本發(fā)明涉及一種乙交酯標準物質(zhì)的制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
聚羥基乙酸是結(jié)構(gòu)最簡單的脂肪族聚酯，因其具有良好的生物相容性和可降解性，使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)用高分子材料中，在手術(shù)縫合線、藥物控制釋放、骨骼固定及修復(fù)、人造皮膚及血管、組織工程等領(lǐng)域具有重要地位。乙交酯開環(huán)聚合法是制備高相對分子質(zhì)量的pga的常用方法，因此乙交酯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。
標準物質(zhì)/標準樣品（referencematerial，rm）是一種材料或物質(zhì)，其一種或多種特性值足夠均勻和穩(wěn)定并被良好確定，用于校準測量系統(tǒng)、評價測量程序或為材料賦值，每種確定的特性值都有明確的溯源性和給定置信水平的不確定度。
目前市場上未出現(xiàn)乙交酯標準物質(zhì)，為嚴格把控生物醫(yī)藥材料的質(zhì)量，市場會對乙交酯標準物質(zhì)需求逐步增加。為了方便國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品分析方法確認評價、質(zhì)量標準建立、質(zhì)量控制等，以及擴大國際互認范圍，促進國際貿(mào)易和經(jīng)濟增長，研制乙交酯標準物質(zhì)對于實際應(yīng)用十分必要。同時，研制乙交酯國家二級標準物質(zhì)滿足市場需求，保證有證標準物質(zhì)供應(yīng)、量值傳遞以及質(zhì)量控制，具有現(xiàn)實意義。乙交酯的精制工藝主要有兩種：一是參照乙交酯的溶解性，采用不同的有機溶劑經(jīng)過多次重結(jié)晶的方式得到乙交酯純品；另一種是根據(jù)乙交酯容易升華的特點，采用多次升華的方法提純乙交酯。相較這兩種方法，采用升華的方法不僅可以避免重結(jié)晶溶劑的殘留，而且乙醇酸也不易升華，能達到較好的分離提純的效果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種乙交酯標準物質(zhì)的制備方法和檢測方法。
本發(fā)明所提供的乙交酯標準物質(zhì)，是按照包括如下步驟的方法制備的：
①減壓干燥除雜：將原料乙交酯置于升華裝置中，加熱至42~48℃，真空度為-0.085mpa下抽3小時，去除揮發(fā)性雜質(zhì)；
②減壓除雜：將裝置加熱至68~72℃，真空度為-0.085mpa下，使乙交酯升華，收集升華后的產(chǎn)品；
③研磨：取上述升華后的乙交酯樣品，置臼室研磨儀中研磨二次；
④減壓干燥除雜：取研磨后的乙交酯置于升華裝置中，加熱至42~48℃，真空度為-0.085mpa下抽3小時；
⑤減壓除雜：將裝置加熱至68~72℃，真空度為-0.085mpa下，使乙交酯升華，收集升華后的產(chǎn)品；
⑥研磨方法：取上述升華后的乙交酯樣品，置臼式研磨儀中研磨后，置于玻璃燒杯中，攪拌混勻。
⑦取上述混合均勻的乙交酯樣品進行均勻性預(yù)檢，判斷分布均勻后進行分裝、結(jié)構(gòu)確證、均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、定值以及不確定度評定。
上述乙交酯標準物質(zhì)的原料選用濟南岱罡生物有限公司生產(chǎn)的乙交酯，是采用乙醇酸為起始原料，經(jīng)分子間脫水聚合成低分子量的聚羥基乙酸，再高溫裂解環(huán)化得到乙交酯粗品，再以乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑經(jīng)多次提純后得到較高純度的乙交酯，采用氣相色譜法測定含量，純度達到99%以上。
