一種評價(jià)棉籽油中游離棉酚脫毒情況的方法與流程

本發(fā)明主要涉及植物性食品中有毒物質(zhì)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及植物油中游離棉酚脫毒情況檢測。
背景技術(shù)：
：棉籽油是從棉花屬植物種子中提煉的食用油，主要來源為陸地棉和草棉，棉花作為一種重要的生活資料，廣泛分布于我國各地，作為副產(chǎn)物之一的棉籽除少量作為種子之外，其余大部分用于榨油，成為食用油中重要一部分。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2012中國棉籽油產(chǎn)量為144.7萬噸，是全球最大棉籽油生產(chǎn)國。棉籽油成為我國居民食用油中重要一部分，是我國傳統(tǒng)四大食用植物油之一。在棉籽油生產(chǎn)加工、食用過程中，棉籽中的內(nèi)源性物質(zhì)-棉酚成為各方關(guān)注的重點(diǎn)，棉酚是錦葵科植物陸地棉、草棉及樹棉的成熟種子、根皮及莖稈中色素腺體中的一種黃色多酚物質(zhì)，棉酚在棉花的進(jìn)化及抵抗害蟲方面起著重要作用，目前在我國種植的棉花品種絕大部分為高酚棉品種。棉酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)由Adams等于1937年闡明，系統(tǒng)命名為1,1′,6,6′,7,7′-六羥基-5,5′二異丙基-3,3′二甲基-2,2′聯(lián)二萘-8,8′二羥基醛,分子式C30H30O8，見結(jié)構(gòu)式(1)。棉酚按其存在方式可分為結(jié)合棉酚(UG)和游離棉酚(FG)，總棉酚是指兩者之和。棉酚在植物體內(nèi)主要以游離棉酚方式存在，在棉花的種子、根皮及莖葉的腺體中都含有游離棉酚，其中棉籽中棉酚含量最為豐富，由于游離棉酚具有明確的毒副作用，并且在棉籽中含量較大，因此棉籽油生產(chǎn)工藝中非常重要的環(huán)節(jié)就是棉酚的脫毒工藝，各種脫毒工藝已經(jīng)在棉籽油生產(chǎn)過程中實(shí)際應(yīng)用。目前許多國家規(guī)定了植物性食品中游離棉酚的限量，我國也制定了棉籽油中游離棉酚的限量≤0.02％，并制定了植物性食品中游離棉酚檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T5009148-2003)，此標(biāo)準(zhǔn)可用于棉籽油、棉粕飼料等中游離棉酚的含量檢測,植物性食品中游離棉酚檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立在一定程度上遏制了棉酚含量超標(biāo)的棉籽油進(jìn)入市場，維護(hù)了消費(fèi)者的健康安全。但是，棉酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基及醛基，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，文獻(xiàn)報(bào)道棉酚在光照條件下發(fā)生縮醛互變異構(gòu)體。棉酚在各種溶劑中均表現(xiàn)出不穩(wěn)定。不管是我國目前普遍使用的預(yù)榨浸出法還是廣泛使用的直接浸出法，未作脫毒處理的棉籽油中游離棉酚在室溫條件下，較短的時(shí)間內(nèi)(15天至30天)游離棉酚含量會(huì)降解80％以上，加之各企業(yè)技術(shù)水平差別很大，棉籽油中棉酚脫毒工藝監(jiān)管難度較大，在眾多的棉籽油生產(chǎn)企業(yè)中極有可能存在棉酚脫毒不完全的情況，而目前僅僅檢測已經(jīng)上市的棉籽油中游離棉酚含量，不足以完全反映棉籽油企業(yè)的棉酚脫毒情況。由于棉酚不穩(wěn)定，室溫下30天降解90％以上，亟需一種利用棉籽油中棉酚降解產(chǎn)物評價(jià)生產(chǎn)過程游離棉酚脫毒情況的評價(jià)方法，可以作為化學(xué)標(biāo)記物檢驗(yàn)和評價(jià)棉籽油樣品游離棉酚脫毒情況，這種方法更為實(shí)用和具有現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明通過大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)尋找了一種利用棉籽油中棉酚降解產(chǎn)物評價(jià)游離棉酚脫毒情況的評價(jià)方法，該方法簡單可行，科學(xué)有效，測試結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以制止游離棉酚及降解產(chǎn)物含量超標(biāo)的棉籽油進(jìn)入市場，同時(shí)可以監(jiān)管棉籽油生產(chǎn)企業(yè)的脫毒工藝，對社會(huì)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、保障人民身體健康等方面都將起到積極作用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案：本發(fā)明提供的棉籽油中棉酚酮的檢測方法，由以下步驟構(gòu)成：(1)棉籽油供試品溶液的制備：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2-5min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，2000-4000r/min離心10-30min，上清液過0.45μm濾膜，即為供試品溶液。