牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明涉及牛奶中青霉素藥物的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物，是治療各種細(xì)菌感染性疾病使用最廣泛且高效的抗菌藥物之一，在人類的疾病治療和畜牧業(yè)養(yǎng)殖方面大量使用。然而，抗生素的濫用現(xiàn)象卻普遍存在，青霉素的濫用可以引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)和細(xì)菌耐藥性，甚至造成人的死亡。在畜牧養(yǎng)殖方面，青霉素藥物常常被用來預(yù)防和治療奶牛乳腺炎等疾病，因此在牛奶中會(huì)有青霉素殘留，對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在的危害。為了確保食品安全，開展食品中痕量青霉素藥物分子殘留的檢測(cè)研究是十分必要的，特別是牛奶中青霉素藥物分子的檢測(cè)。從傳統(tǒng)意義上講，牛奶中青霉素藥物殘留的分析方法主要有高效液相色譜法、生物傳感器法及熒光偏振分析法等。但是這些方法卻存在一些局限性。

在2002年第468期的《分析化學(xué)》(Analytica Chmica Acta)的文章《一種基于羧肽酶活性抑制的生物傳感器法定量檢測(cè)牛奶中的青霉素G》(Biosensor analysis of penicillin G in milk based on the inhibition of carboxypeptidase activity)公開了一種檢測(cè)牛奶中的青霉素G的方法。該方法利用的是具有羧肽酶活性的微生物受體蛋白作為探針分子，選擇性地檢測(cè)牛奶中具有活性、完整β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的青霉素G抗生素藥物。他們采用表面活性劑P-20及胺偶聯(lián)試劑盒對(duì)牛奶樣品進(jìn)行純化處理，其中使用多克隆抗體(R513)作為生物傳感器的特異性識(shí)別抗體對(duì)牛奶中的青霉素G(抗原)進(jìn)行選擇性定量檢測(cè)。通過這一技術(shù)，牛奶中青霉素G藥物的檢出限可以達(dá)到2.6μg kg^-1。這種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于不僅生物樣品制備過程復(fù)雜且不易保存，而且樣品前處理成本高且檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)。

2013年第141期的《食品化學(xué)》(Food Chemistry)報(bào)道了一種基于高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)同步檢測(cè)綿羊奶中的九種抗生素藥物的方法(An HPLC-DAD method for the simultaneous determination of nineβ-lactam antibiotics in ewe milk)，包括青霉素G、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢哌酮、氯唑西林、雙氯西林、苯唑西林及青霉素V。其中抗生素殘留的提取方法是通過乙腈離心和固相萃取(SPE)及0.45μm微孔濾膜過濾過程對(duì)綿羊奶樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化處理的。所有這些化合物的定量限(LOQs)均在3.4～8.6μg kg^-1范圍。這種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜，樣品前處理過程耗時(shí)且檢測(cè)成本高，大大限制了它在實(shí)際分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。

2014年第7期的《美國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)》(American Dairy Science Association)的文章《利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)牛奶中青霉素類藥物降解副產(chǎn)物的研究》(Research on degradation of penicillins in milk byβ-lactamase using ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectromety)，公開了采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在β-內(nèi)酰胺酶存在下通過研究牛奶中青霉素類藥物(包括青霉素G、青霉素V及氨芐青霉素)的降解副產(chǎn)物反過來定性分析牛奶中含有的青霉素類藥物的方法。該方法中加標(biāo)牛奶樣品的預(yù)處理操作如下：通過向2mL加標(biāo)牛奶樣品中直接添加10mL乙腈：水(v/v，3:1)混合液，在3050×g下離心10min，取出上清液在40℃氮?dú)饬飨逻M(jìn)行干燥得到固體殘余物，再將所獲得的殘余物溶解于2mL純化水中并使用0.45和0.22μm的混合纖維樹脂微孔濾膜進(jìn)行過濾。經(jīng)預(yù)處理后方可進(jìn)行下一步的檢測(cè)操作；預(yù)處理操作主要是為了去除牛奶中的蛋白質(zhì)等大分子干擾物質(zhì)。這種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于不僅不能進(jìn)行定量分析，而且操作步驟繁瑣、分析檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且成本高。

2016年第190期的《食品化學(xué)》(Food Chemistry)的文章《利用熒光偏振方法檢測(cè)牛奶中青霉素G的方法》(A novel fluorescence polarization assay for determination of penicillin G in milk)報(bào)道了一種基于青霉素G與適當(dāng)紅色染料共軛標(biāo)記生產(chǎn)的青霉素抗體(生物傳感器)定量檢測(cè)牛奶中痕量青霉素G的熒光偏振分析法。他們利用純化試劑盒對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理，使用羊抗兔多克隆抗體(二次抗體)作為牛奶中青霉素G藥物(抗原)的特異性識(shí)別抗體。該文獻(xiàn)所提出的熒光偏振分析方法可以直接用于牛奶中青霉素G的檢測(cè)而不受牛奶中其他物質(zhì)的干擾。通過這種方法，其檢出限可以達(dá)到1nmol/L，這要比歐盟(EU)規(guī)定的最大殘留量12.0nmol/L少。這種檢測(cè)方法利用純化試劑盒進(jìn)行前處理，使用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(二次抗體)構(gòu)建生物傳感器，實(shí)驗(yàn)成本大大增加。

到目前為止，基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)對(duì)牛奶中青霉素藥物分子進(jìn)行檢測(cè)的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，填補(bǔ)SERS技術(shù)在牛奶中青霉素藥物分子檢測(cè)方面的空白，為牛奶中青霉素類藥物分子及β-內(nèi)酰胺類藥物分子的分析檢測(cè)提供新的思路。