乙交酯標準物質(zhì)在分裝前需在步驟⑥產(chǎn)品的上、中、下部位各取3組樣采用氣相色譜法進行含量測定，作為均勻性預(yù)檢，在測定結(jié)果中進行最大值和最小值的異常值檢驗，pearson-stephens檢驗按下式計算極差(r)和標準偏差(s)的比值r/s，當該值大于pearson-stephens表中的舍棄界限值時，則認為測定的最大值或最小值為異常值，即樣品的含量分布不均勻。反之即判斷為均勻，可進行分裝。
上述乙交酯標準物質(zhì)的包裝材料經(jīng)洗滌劑浸泡、自來水清洗、酸液(或堿液)浸泡過夜、自來水沖洗、純化水沖洗、烘干等洗滌措施嚴格清洗，于d級潔凈間分裝。
上述乙交酯標準物質(zhì)采用紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁氫譜和核磁碳譜進行結(jié)構(gòu)確證，確證其結(jié)構(gòu)為乙交酯。
上述乙交酯標準物質(zhì)瓶間和瓶內(nèi)隨機抽樣取樣，采用氣相色譜法測定，以面積歸一化法計算乙交酯的含量作為指標，考察樣品瓶間以及瓶內(nèi)的均勻性情況，數(shù)據(jù)用方差分析法(f檢驗法)處理。s1為瓶間方差，即標準物質(zhì)的不均勻誤差和測定方法的隨機誤差的綜合，s2為瓶內(nèi)方差，即測定方法的隨機誤差的近似值，若
n—每一瓶內(nèi)重復(fù)測定的次數(shù)；
m—均勻性檢驗抽取的單元數(shù)
瓶內(nèi)方差的計算公式如下：
xij—第i個瓶內(nèi)的第j個測定值；其余符號意義同前。
設(shè)定短期和長期穩(wěn)定性試驗的相應(yīng)條件，通過氣相色譜法考察乙交酯含量變化情況，采取平均值的一致性檢驗方法評價上述乙交酯標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，分別采用t檢驗法及直線擬合法處理分析試驗數(shù)據(jù)，其中，
若t＜t臨界值，說明兩者的均值一致，樣品穩(wěn)定；反之則說明樣品不穩(wěn)定。
以時間為x軸，以樣品含量為y軸，描繪出含量與時間的關(guān)系。斜率可用下式計算：
截距由下式計算：
直線之中的點的標準差可由下式計算：
與斜率有關(guān)的不確定度用下式計算：
若|b1|＜t0.95,n-2*s(b1)，表明斜率是不顯著的，未觀測到不穩(wěn)定性，反之則說明不穩(wěn)定。
采用單個實驗室多種定值方法的方式對上述乙交酯標準物質(zhì)進行定值，即氣相色譜法（gc-fid）和差示掃描量熱法（dsc），并通過方法學(xué)驗證確定試驗條件。
氣相色譜法定值為扣除水分和熾灼殘渣的含量值，計算公式為p=（1-w水分-w殘渣）p液相。
差示掃描量熱法定值用自帶純度分析軟件分析。
用t檢驗法（參見8）檢查兩種方法所測值的一致性，若t＜t臨界值，則氣相色譜法與差示掃描量熱法所得數(shù)據(jù)是一致的。
本標準物質(zhì)所采用的方法均為滿足計量學(xué)特性的通用方法。所使用的測量儀器和玻璃儀器均經(jīng)過湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局和廣州廣電計量檢測股份有限公司的計量檢定，保證了數(shù)據(jù)的溯源性。
上述乙交酯標準物質(zhì)的不確定度包括定值方法引入的不確定度、均勻性引入的不確定度和穩(wěn)定性引入的不確定度。定值方法引入的不確定度又包括水分、熾灼殘渣測定引入的不確定度和氣相色譜法、差示掃描量熱法引入的不確定度。合成上述乙交酯標準物質(zhì)的不確定度分量，取擴展因子k=2（置信概率95%），計算擴展不確定度。
本發(fā)明的乙交酯標準物質(zhì)的檢測方法，以及上述方法制備的乙交酯標準物質(zhì)的檢測方法，其包括以下步驟：結(jié)構(gòu)檢測、測定乙交酯含量的氣相色譜法、均勻性檢測、穩(wěn)定性檢測、以及氣相色譜法和差示掃描量熱法聯(lián)合定值檢測。并進一步包括定值以及不確定度檢測方法。
上述乙交酯標準物質(zhì)采用紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁氫譜和核磁碳譜進行結(jié)構(gòu)確證，確證其結(jié)構(gòu)為乙交酯。
