包括玻璃棒、玻璃毛細管、針灸針、金屬針、金屬絲、玻璃片等)浸入含氯金酸12mM，碳酸氫鉀0.5M和葡萄糖25mM的混合溶液中，35-55℃還原4-5小時，萃取材料的表面修飾上一層金薄層，即得到所述基礎萃取材料。將得到的基礎萃取材料在100℃的真空條件下干燥12小時，最后放在室溫下儲存備用。基礎萃取材料的整體外觀形貌如圖2a，2c和2e左圖所示。

實施例3：硼酸功能化萃取材料的制備

將實施例2中制備的基礎萃取材料浸入3mL由3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、二次純水和無水乙醇按照體積比5∶5∶9組成的混合溶液中，室溫下反應12小時，反應完畢后用無水乙醇洗滌3-5次除去未反應的試劑。由此得到氨基功能化的萃取材料。

將上述制備的氨基功能化萃取材料浸入40mL含10mg/mL 4-甲酰基苯硼酸和1％(w/w)氰基硼氫化鈉的甲醇混合溶液中，室溫下反應24小時，反應完畢后分別用二次純水、無水乙醇洗滌3-5次除去未反應的試劑，隨后在40℃真空干燥12小時，由此得到硼酸功能化的萃取材料。

實施例4：人工抗體功能化萃取材料的制備

人工抗體功能化的萃取材料采用硼親和可控定向表面印跡法[S.S.Wang，J.Ye，Z.J.Bie，Z.Liu，Chem.Sci.《化學科學》2014，5，1135-1140；X.D.Bi，Z.Liu，Anal.Chem.《分析化學》2014，86，959-966]制備而成。

以ALP作為模板分子為例，制備步驟如下：

將實施例3中制備得到的硼酸功能化的萃取材料浸入1mL ALP樣品溶液(該樣品溶液是由ALP溶于50mM，pH 9.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中制得，其中ALP濃度為150000U/L)，室溫反應20分鐘后，用不含ALP的50mM，pH 9.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液清洗3-5次，這樣就制得了結合了ALP的萃取材料。然后將固定有ALP模板的萃取材料浸入1mL預聚液中，室溫反應1小時，反應結 束后將萃取材料從預聚液中取出，依次用去離子水、體積濃度為1％的醋酸溶液、去離子水清洗，制備好的印跡涂層4℃下保存備用。其中預聚液由多巴胺、3-氨基苯硼酸(APBA)和過硫酸銨(APS)溶于0.1M，pH 8.5磷酸鹽緩沖溶液制得，濃度分別為2.0，1.6和1.2mg/mL。

此外，制備修飾了非印跡涂層的萃取材料作為對照，以說明分子印跡萃取材料的識別性能。非印跡涂層的制備除了沒有添加模板以外，其他步驟相同。

實施例5：抗體功能化萃取材料的制備

以anti-survivin抗體為例，制備步驟如下：

將實施例2中制備得到的基礎材料浸入1mg/mL 11-巰基十一酸的乙醇溶液中，室溫反應12小時，使得基礎材料表面修飾上羧基，然后用無水乙醇清洗兩次，40℃真空干燥12小時。將表面修飾上羧基的萃取材料浸入1mL體積比為1∶1的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)混合溶液中(分別為100mM和25mM)10分鐘，取出萃取材料后用pH 4.5的磷酸鹽緩沖液清洗兩次。然后將萃取材料置于1mL濃度為23μg/mL的anti-survivin單克隆抗體溶液中，室溫反應2小時，取出萃取材料后用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗兩次，然后浸入1mL 2.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中封閉2小時，以減少表面的非特異性吸附。最后用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫晾干，置于4℃下貯存備用。

實施例6：核酸功能化萃取材料的制備

以microRNA-21為例，制備步驟如下：

將實施例2中制備得到的基礎萃取材料浸入30μL，濃度為10μM的3’端修飾氨基的寡核苷酸序列(3’AUCGAAUAGU)溶液中室溫下反應1-3小時，取出反應后的萃取材料，用磷酸鹽緩沖溶液(10mM，pH 7.4)清洗兩次，室溫晾干，儲存在4℃冰箱中備用。

