化學修飾電極及其制備方法和電化學傳感器及其應用與流程

本發明涉及化學修飾電極和電化學傳感器技術領域。

背景技術：

電化學研究中，電極材料的性能決定著電化學反應的進行。電化學反應一般在電極表面附近進行，故電極表面性能如何是更重要的因素，通過采用共價鍵和、吸附、聚合等方法有目的地將具有功能性的物質引入電極表面，從而能夠制備得到具有新的特定功能的化學修飾電極。

滴涂法是制備化學修飾電極的一種常用方法，是將溶解在適當溶劑中的聚合物或者納米材料滴加或涂覆于電極表面，待溶劑蒸發干固后，生成涂膜結合在電極表面從而達到化學修飾的目的。

超支化聚合物是一類具有三維球狀立體結構的高度無規多級支化聚合物，其獨特的物理與化學結構使其具有低粘度、良好的溶解性和大量可修飾末端官能團等性質。與高度對稱的樹枝分子相比，超支化聚合物在合成過程中不需要經過多步反應和純化，合成過程簡單且生產成本相對低廉。含二茂鐵功能基團的超支化聚合物，屬于茂基金屬超支化聚合物中的一種，不僅具有超支化聚合物的結構，并且具有二茂鐵優異的氧化還原性質和電化學響應性，同時，還克服了二茂鐵難以成膜的缺點，改善了成膜的穩定性，在聚合物傳感器領域呈現良好的應用潛力（詳見背景技術文件1：“超支化聚酯基二茂鐵的合成及性能研究”，張穎，石家莊鐵道學院，2010年，碩士學位論文）。

石墨烯是一種由 sp2–雜化碳原子通過共價鍵連接形成的平面六方晶格材料，其獨特的電子結構特征和物理化學性質，使其在電化學檢測和電分析等方面顯示出獨特的優勢，可用于制備靈敏度高、選擇性好、電流響應快、檢測范圍寬、檢測限低的生物分析和環境檢測的電化學傳感器。石墨烯電導率高且結構中含有大量的邊界點、結構缺陷和功能性基團，為檢測物質在其上的吸附和電化學反應提供了豐富的場所，可以增加固定的分子數量，從而增強反應信號，由此加速了電子轉移，實現了直接電化學和生物傳感。

全氟磺酸樹脂（Nafion）是全氟代磺化物，是含有電離集團的陽離子交換聚合物，用作電極修飾材料具有良好的離子交換特性，將Nafion涂于電極表面制成的修飾電極具有富集、電催化和選擇性透過的特性，愈來愈廣泛的應用于分析化學領域。

化學修飾電極的一種主要應用是作為電化學傳感器。電化學傳感器的基本原理是在固定或變化的電壓下，具有電活性的分析物在電極表面發生氧化還原反應而產生電化學信號的過程。電化學傳感器包含分子識別和信息轉換兩個部分，其原理是在電極表面固定生物活性材料或者化學復合材料，通過這些物質對分析物進行特異性識別，電極將這個識別信息傳遞到信息轉換部分，形成可檢測的輸出信號，根據識別前后電信號的變化量，對待測物進行定性或定量分析。電化學轉換器件具有較高的靈敏度，易微型化，能在渾濁的溶液中操作等許多優勢，并且所需的儀器簡單、便宜，因而被廣泛應用于傳感器的制備中。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種化學修飾電極及其制備方法，將茂基金屬超支化聚合物和石墨烯作為電極表面修飾材料，將Nafion作為成膜劑，制得一種具有特定功能的化學修飾電極，具有茂基金屬優異的氧化還原性質和電化學響應性。

本發明要解決的另一技術問題是提供一種包括上述化學修飾電極的電化學傳感器及其應用，利用該具有特定功能的化學修飾電極，作為電化學傳感器中的分子特異性識別元件，實現對特定分子的定量檢測。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：化學修飾電極，包括基體電極和附著在該基體電極上的修飾層，所述基體電極為惰性固體電極，所述修飾層包括茂基金屬超支化聚合物、石墨烯和全氟磺酸樹脂構成的復合膜，所述茂基金屬超支化聚合物是指端基包括茂金屬基團的超支化聚合物。