上述氣相色譜法測定法：儀器：agilent7890b氣相色譜儀（安捷倫），檢測器：fid檢測器；色譜柱：hp-5（30m×0.32mm×0.25μm)，進樣口溫度：240℃；檢測器溫度：240℃；柱溫：初始溫度80℃保持5min后，以20℃/min的速率升溫至200℃，保持5min。分流比：20:1；進樣方式：直接進樣，進樣量1μl。
上述均勻性檢測方法，上述乙交酯標準物質(zhì)瓶間和瓶內(nèi)隨機抽樣取樣，采用氣相色譜法測定，以面積歸一化法計算乙交酯的含量作為指標，計算樣品瓶間以及瓶內(nèi)的均勻性情況，數(shù)據(jù)用方差分析法(f檢驗法)處理。s1為瓶間方差，即標準物質(zhì)的不均勻誤差和測定方法的隨機誤差的綜合，s2為瓶內(nèi)方差，即測定方法的隨機誤差的近似值，其中
n—每一瓶內(nèi)重復(fù)測定的次數(shù)；
m—均勻性檢驗抽取的單元數(shù)
瓶內(nèi)方差的計算公式如下：
xij—第i個瓶內(nèi)的第j個測定值；其余符號意義同前。
上述穩(wěn)定性檢測方法：設(shè)定短期和長期穩(wěn)定性試驗的相應(yīng)條件，通過氣相色譜法考察乙交酯含量變化情況，采取平均值的一致性檢驗方法評價上述乙交酯標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，分別采用t檢驗法及直線擬合法處理分析試驗數(shù)據(jù)，其中，
其中標準物質(zhì)的穩(wěn)定性t＜t臨界值。若t＜t臨界值，說明兩者的均值一致，樣品穩(wěn)定，；反之則說明樣品不穩(wěn)定。
以時間為x軸，以樣品含量為y軸，描繪出含量與時間的關(guān)系。斜率可用下式計算：
截距由下式計算：
直線之中的點的標準差可由下式計算：
與斜率有關(guān)的不確定度用下式計算：
若|b1|＜t0.95,n-2*s(b1)，表明斜率是不顯著的，未觀測到不穩(wěn)定性，選擇|b1|＜t0.95,n-2*s(b1)作為標準物質(zhì)，反之則說明不穩(wěn)定。
采用單個實驗室多種定值方法的方式對上述乙交酯標準物質(zhì)進行定值，即氣相色譜法（gc-fid）和差示掃描量熱法（dsc），并通過方法學(xué)驗證確定試驗條件。
氣相色譜法定值為扣除水分和熾灼殘渣的含量值，計算公式為p=（1-w水分-w殘渣）p液相。
差示掃描量熱法定值用自帶純度分析軟件分析。
用t檢驗法（參見8）檢查兩種方法所測值的一致性，該方法中t＜t臨界值。若t＜t臨界值，則氣相色譜法與差示掃描量熱法所得數(shù)據(jù)是一致的，并選擇t＜t臨界值作為標準物質(zhì)。
上述乙交酯標準物質(zhì)的不確定度包括定值方法引入的不確定度、均勻性引入的不確定度和穩(wěn)定性引入的不確定度。定值方法引入的不確定度又包括水分、熾灼殘渣測定引入的不確定度和氣相色譜法、差示掃描量熱法引入的不確定度。合成上述乙交酯標準物質(zhì)的不確定度分量，取擴展因子k=2（置信概率95%），計算擴展不確定度。
具體實施方式
1、候選物
經(jīng)過對國內(nèi)幾家生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的乙交酯進行原料篩選，選定了濟南岱罡生物有限公司生產(chǎn)的乙交酯作為本批標準物質(zhì)的原料。該公司生產(chǎn)的乙交酯采用乙醇酸為起始原料，經(jīng)分子間脫水聚合成低分子量的聚羥基乙酸，再高溫裂解環(huán)化得到乙交酯粗品，再以乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑經(jīng)過多次提純后得到純度99%以上的乙交酯。
2、標準物質(zhì)樣品制備
設(shè)備：真空烘箱，型號dzf；隔膜真空泵，型號mpc301z；臼室研磨儀，型號m100。
制備過程：
①減壓干燥除雜：取原料乙交酯300g置于升華裝置中，加熱至45℃，真空度為-0.085mpa下抽3小時，去除揮發(fā)性雜質(zhì)；
②減壓除雜方法：將裝置加熱至70℃，真空度為-0.085mpa下，使乙交酯升華，收集升華后的產(chǎn)品；
③研磨方法：取上述升華后的乙交酯樣品，置臼室研磨儀中研磨二次；