實施例7：硼酸功能化納米拉曼探針的制備

首先制備銀納米粒子[制備方法參見但不限于以下文獻Yu-Ju Liao， Yen-Chun Shiang，Chih-Ching Huang and Huan-Tsung Chang，Langmuir，《蘭格繆爾》2012，28，8944-8951；P.C.Lee，D.Mesel，J.Phys.Chem.《物理化學雜志》1982，86，3391-3395]，具體制備步驟如下：

利用檸檬酸鈉還原硝酸銀的方法合成粒徑約30-100nm左右的銀納米粒子，具體為，將36mg硝酸銀溶解于200mL水中，攪拌加熱至沸騰，快速加入新配制的檸檬酸鈉溶液(1％，4mL)，繼續加熱攪拌大約1小時，然后自然冷卻到室溫，4℃儲存備用。

硼酸功能化銀納米粒子的制備：

取8μL 4-巰基苯硼酸(1mM，溶解于0.2M NaOH溶液)分別加入到1mL銀納米粒子溶液中，室溫下攪拌反應60分鐘，即得到硼酸功能化的銀納米粒子。

實施例8：抗體功能化納米拉曼探針的制備

以anti-survivin抗體為例，具體步驟如下：

步驟1)，4-巰基苯胺(PATP)功能化銀納米粒子的合成

取合成好的粒徑約為60nm的銀納米粒子10mL，往銀納米粒子溶液中加入20uL濃度為1mM的PATP乙醇溶液，室溫下磁力攪拌反應1小時，然后加入四乙氧基硅烷溶液(TEOS)(TEOS 4mL，乙醇16mL，氨水280μL)，室溫下磁力攪拌反應70分鐘。10000rpm離心10分鐘。棄上清，將沉淀物分散于50mL乙醇中。加入150μL(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下磁力攪拌反應1小時，離心，10000rpm，10分鐘，棄上清，沉淀物重新分散于10mL戊二醛(0.5％)溶液中，磁力攪拌反應2小時，10000rpm離心10分鐘。二次純水清洗兩次，分散于10mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液中備用。

步驟2)，anti-survivin抗體功能化銀納米粒子的合成

如步驟1)中所述，取PATP功能化的銀納米粒子10mL，加入10μg/mL的anti-survivin多克隆抗體，室溫下磁力攪拌反應2小時。10000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀物用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘，然后加入1％w/v BSA封閉2小時，以減少表面的非特異性吸附。再用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘，將合成好的抗體功能化拉曼標記探針分散于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，4℃下貯存備用。

實施例9：核酸功能化的納米拉曼探針制備

以識別microRNA-21為例，步驟如下：

將實施例7中第一步制備好的銀納米粒子取出1mL，往其中同時加入濃度均為100μM的5’端修飾巰基的寡核苷酸序列與拉曼報告分子，體積比為1∶2，室溫反應1-3小時。10000轉離心10分鐘，棄上清，將沉淀物溶解于1mL的Tris緩沖溶液(20mM，pH7.6)中，4℃冰箱儲存備用。

實施例10：ALP印跡微萃取材料用于活體單細胞中ALP的檢測分析

肝癌細胞(HepG-2)，正常肝細胞(L-02)，海拉細胞(HeLa)和乳腺癌細胞(MCF-7)均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養基培養2-3天(37℃，5％C02)。去除培養基將細胞用1×PBS清洗兩次，然后使細胞保存于1×PBS中置于細胞顯微操作平臺的顯微鏡下，將ALP印跡微探針固定在細胞顯微操作平臺上，通過顯微操作平臺使微探針精確地插入單個細胞中萃取目標分子3分鐘，萃取后取出微探針用50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.5)清洗兩次，然后用5μL巰基苯硼酸功能化的納米拉曼探針標記2分鐘，標記后再用50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.5)清洗兩次，直接將微探針置于拉曼顯微鏡下進行拉曼檢測，結果如圖7c和圖7d所示。

