本發明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種定量檢測人源化PD-L1抗體的試劑盒，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
人源化PD-L1抗體能夠與部分腫瘤表面PD-L1位點結合，阻斷T細胞表面PD-1與腫瘤PD-L1結合，從而解除腫瘤細胞對T細胞免疫抑制作用，增強T細胞殺傷腫瘤細胞能力。現CUSABIO公司已經研發出夠檢測PD-L1濃度的Humman Programmed Death Ligand-1(PD-L1/CD274)ELISA試劑盒，并且其敏感性已經達到了3.9pg/mL，但隨著人們對腫瘤治療的研究，更多的研究人員從事了PD-L1抗體的開發與研制，現急需一種能夠檢測PD-L1抗體的方法來評估細胞表達的能力，本發明采用間接ELISA原理，以PD-L1蛋白為包被蛋白捕獲樣本中人源化PD-L1抗體，并依據標準品繪制的標準曲線計算出樣本中人源化PD-L1抗體的濃度。在本發明之前，尚未見定量檢測人源化PD-L1抗體試劑盒的相關報道，也未發現定量檢測人源化PD-L1抗體試劑盒在科研與生產中應用。
技術實現要素：
為探尋現階段對人源化PD-L1抗體含量檢測的快捷方法，方便從事相關研究人員對其濃度的測定，本發明提供了一種采用PD-L1蛋白包被ELISA板，以辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG抗體為標記物，放大樣本中人源化PD-L1抗體信號，通過標準品繪制標準曲線，根據樣本OD值間接得出樣品中人源化PD-L1抗體的濃度。
本發明解決其技術問題的技術方案是：一種測定人源化PD-L1抗體濃度的ELISA試劑盒，包括加樣板、洗滌濃縮液、標準品、標準品稀釋液、酶標抗體、酶標抗體稀釋液、底物顯色液、終止液。
上述的ELISA試劑盒，其中各種試液的組成及制備方法如下：
加樣板的制作：用0.05M碳酸鹽緩沖液將人PD-L1蛋白稀釋成0.25ug/mL濃度，ELISA板中每孔加入100uL后加蓋置于4℃環境中包被14h；將洗滌液加入到加樣孔孔中，每孔300uL，洗滌3次，每次5分鐘；稱取適量BSA(牛血清白蛋白)用洗滌液配成5％的封閉液，加入到加樣孔中，每孔300uL，加蓋后置于37℃封閉2小時；洗滌液洗滌，每孔300uL，每次5分鐘，洗3次；甩去洗滌液，室溫晾干后裝入鋁箔袋放入干燥劑后真空包裝，4℃保存。
洗滌濃縮液為：NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g定容至100mL，加入500uL吐溫-20，混勻分裝入瓶，每瓶20mL，4℃保存。
樣本稀釋液為：0.01M pH值7.2的PBS緩沖液，配方如下：稱取NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g溶解于800mL蒸餾水中，用鹽酸/氫氧化鈉調節pH值至7.2后定容至1L，加入500uL吐溫-20，混勻，分裝入瓶，每瓶30mL。
標準品為:人源化PD-L1抗體凍干粉配方及凍干方法，配方：50g/L BSA、PD-L1抗體250ug/L，分裝至小管中，每管1mL，冷凍后真空干燥，擰緊蓋子，4℃保存。
酶標抗體稀釋液配方為：：用0.01M pH值為7.2～7.4PBS配制2％的BSA溶液，吸取12mL至酶標抗體稀釋液瓶中，蓋蓋密封，4℃保存。
酶標抗體來源：購買自Solarbio公司的羊抗人IgG-HRP(貨號SE101)，吸取4uL加入到酶標抗體瓶中，加入100uL酶標抗體稀釋液混勻，蓋蓋密封，4℃保存。
底物顯色液為購自Solarbio的TMB底物顯色液(貨號：PR1200)，分裝至棕色瓶內，每瓶10mL，4℃避光保存。