④減壓干燥除雜：取研磨后的乙交酯置于升華裝置中，加熱至45℃，真空度為-0.085mpa下抽3小時；
⑤減壓除雜方法：將裝置加熱至70℃，真空度為-0.085mpa下，使乙交酯升華，收集升華后的產(chǎn)品；
⑥研磨方法：取上述升華后的乙交酯樣品，置臼式研磨儀中研磨后，置于玻璃燒杯中，攪拌混勻，樣品量為225g。
3、標準物質(zhì)均勻性預(yù)檢
在容器的上部、中部、下部三個部位分別取樣，共取9份樣品，各0.5g，供含量測定用。取本品適量，精密稱定，加乙腈稀釋成約0.5mg/ml的溶液，搖勻，分別量取1μl，注入氣相色譜儀，測定，并以面積歸一化法計算含量，結(jié)果見下表：
經(jīng)查pearson-stephens表，當n＝3，α＝0.05時r/s臨界值為1.999，由上表的測定結(jié)果可以看出，乙交酯純度標準物質(zhì)的含量r/s值小于pearson-stephens表中的臨界值，即初步判斷乙交酯的分布均勻，可以進行樣品的分裝。
4、標準物質(zhì)的分裝
1）設(shè)備：全自動粉末灌裝機，型號yy-609。
2）包裝材料的處理
本標準物質(zhì)的包裝材料為2ml藥用棕色西林瓶，分裝前采用嚴格的洗滌措施清洗，具體清洗流程如下：
西林瓶清洗流程：洗滌劑浸泡─自來水清洗─1:1鹽酸浸泡過夜─自來水沖洗─純化水沖洗─烘干
膠塞清洗流程：洗滌劑浸泡─自來水清洗─堿液浸泡過夜─自來水沖洗──酸液浸泡過夜─自來水清洗─純化水沖洗─低溫烘干
3）標準物質(zhì)的分裝
在d級潔凈間，采用全自動固體粉末灌裝機，分裝均勻性預(yù)檢合格的乙交酯標準物質(zhì)，每瓶裝量為100mg。灌裝后，塞上橡皮塞，鋁帽密封，分裝數(shù)量為500瓶。剩余樣品密封后，置于規(guī)定條件下儲存。
5、標準物質(zhì)結(jié)構(gòu)確證
采用紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁氫譜和核磁碳譜對本次制備的乙交酯標準物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)測試研究。
儀器：紅外光譜儀，型號pespectrum-65；核磁共振儀，型號bruker-400；質(zhì)譜儀，型號brukeramazonx。
樣品的紅外光譜結(jié)果顯示了乙交酯主要官能團亞甲基、碳氧雙鍵、碳氧鍵的信息，nmr譜顯示質(zhì)子數(shù)與該化學(xué)結(jié)構(gòu)相符，ms（esi源）顯示的基峰m/z=116.0，與該化合物的分子量相符。因而，本次研制的標準物質(zhì)可以確證為乙交酯。
6、均勻性檢驗
1）取樣方法
隨機抽取乙交酯標準物質(zhì)樣品15瓶，每瓶取樣3次，取樣量約為10mg，共取樣45份。
2）供試品溶液的制備
取乙交酯標準物質(zhì)適量，精密稱定，加乙腈制成濃度為0.5mg/ml的溶液。
3）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：
儀器及試劑：agilent7890b氣相色譜儀（安捷倫），色譜乙腈（merk）
檢測器：fid檢測器；色譜柱：hp-5（30m×0.32mm×0.25μm)，
進樣口溫度：240℃；檢測器溫度：240℃；
柱溫：初始溫度80℃保持5min后，以20℃/min的速率升溫至200℃，保持5min。
分流比：20:1；進樣方式：直接進樣，進樣量1μl
4）測定法：精密吸取供試品溶液1μl，注入氣相色譜儀，測定，記錄面積百分含量，即得。
5)測定結(jié)果：
采用氣相色譜法，按上述色譜條件測定樣品的均勻性，結(jié)果詳見下表。
上述均勻性結(jié)果表明：瓶內(nèi)與瓶間測定平均值和它們的標準偏差均無顯著性差異。而且其測定的精密度在定值精度范圍之內(nèi)，同時定值和穩(wěn)定性試驗均為隨機抽取的樣品，其結(jié)果均未見顯著性差異，從而可以判定標準物質(zhì)是均勻的。
7、穩(wěn)定性檢驗
1）短期穩(wěn)定性試驗
①樣品儲存條件