(2)制備濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將上述濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，對色譜圖中主峰進(jìn)行積分，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)棉籽油供試溶液，注入高效液相色譜儀，棉籽油供試溶液中棉酚酮應(yīng)與棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中主峰保留時(shí)間一致；對其峰面積進(jìn)行積分，峰面積帶入棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算棉籽油中棉酚酮濃度。(5)通過棉酚酮含量評價(jià)生產(chǎn)過程殘留游離棉酚含量：采用游離棉酚和降解產(chǎn)物棉酚酮量變關(guān)系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)計(jì)算游離棉酚的含量。本發(fā)明中，濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法為：用精密天平稱取棉酚酮對照品10mg，置于25ml容量瓶中，無水乙醇定容，得濃度為400μg/ml的棉酚酮儲(chǔ)備液，精密量取1、5、10、15、20ml棉酚酮儲(chǔ)備液置于100ml容量瓶中，無水乙醇定容。本發(fā)明中，采用HPLC色譜條件為InertsilODS-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇：2％磷酸＝85：15，流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測波長235nm。本發(fā)明中更加優(yōu)選的棉籽油供試品溶液的制備方法為：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，4000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用評價(jià)棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物評價(jià)游離棉酚脫毒情況的方法，簡單可行，測試結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以制止游離棉酚及降解產(chǎn)物含量超標(biāo)的棉籽油進(jìn)入市場，同時(shí)可以監(jiān)管棉籽油生產(chǎn)企業(yè)的脫毒工藝，對社會(huì)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、保障人民身體健康等方面都將起到積極作用。本發(fā)明通過研究清楚游離棉酚降解產(chǎn)物含量增加與游離棉酚含量降低的量變關(guān)系，并對游離棉酚降解產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，建立一種通過檢測游離棉酚降解產(chǎn)物含量來評價(jià)棉籽油生成過程中游離棉酚脫毒情況的新方法，并對市場上隨機(jī)抽檢棉籽油中降解產(chǎn)物含量進(jìn)行測定，獲得可靠的效果，是一種技術(shù)效果顯著的利用棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物評價(jià)游離棉酚脫毒情況的方法。附圖說明圖1顯示為棉籽油中游離棉酚降解情況色譜圖。圖2顯示為游離棉酚降解產(chǎn)物質(zhì)譜圖。圖3顯示為碎片離子質(zhì)譜及裂解途徑圖。圖4顯示為游離棉酚和降解產(chǎn)物線性關(guān)系圖。圖5顯示為不同放置時(shí)間棉籽油中游離棉酚降解情況HPLC圖。圖6顯示為市售棉籽油樣品色譜圖。圖7顯示為市售棉籽油與未脫毒棉籽油對比。圖中1、6、7中，1-游離棉酚、2-降解產(chǎn)物。具體實(shí)施方式下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的配方和方法不限于下述實(shí)施例。采用的主要儀器設(shè)備：Agilent1220LC二元泵高效液相色譜儀；ABSciexAPI4000+TM三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；EYELAOSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。采用的主要藥品與試藥：甲醇(色譜純，F(xiàn)isherScientific，美國)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isherScientific，美國)；磷酸(優(yōu)級純，成都市科龍化工試劑廠)；乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；本實(shí)驗(yàn)所使用的棉籽均來自市場常見。20批棉籽油樣品均來自新疆本地榨油廠。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為質(zhì)量百分比，除非特別指出除外。