實施例11：anti-survivin抗體功能化的微萃取材料用于活體單細胞中survivin蛋白的檢測分析

肝癌細胞(HepG-2)，正常肝細胞(L-02)，海拉細胞(HeLa)和乳腺癌細胞(MCF-7)均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養基培養2-3天(37℃，5％CO₂)。去除培養基將細胞用1×PBS清洗兩次，然后使細胞保存于1×PBS中置于細胞顯微操作平臺的顯微鏡下，將anti-survivin抗體功能化的微探針固定在細胞顯微操作平臺上，通過顯微操作平臺使微探針精確地插入單個細胞中萃取目標分子3分鐘，萃取后取出微探針用1×PBS清洗兩次，然后用5μL修飾了PATP anti-survivin抗體的納米拉曼探針標記2分鐘，標記后再用1×PBS清洗兩次，將微探針置于拉曼顯微鏡下進行拉曼檢測，結果如圖7e和圖7f所示。

實施例12：ALP印跡微萃取材料用于腫瘤裸鼠模型中ALP的檢測分析

分別將正常裸鼠、腋下種植了HepG-2細胞、HeLa細胞、MCF-7細胞和MGC-803細胞的裸鼠分別置于VMR動物麻醉機的鼠倉中，開啟麻醉機安全鎖閥門至最大麻醉劑量使小鼠迅速麻醉，然后調小麻醉劑量維持5分鐘左右使小鼠處于完全麻醉狀態。將麻醉的小鼠從鼠倉中取出，平放在實驗臺上，用印跡了ALP的或者非印跡的微探針輕輕旋轉式插入小鼠腫瘤內，讓微探針尖端停留在腫瘤內部萃取10min。萃取后取出微探針用50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.5)浸泡15min清洗數次，然后用5μL巰基苯硼酸功能化的納米拉曼探針標記20分鐘，標記后再用50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.5)清洗數次，直接將微探針置于拉曼顯微鏡下進行SERS檢測，結果如圖10c和10d所示。

實施例13：抗體功能化的微萃取材料用于小鼠模型中survivin蛋白的檢測分析

分別將正常裸鼠、腋下種植了HepG-2細胞、HeLa細胞、MCF-7細胞和MGC-803細胞的裸鼠分別置于VMR動物麻醉機的鼠倉中，開啟麻醉機安全鎖閥門至最大麻醉劑量使小鼠迅速麻醉，然后調小麻醉劑量維持5分鐘左右使小鼠處于完全麻醉狀態。將麻醉的小鼠從鼠倉中取出，平放在實驗臺上，將anti-survivin抗體或者非抗體功能化的微探針扎入小鼠腫瘤部位，萃取10分鐘，拔出微萃取探針針浸泡15min清洗數次，然后用5μL PATP和anti-survivin抗體功能化的納米拉曼探針標記20分鐘，標記后再用1×PBS清洗數次，將針灸針的尖端置于拉曼顯微鏡下進行拉曼檢測，結果如圖10a和10b所示。

實施例14：ALP印跡微萃取材料在血清樣本中的應用

往血清樣品中加入不同濃度的ALP標準溶液，混合均勻。每個陣列點上加入5μL含ALP標準溶液的血清濕盒孵育20min。用1×PBS清洗兩次，再用5μL硼親和拉曼探針標記5min。每個點用磷酸鹽溶液(10mM，pH＝8.5)清洗兩次，干燥后直接將陣列置于拉曼顯微鏡下進行拉曼檢測，結果如圖13所示。

實施例15：EPO印跡萃取材料在尿液樣本中的應用

每個陣列點上加入5μ L尿液(PBS，pH＝7.4)濕盒孵育20min。用PBS清洗2次，再用5μL硼親和SERS探針標記5min。每個點用磷酸鹽溶液(10mM，pH＝8.5)清洗2次，干燥后直接將陣列置于拉曼顯微鏡下進行拉曼檢測，結果如圖14所示。

實施例16：果糖印跡萃取探針探測蘋果中果糖的含量分布

將果糖印跡的萃取探針輕輕插入蘋果中，直至針尖靠近果核部位(如圖17a所示)，萃取10分鐘后，輕輕拔出萃取探針，用pH 7.4的磷酸緩沖鹽清洗萃取探針兩次，然后用納米拉曼探針(MPBA功能化的銀納米粒子)標記3分鐘。標記之后的萃取探針再次用pH 7.4的磷酸緩沖鹽清洗兩次，室溫晾干，然后將萃取探針置于拉曼光譜儀中，從針尖開始掃描得到拉曼信號分布圖譜，結果如圖17所示。