將乙交酯標準物質(zhì)分裝于棕色西林瓶中，塞上橡皮塞，鋁帽密封后，放置在不同溫度（0℃，20℃，30℃和40℃）的條件下，并在不同時間點（0，1，2，3和4周）分別取樣。通過檢測乙交酯含量變化情況，評價樣品的穩(wěn)定性。
②含量測定方法
采用氣相色譜法進行含量測定，每個溫度參數(shù)隨機選取3瓶。情況取本品適量，精密稱定，加乙腈稀釋制成約0.5mg/ml的溶液，搖勻，分別量取1μl，注入氣相相色譜儀，測定，并以面積歸一化法計算含量。
③評價方法：
短期穩(wěn)定性采取平均值的一致性檢驗方法評價樣品的穩(wěn)定性，以第0周的數(shù)據(jù)為標準，通過比較每個考察溫度下不同時間點的含量平均值與0周含量平均值的一致性，判斷樣品的穩(wěn)定性情況。
④評價標準：
根據(jù)采取的取樣方式，選取顯著性水平為0.05，自由度為n1+n2-2＝4。
a.t<t0.05,4時，說明兩者的均值一致，樣品穩(wěn)定；
b.t>t0.05,4時，說明兩者的均值不一致，樣品不穩(wěn)定；
⑤試驗結(jié)果
⑥實驗結(jié)論
樣品在0℃，20℃，30℃和40℃儲存4周后，乙交酯含量變化不明顯。采用t測試對數(shù)據(jù)進行分析，在40℃下儲存4周，樣品變化的差異未達到顯著水平，由此說明樣品在40℃的條件下儲存4周是穩(wěn)定的。因此，乙交酯標準物質(zhì)可在常溫條件下運輸。
2）長期穩(wěn)定性試驗
①樣品儲存條件
將分裝于棕色西林瓶中的密封樣品，放置于溫度30±2℃、濕度65±5%的存儲環(huán)境中，進行長期穩(wěn)定性考察，在不同時間點（0，1，3，6，9，12月）隨機選取5瓶，每瓶取樣1份。
②含量測定方法
采用氣相色譜法測定，取樣量為10mg，通過檢測乙交酯含量變化情況，評價樣品的長期穩(wěn)定性的情況。
③評價方法
長期穩(wěn)定性采取平均值的一致性檢驗方法和直線擬合法評價樣品的穩(wěn)定性，前者以第0月的數(shù)據(jù)為標準，通過比較每個考察時間點下的含量平均值與0月含量平均值的一致性，判斷樣品的穩(wěn)定性情況，后者則通過直線斜率的顯著性來判斷。
④評價標準
根據(jù)采取的取樣方式，選取顯著性水平為0.05，自由度為n1+n2-2＝8。
①.t<t0.05,8時，說明兩者的均值一致，樣品穩(wěn)定；
②.t>t0.05,8時，說明兩者的均值不一致，樣品不穩(wěn)定；
若直線斜率|b1|＜t0.95,n-2*s(b1)，表明斜率是不顯著的，未觀測到不穩(wěn)定性，反之則說明不穩(wěn)定。
⑤試驗結(jié)果
⑥實驗結(jié)論
a.t檢驗法
上表試驗結(jié)果通過t檢驗分析表明，乙交酯標準物質(zhì)在30±2℃下儲存12個月，其含量結(jié)果未發(fā)生顯著變化，因此乙交酯純度標準物質(zhì)可以30±2℃下儲存12個月。
b.直線擬合法
上表穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，以x代表時間，以y代表樣品的含量，擬合成一條直線，則有斜率b1＝0.00106％，截距b0＝99.307％，標準差s2＝2.45×10-7，斜率的不確定度s(b1)＝4.71×10-3％，自由度為n-2＝4，(95％置信水平)，t0.05,4＝2.78，由于|b1|＜t0.05,4gs(b1)＝0.0131，故斜率是不顯著的。因而樣品在30±2℃下儲存12個月穩(wěn)定。
8、標準物質(zhì)的定值
采用氣相色譜法（gc-fid）和差示掃描量熱法(dsc)兩種不同原理的定值方法對乙交酯標準物質(zhì)聯(lián)合定值。
1）氣相色譜法
以面積歸一法計算含量，扣除水分和熾灼殘渣后即為測定的含量值，計算公式為p=（1-w水分-w殘渣）p液相。
其中，水分的測定方法采用《中國藥典》2010年版二部附錄ⅷm第一法a，即卡爾-費休法測定，含水量為0.033%。
熾灼殘渣的測定采用《中國藥典》2010年版二部附錄ⅷn規(guī)定的方法，含量為0.028％。(無機金屬元素經(jīng)icp-ms(agilent7700x)測定總含量約為0.005％，可忽略不計，殘留溶劑乙酸乙酯采用氣相色譜法未檢出，說明低于檢出限7.68×10-6％，忽略不計)。