實(shí)施例一：本發(fā)明中一種棉籽油中游離棉酚脫毒情況評價(jià)方法，由以下步驟構(gòu)成：(1)棉籽油供試品溶液的制備：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2-5min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，2000-4000r/min離心10-30min，上清液過0.45μm濾膜，即為供試品溶液。(2)制備濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將上述濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，對色譜圖中主峰進(jìn)行積分，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)棉籽油供試溶液，注入高效液相色譜儀，棉籽油供試溶液中棉酚酮應(yīng)與棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中主峰保留時(shí)間一致；對其峰面積進(jìn)行積分，峰面積帶入棉酚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算棉籽油中棉酚酮濃度。(5)通過棉酚酮含量評價(jià)生產(chǎn)過程殘留游離棉酚含量：采用游離棉酚和降解產(chǎn)物棉酚酮量變關(guān)系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)計(jì)算游離棉酚的含量(參見附圖4)。實(shí)施例二：本發(fā)明中，濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法為：用精密天平稱取棉酚酮對照品10mg，置于25ml容量瓶中，無水乙醇定容，得濃度為400μg/ml的棉酚酮儲(chǔ)備液，精密量取1、5、10、15、20ml棉酚酮儲(chǔ)備液置于100ml容量瓶中，無水乙醇定容。實(shí)施例三：本發(fā)明中棉籽油供試品溶液的制備方法為：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，4000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜。實(shí)施例四：自制未脫毒游離棉酚的棉籽油按目前棉籽油毛油生產(chǎn)工藝進(jìn)行，過程包括：棉籽→剝殼→預(yù)炸→浸出→浸出毛油。將上述未脫毒的棉籽油樣品放置在25℃室溫下，不避光保存。分別在0、5、10、15、20、25天取樣，放置于-21℃冰箱中。高效液相色譜統(tǒng)一進(jìn)行測定。隨著放置時(shí)間的增加，游離棉酚峰面積逐漸減小的同時(shí)，降解產(chǎn)物峰面積逐漸增加(參見附圖5)。取未脫毒棉籽油在常溫下放置1個(gè)月，HPLC檢測游離棉酚降解完全，采用制備型HPLC色譜儀對降解產(chǎn)物進(jìn)行分離制備，制得產(chǎn)物經(jīng)HPLC法分析，保留時(shí)間與棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物保留時(shí)間一致。取上述降解產(chǎn)物樣品適量，乙醇溶解，過0.22μm濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析。LC-MS/MS條件：離子源TurboSpray；碰撞氣6psi：氣簾氣10psi；霧化氣60psi；輔助加熱氣30psi；離子噴霧電壓4000V；離子源溫度350℃；去簇電壓56V；Q0電壓10V；碰撞能量15V；碰撞池出口電位12V。負(fù)離子模式下檢測，MRM監(jiān)測。分子量的測定：經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測，[M-H]-m/z545.1442的質(zhì)譜圖，可知氧化產(chǎn)物M得準(zhǔn)確分子量為546.1520；而棉酚酮的分子式為C30H26O10，準(zhǔn)確分子量理論值為546.1518，說明反應(yīng)產(chǎn)物與棉酚酮分子量吻合很好(參見附圖2),棉酚酮見結(jié)構(gòu)式(2)。對氧化產(chǎn)物進(jìn)行ESI正、負(fù)離子的一級質(zhì)譜全掃描，在正、負(fù)離子模式下均有特征離子峰，噴霧電壓3500V，鞘氣壓力20Arb，輔氣壓力10Arb，毛細(xì)管溫度350℃，反吹壓力1.0Arb，錐孔電壓12Arb。經(jīng)過優(yōu)化，得到3個(gè)響應(yīng)較高的氧化產(chǎn)物的碎片離子，m/z分別為273.1、244.2、257.3，這3個(gè)特征離子的產(chǎn)生均可由棉酚酮裂解產(chǎn)生。由質(zhì)譜分析可知，棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物為棉酚氧化產(chǎn)物棉酚酮(參見附圖3)。0、5、10、15、20、25天取樣，進(jìn)行色譜分析(參見附圖5)，游離棉酚色譜峰面積和降解產(chǎn)物色譜峰面積見表1。