具體地，所述復合膜自固體電極向外依次包括茂基金屬超支化聚合物層、茂基金屬超支化聚合物和石墨烯的混合物層、石墨烯層以及石墨烯和全氟磺酸樹脂的混合物層。

如前所述的化學修飾電極的制備方法，所述修飾層采用滴涂法制成，依次將包括茂基金屬超支化聚合物的溶液、石墨烯分散液和包括全氟磺酸樹脂的溶液滴涂到所述基體電極表面，使之自組裝成膜；每次滴涂后，烘干基體電極上的所滴涂液，再進行下一次滴涂。

進一步地，所述的化學修飾電極的制備方法，包括以下步驟：

1）首先將茂基金屬超支化聚合物溶液滴涂在所述基體電極表面，烘干，重復本步中滴涂、烘干操作多次，形成茂基金屬超支化聚合物涂層；

2）將茂基金屬超支化聚合物和石墨烯的混合溶液滴涂到預先已經吸附了茂基金屬超支化聚合物涂層的基體電極表面，烘干；

3）將石墨烯分散液滴涂到基體電極表面，烘干；

4）將石墨烯和全氟磺酸樹脂的混合溶液滴涂到基體電極表面，使自然干燥。

作為優選，所述步驟1）中，茂基金屬超支化聚合物在溶液的濃度控制在2.5×10^-5～1×10^-3mol·L^-1，所述茂基金屬超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯或超支化聚胺酯與二茂鐵甲酸或二茂鐵二甲酸反應制得。

反應原理為超支化聚合物的端羥基與二茂鐵甲酸或二茂鐵二甲酸的羧基間發生酯化反應，合成茂基金屬超支化聚合物，如超支化聚酯基二茂鐵、超支化聚胺酯基二茂鐵、超支化聚氨酯基二茂鐵等。

所述步驟2）中，混合溶液中石墨烯與茂基金屬超支化聚合物的質量比為5:18～72，茂基金屬超支化聚合物的濃度控制范圍為5×10^-5～2×10^-3mol·L^-1，混合溶液的溶劑為二氯甲烷；

所述步驟3）中，石墨烯分散液由如下方法配制：稱取5～10mg石墨烯加入到10ml N,N-二甲基甲酰胺中，經超聲震蕩混勻；

所述步驟4）中，石墨烯和全氟磺酸樹脂的混合溶液由如下方法配制：稱取10mg石墨烯，溶解在10ml 濃度為0.1%~5%的全氟磺酸樹脂溶液中，經超聲震蕩混勻。

作為優選，所述基體電極為玻碳電極，所述玻碳電極在滴涂前經過預處理，包括清洗、拋光和活化處理。

具體地，所述玻碳電極預處理方法為：使用無水乙醇、3～6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極進行超聲清洗，再用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后用體積比為1～3:1的H₂SO₄:H₂O₂的溶液對電極進行超聲活化，之后用0.5～2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化。

電化學傳感器，包括如前所述的化學修飾電極。

該電化學傳感器的應用，用于膽固醇、O,O-二甲基-O-（2,2-二氯乙烯基）磷酸酯（DDVP）的檢測。

采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發明采用茂基金屬超支化聚合物/石墨烯復合材料，作為化學修飾層制成具有特定功能的化學修飾電極，不僅具有良好而氧化還原性質和電化學響應性，還具有良好的電子轉移能力。同時，由于將茂基金屬接枝到超支化聚合物的末端，克服了單一的茂基金屬，如二茂鐵無法成膜的缺點。利用該化學修飾電極制備的傳感器具有良好的穩定性、重現性和靈敏性，能夠實現對膽固醇和DDVP的定量檢測，操作簡便、檢測速度快。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