終止液為2M硫酸溶液，配方如下，量取500mL蒸餾水至燒杯中，量取108.7mL濃硫酸(18M)，沿壁緩慢倒入水中，邊倒邊攪拌，量取200mL蒸餾水沖洗濃硫酸量杯，洗滌液緩慢導入硫酸溶液中，再用100mL蒸餾水洗滌一次，洗滌液倒入硫酸溶液中，冷卻至室溫后，倒入容量瓶，定容至1000mL，分裝到小瓶內，每瓶6mL，室溫保存。
根據上述的方法制備得到的ELISA試劑盒，使用方法如下：
1)將洗滌濃縮液瓶中加入180mL的蒸餾水混勻；標準品凍干粉中加入1mL樣品稀釋液，并作倍比稀釋S1～S7，S8為樣品稀釋液；酶標抗體用酶標抗體稀釋液進行120倍稀釋，4℃避光保存。
2)打開加樣板包裝，取出加樣板；
3)將待測樣品及標準品稀釋液加入到加樣孔中，每孔100uL，設置1～2平行對照，密封后置于37℃溫箱中孵育1h。
4)甩去液體，每孔加入300uL洗滌液，作用5min，重復3次；
5)甩去液體，每孔加入100uL酶標二抗液，密封后置于37℃孵育1h。
6)甩去液體，洗滌，步驟如4)；
7)每孔加入100uLTMB底物顯色液，密封后置于37℃溫箱顯色15～30分鐘；
8)每孔加入50uL硫酸終止液，5min中內用酶標儀讀取OD450nm值；
9)計算平均數，繪制標準曲線，將樣品OD450nm值帶入方程，求出濃度。
本發明的有益效果是，本發明ELISA試劑盒采用純凈PD-L1蛋白作為包被抗原，確保樣品中人源化PD-L1抗體能夠與包被蛋白發生特異性的結合，從而進一步被酶標抗體補獲，在這個過程中經歷了兩次抗原抗體結合的過程，大大提高了檢測的特異性；參照標準品倍比稀釋測定的OD450nm值-濃度曲線，可以計算出樣本內人源化PD-L1抗體濃度，方便研究人員對細胞表達人源化PD-L1抗體水平進行評定。
附圖說明
圖1為細胞上清中PD-L1抗體標準曲線圖
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露內容輕易地了解本發明的具體特點與功效。在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的專利保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案，還應理解實施例中出現的標準品OD450nm時，應理解，由于顯色時間的差異，標準品OD450nm值會有浮動，但不影響繪制標準曲線及對樣本的測定。
【實施例1】抗原包被板的制備
(1)使用包被液對PD-L1蛋白進行溶解，包被液為：PD-L1蛋白0.25ug/L、Na2CO3 1.59g/L、NaHCO3 2.93g/L，pH值9.6。
(2)在酶標板孔中加入包被溶液，每孔100uL，自封袋密封后置于4℃作用14h。
(3)甩去包被溶液，使用洗滌液進行洗滌，洗滌液為：
NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值＝7.4，洗滌方法為：每孔加入300uL洗滌液，室溫靜置5min，甩去后每孔再次加入300uL洗滌液，重復3次。
(4)使用封閉液進行封閉，封閉液為：BSA 50g/L，NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值7.4，封閉方法為：每孔加入封閉液300uL，密封后置于37℃溫箱中作用2h。
(5)洗滌，方法如(3)，拍干后同干燥劑一起真空封閉入鋁箔袋。4℃保存。
【實施例2】細胞轉染上清的測定
將人源化PD-L1抗體輕、重鏈基因重組質粒共轉染HEK293細胞，制備人源化PD-L1抗體上清液，加入到孔中，每孔100uL，設置兩個個平行孔，用標準品稀釋液稀釋標準品S1～S7,濃度為250ng/mL、125ng/mL……3.90625ng/mL，S8為標準品稀釋液，加入到孔中，每孔100uL，設置一個平行，采用常規ELISA步驟，封閉及洗滌過程液體為300uL，顯色20分鐘，OD450nm值如表1：
表1標準品稀釋液及樣品OD450nm值
繪制標準曲線如圖1，根據標準曲線方程求出細胞上清中PD-L1抗體濃度為81.584ng/mL。