表1：放置時(shí)間與游離棉酚色譜峰面積和降解產(chǎn)物色譜峰面積關(guān)系放置時(shí)間/天降解產(chǎn)物峰面積游離棉酚峰面積0868183951.818E+09348669276955108183556062523963831271957619115826282283554963658234119075953111645988763169255809以降解產(chǎn)物峰面積為X軸，游離棉酚峰面積為Y軸作圖，線性方程為Y＝-2.85X+2058258982，r2＝0.9902。從以上峰面積數(shù)據(jù)關(guān)系可以看出，游離棉酚下降峰面積/降解產(chǎn)物增加峰面積＝2.85/1，棉籽油中游離棉酚和降解產(chǎn)物量變關(guān)系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)實(shí)施例五：采用HPLC色譜條件InertsilODS-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇：2％磷酸＝85：15，流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測波長235nm。對本發(fā)明所用評價(jià)方法可靠性評價(jià)：線性關(guān)系考察：精密稱取已基本降解完全的棉籽油樣品10g(精確至0.01g)于離心試管中，加入50mL無水乙醇，按照本發(fā)明方法進(jìn)行制備。精密吸取上清液各2、4、6、8、10mL置10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物在0.0125～0.0625mg/mL范圍內(nèi)線性良好。得線性回歸方程為：Y＝110520637.5X－582707.5，r＝0.9995。精密度試驗(yàn)：精密稱取已基本降解完全的棉籽油樣品1g(精確至0.01g)于離心試管中，加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進(jìn)行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物日內(nèi)峰面積RSD為0.22％。重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取已基本降解完全的同一批棉籽油樣品5份，各1g(精確至0.01g)于離心試管中，分別加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進(jìn)行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物峰面積RSD為1.30％。穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取已基本降解完全的同一批棉籽油樣品6份，各1g，分別在0、2、4、8、12、24h加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進(jìn)行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物峰面積RSD為0.75％。加標(biāo)回收率試驗(yàn)：將已基本降解完全的棉籽油樣品作為標(biāo)品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的棉籽油樣品9份，各0.5g,每3份為一組作為平行樣。分別加入已基本降解完全的棉籽油樣品各0.4、0.5、0.6g于離心管中，各加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進(jìn)行制備。按發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積(參見附圖1)，游離棉酚降解產(chǎn)物的平均回收率為93.18％，RSD為3.94％。結(jié)果見表2。表2：游離棉酚降解產(chǎn)物回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)上述可靠性評價(jià)結(jié)果可知，本發(fā)明評價(jià)游離棉酚脫毒情況的評價(jià)方法，簡單可行，測試結(jié)果較為準(zhǔn)確穩(wěn)定，完全可以實(shí)現(xiàn)對市面棉籽產(chǎn)品中游離棉酚含量的測定。實(shí)施例六：將市售的24批棉籽油樣品按本發(fā)明方法進(jìn)行制備，按本發(fā)明色譜條件測定，研究發(fā)現(xiàn)，24批樣品中均未出現(xiàn)游離棉酚的色譜峰，而其中有20批棉籽油樣品的色譜圖中出現(xiàn)明顯的降解產(chǎn)物峰，通過降解產(chǎn)物棉酚酮與游離棉酚的量變關(guān)系公式，計(jì)算生產(chǎn)過程殘留游離棉酚的含量(參見附圖6、7)。表3:24批棉籽油樣品中降解產(chǎn)物含量“—”代表未檢出。從降解產(chǎn)物的角度研究棉籽油中游離棉酚的危害，這種研究思路是建立在大量實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)之上，更為客觀、真實(shí)。將會(huì)對棉籽油中游離棉酚的二次污染提供更為科學(xué)的評判方法，同時(shí)可追溯榨油企業(yè)脫毒情況。如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明,上述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3