圖1 為本發明實例1制作的化學修飾電極在PBS溶液中的CV曲線圖；

圖2為本發明實例1制作的化學修飾電極在不同掃描速率CV曲線圖；

圖3為本發明實例1制作的化學修飾電極在不同pH值下的DPV曲線圖和峰電流與不同pH的關系圖；

圖4為本發明實例1制作的傳感器對不同濃度膽固醇的DPV曲線和濃度與峰電流的關系圖；

圖5為本發明實例1制作的傳感器對不同濃度敵敵畏的DPV曲線和濃度與峰電流的關系圖；

圖6為本發明實例1制作的化學修飾電極的SEM圖；

圖7為本發明實例1制作的傳感器的裸GCE、HPAE-Fc/GCE、GR/GCE、HPAE-Fc/GR/GCE、HPAE-Fc/GR/DDVP/GCE交流阻抗圖譜。

具體實施方式

本發明說明書中所用簡稱作如下說明：

超支化聚胺酯基二茂鐵 HPAE-Fc

玻碳電極 GCE

石墨烯 GR

全氟磺酸樹脂 Nafion

O，O-二甲基-O-（2，2-二氯乙烯基）磷酸酯 DDVP（敵敵畏，DDV）

差分脈沖伏安法 DPV。

茂基金屬是過渡金屬與環戊二烯相連所形成的有機金屬配位化合物。二茂鐵是一種典型的茂基金屬，化學性質穩定，具有優異的氧化還原性質和電化學響應性，用作化學修飾電極的修飾材料將具有獨特的功能，能夠作為電化學傳感器實現特定的用途。但是二茂鐵難以成膜，且成膜的穩定性差，使得其在化學修飾電極和電化學傳感器領域的應用受到限制。

化學修飾電極

本發明提供了一種化學修飾電極，利用茂基金屬超支化聚合物和石墨烯作為化學修飾材料，先將茂基金屬超支化聚合物修飾在基體電極上，再將石墨烯修飾在其表面，最后使用Nafion作為成膜劑固化成膜，制得的化學修飾電極具有特定的功能，不僅具有良好而氧化還原性質和電化學響應性，還具有良好的電子轉移能力。同時，利用該化學修飾電極制備的傳感器具有良好的穩定性、重現性和靈敏性，能夠實現對膽固醇和DDVP的定量檢測，操作簡便、檢測速度快。

該化學修飾電極包括基體電極和附著在該基體電極上的修飾層，基體電極為惰性固體電極，修飾層包括茂基金屬超支化聚合物、石墨烯和全氟磺酸樹脂構成的復合膜，茂基金屬超支化聚合物是指端基包括茂金屬基團的超支化聚合物。

常用的惰性固體電極如玻碳電極、鉑電極、金電極、碳化硼等。在固體電極上制備修飾層之前，一般需要對固體電極進行清潔處理，以獲得均一的電極表面狀態，能夠使電極在電化學行為上具有良好的重現性。

茂基金屬超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯或超支化聚胺酯與二茂鐵甲酸或二茂鐵二甲酸反應制得。具體反應方法見前述的背景技術文件1。現以超支化聚酯和二茂鐵甲酸為例，作簡單說明：將熔融的超支化聚酯與二茂鐵甲酸混合，并加入對甲苯磺酸作為催化劑，在氮氣氛圍保護下，反應體系抽真空150℃進行反應，制得超支化聚酯基二茂鐵。由于二茂鐵的空間位阻較大，所以對超支化聚酯的接枝程度達不到理論值的100%。

反應原理為超支化聚合物的端羥基與二茂鐵甲酸或二茂鐵二甲酸的羧基間發生酯化反應，合成茂基金屬超支化聚合物，如超支化聚酯基二茂鐵、超支化聚胺酯基二茂鐵、超支化聚氨酯基二茂鐵等。

具體地，復合膜自固體電極向外依次包括茂基金屬超支化聚合物層、茂基金屬超支化聚合物和石墨烯的混合物層、石墨烯層以及石墨烯和全氟磺酸樹脂的混合物層。

復合膜將茂基金屬超支化聚合物優異的氧化還原性、電化學響應性和石墨烯良好的導電性相結合，使用Nafion成膜劑改善其固化性質，增強了穩定性。

化學修飾電極的制備方法

如前所述的化學修飾電極的制備方法，修飾層采用滴涂法制成，依次將包括茂基金屬超支化聚合物的溶液、石墨烯分散液和包括全氟磺酸樹脂的溶液滴涂到基體電極表面，使之自組裝成膜；每次滴涂后，烘干基體電極上的所滴涂液，再進行下一次滴涂。

自組裝成膜的基本原理是通過固-液界面間的化學吸附(表面化學反應)進行的。

本發明提供一種化學修飾電極的具體制備方法，包括以下步驟：

（1）使用無水乙醇、3～6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極進行超聲清洗，再用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后用H₂SO₄:H₂O₂（1～3:1、體積比）的溶液對電極進行超聲活化，之后用0.5～2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制茂基金屬超支化聚合物溶液，溶劑采用二次蒸餾水或者是有機溶劑二氯甲烷均可，使用前將茂基金屬超支化聚合物溶液在50～80℃下超聲震蕩充分溶解，在玻碳電極表面滴涂一定量的該溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為30～90℃，時間為10～60min，重復本步中滴涂、烘干操作5～20次，以增大聚合物在電極表面的吸附量；

（3）配制茂基金屬超支化聚合物/石墨烯混合溶液，使用前將茂基金屬超支化聚合物/石墨烯混合溶液超聲震蕩充分分散，將一定量混合溶液滴涂到預先已經吸附了茂基金屬超支化聚合物涂層的玻碳電極表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30～90℃，時間為10～60min；

（4）配制石墨烯分散液，使用前將石墨烯分散液超聲震蕩充分分散，將一定量石墨烯分散液滴涂到玻碳電極表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30～90℃，時間為10～60min；

（5）配制石墨烯/Nafion混合溶液，使用前將石墨烯/Nafion混合溶液超聲震蕩充分分散，將一定量石墨烯/Nafion混合溶液滴涂到玻碳電極表面，然后自然干燥8～12h。

其中步驟2）中，茂基金屬超支化聚合物在溶液的濃度控制在2.5×10^-5～1×10^-3mol·L^-1，茂基金屬超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯和超支化聚胺酯等含超支化結構和活潑基團的超支化聚合物，與二茂鐵甲酸、二茂鐵二甲酸以及含其他活潑基團的二茂鐵結構物反應制得。

步驟3）中，混合溶液中石墨烯與茂基金屬超支化聚合物的質量比為5:18～72，茂基金屬超支化聚合物的濃度控制范圍為5×10^-5～2×10^-3mol·L^-1，混合溶液的溶劑為二氯甲烷；

步驟4）中，石墨烯分散液由如下方法配制：稱取5～10mg石墨烯加入到10ml N,N-二甲基甲酰胺中，經超聲震蕩混勻；

步驟5）中，石墨烯和全氟磺酸樹脂的混合溶液由如下方法配制：稱取10mg石墨烯，溶解在10ml 濃度為0.1%~5%的全氟磺酸樹脂溶液中，經超聲震蕩混勻。

下面進一步舉例說明該化學修飾電極及其制備方法

實施例1

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的超支化聚胺酯基二茂鐵（以下簡稱HPAE-Fc）溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

化學修飾電極的表征

將實施例1制得的化學修飾電極作為工作電極，組成三電極體系，在PBS溶液中進行電化學表征，其CV曲線圖、DPV曲線圖參見圖1、圖2和圖3。

采用實施例1制備的化學修飾電極作為電化學傳感器工作電極，使用電化學工作站以三電極體系分別對膽固醇和DDVP進行測試。

膽固醇的檢測方法

（1） 使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為輔助電極，所制備的修飾電極為工作電極，在25mL的模擬體液（或二氯甲烷等合適溶劑）中進行測試；

（2）選擇差分脈沖伏安法（DPV）對膽固醇進行檢測，初始電位為0.3V，最終電位為1.0V；

（3）依次向電解池溶液中滴加一定量的0.25mol.L^-1的膽固醇溶液（溶劑為模擬體液或二氯甲烷等合適溶劑），分別進行DPV實驗，繪制膽固醇濃度和DPV峰電流的關系圖，見圖4。

DDVP的檢測方法

（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為輔助電極，所制備的修飾電極為工作電極，在25mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中進行測試；

（2）選擇差分脈沖伏安法（DPV）對DDVP進行檢測，初始電位為0.1V，最終電位為0.6V；

（3）依次向電解池溶液中加入一定量0.5g/kg的O，O-二甲基-O-（2，2-二氯乙烯基）磷酸酯溶液，分別進行DPV實驗，繪制DDVP濃度和DPV峰電流的關系圖，見圖5。

實施例1制得的化學修飾電極其修飾層界面微觀結構見圖6。

采用電化學交流阻抗法對裸GCE、HPAE-Fc/GCE、GR/GCE、HPAE-Fc/GR/GCE、HPAE-Fc/GR/DDV/GCE分別進行測試，測定的交流阻抗圖譜見圖7。

由上述測試結果譜圖可知，該電化學傳感器具有靈敏度高、穩定性和重現性好、線性檢測范圍寬的優點，可用于血樣中膽固醇濃度測定以及果蔬中殘留殺蟲劑DDVP的檢測。

實施例2

（1）依次使用無水乙醇、5mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液對玻碳電極進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=1:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制5×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實施例3

（1）依次使用無水乙醇、4mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=2:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用1mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實施例4

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用0.5mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制5×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂20μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂20μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂20μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂20μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例5

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在60℃下超聲震蕩充分溶解，在GCE表面滴涂10μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂10μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂10μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂10μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例6

（1）依次使用無水乙醇、5mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=2:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用0.5mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.5%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.5%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.5%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例7

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為90℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例8

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間1h，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(2%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(2%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(2%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例9

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1 的濃硫酸進行電化學電極活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間為30min；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，烘干時間為30min；

（5）配制GR/Nafion(3%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(3%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(3%)混合溶液到上述電極表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間為30min。

實例10

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為90℃，烘干時間為20min；

（5）配制GR/Nafion(4%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(4%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(4%)混合溶液到上述電極表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為90℃，時間為20min。

實例11

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(5%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(5%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(5%)混合溶液到上述電極表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h。

實例12

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:72）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(0.5%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(0.5%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.5%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

實例13

（1）依次使用無水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去離子水對玻碳電極超聲清洗，接著使用氧化鋁粉末溶液進行拋光處理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超聲波洗滌活化電極，最后使用2mol·L^-1的濃硫酸進行電化學活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前將1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超聲30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后進行烘干處理，烘干溫度為60℃，時間20min，重復本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:18）混合溶液，使用前將GR/ HPAE-Fc混合溶液超聲震蕩充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，時間為1h；

（4）配制GR分散液，使用前將GR分散液超聲充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后進行烘干處理，烘干溫度為30℃，烘干時間為1h；

（5）配制GR/Nafion(1%)混合溶液，使用前將GR/Nafion(1%)混合溶液超聲30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(1%)混合溶液到上述電極表面，然后自然干燥10h。

以上對本發明進行了詳細介紹，本發明中應用具體個例對本發明的實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明，應當指出，對于本技術領域的技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可對本發明進行若干改進，這些改進也落入本發明權利要求的保護范圍內。