本發(fā)明的牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、制備具有SERS活性的銀納米粒子(Ag NPs)溶膠，然后利用層層自組裝技術(shù)在玻璃基片上制備Ag NPs組裝基底；

二、向待測(cè)牛奶樣品中添加有機(jī)物/水混合溶劑，超聲處理2～5min，再離心分離處理10～20min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入去離子水并超聲處理2～5min，再離心分離處理5～10min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，得到待測(cè)牛奶樣品上清液；

三、將組裝Ag NPs的玻璃基片放到待測(cè)牛奶樣品上清液中浸漬，然后將玻璃基片取出，用去離子水沖洗并自然晾干，得到待測(cè)牛奶樣品檢測(cè)片；

四、用拉曼光譜儀測(cè)試步驟三得到的待測(cè)牛奶樣品檢測(cè)片的表面增強(qiáng)拉曼光譜，將該光譜與青霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)牛奶樣品中青霉素藥物的定性檢測(cè)。

本發(fā)明將待測(cè)牛奶樣品通過水輔助溶劑兩步分離技術(shù)進(jìn)行前處理，然后用組裝Ag NPs玻璃基片浸漬，待測(cè)牛奶樣品中的青霉素藥物分子吸附在具有SERS活性的貴金屬銀納米粒子(Ag NPs)基底上，產(chǎn)生可識(shí)別的拉曼光譜信號(hào)，通過與青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的本體拉曼光譜比對(duì)，若牛奶樣品中出現(xiàn)青霉素的特征SERS信號(hào)峰，即認(rèn)定牛奶樣品中有青霉素藥物的存在，從而實(shí)現(xiàn)青霉素藥物的定性和痕量檢測(cè)；采用本方法不僅可以檢測(cè)牛奶中殘留的青霉素藥物，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的光譜比對(duì)，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素分解產(chǎn)物(如青霉噻唑酸、青霉酸等)進(jìn)行定性鑒別。

本發(fā)明首次將SERS技術(shù)應(yīng)用于牛奶中青霉素藥物的檢測(cè)，采用水輔助溶劑兩步分離技術(shù)去除牛奶中的大部分干擾物質(zhì)，減少了干擾組分對(duì)SERS信號(hào)的抑制(或掩蔽)，提高了SERS檢測(cè)的靈敏度，定性檢出限可以達(dá)到10^-7mol/L。檢測(cè)無需標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單；檢測(cè)快速，需要樣品量少而且易得，試劑水不產(chǎn)生干擾，是一種無損檢測(cè)方法，這種成本低廉、環(huán)境友好、方便快速的SERS檢測(cè)方法易于商業(yè)化應(yīng)用。

附圖說明

圖1是試驗(yàn)1中青霉素G濃度為1×10^-4mol/L的加標(biāo)牛奶樣品及對(duì)比測(cè)試樣品的SERS光譜和空白Ag NPs基底的拉曼光譜圖；

圖2是試驗(yàn)1中青霉素G濃度為1×10^-2mol/L的加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜及青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末和濃度為1×10^-1mol/L青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的拉曼光譜圖；

圖3是試驗(yàn)1中不同濃度青霉素G加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜；

圖4是試驗(yàn)1中加標(biāo)牛奶樣品的青霉素G濃度與峰強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5是試驗(yàn)2中不同濃度青霉素G加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜及青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末的拉曼光譜圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、制備具有SERS活性的銀納米粒子(Ag NPs)溶膠，然后利用層層自組裝技術(shù)在玻璃基片上制備Ag NPs組裝基底；

二、向待測(cè)牛奶樣品中添加有機(jī)物/水混合溶劑，超聲處理2～5min，再離心分離處理10～20min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入去離子水并超聲處理2～5min，再離心分離處理5～10min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，得到待測(cè)牛奶樣品上清液；

三、將組裝Ag NPs的玻璃基片放到待測(cè)牛奶樣品上清液中浸漬，然后將玻璃基片取出，用去離子水沖洗并自然晾干，得到待測(cè)牛奶樣品檢測(cè)片；

四、用拉曼光譜儀測(cè)試步驟三得到的待測(cè)牛奶樣品檢測(cè)片的表面增強(qiáng)拉曼光譜，將該光譜與青霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)牛奶樣品中青霉素藥物的定性檢測(cè)。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一中制備具有SERS活性的銀納米粒子(Ag NPs)溶膠，然后利用層層自組裝技術(shù)在玻璃基片上制備Ag NPs組裝基底的具體步驟如下：

a、將AgNO₃加入到裝有去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；繼續(xù)加熱，當(dāng)溶液升溫至98～100℃的沸騰狀態(tài)時(shí)加入濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，攪拌形成透明溶膠；透明溶膠在溫度為93～97℃的微沸狀態(tài)下保持50～60min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到銀溶膠；其中AgNO₃的質(zhì)量與濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液的體積的比是9mg：1mL；

b、將干凈玻璃基片先放在硫酸和雙氧水的混合溶液中煮沸1～2小時(shí)，然后用去離子水沖洗、N₂氣吹干，得到羥基化玻璃基片；再將該羥基化玻璃基片浸漬在質(zhì)量濃度為0.3～1％的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)水溶液中保持1～2h，取出后用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到PDDA衍生化的玻璃基片；再將PDDA衍生化的玻璃基片在銀溶膠中浸漬4～8h，取出用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到Ag NPs組裝基底。其它與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是步驟二中有機(jī)物/水混合溶劑是無水乙醇、氯仿與水的混合液；或者是無水乙醇、丙酮與水的混合液；其它與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三不同的是：步驟二中的混合液是由無水乙醇、氯仿與水按體積比為7：2：3混合而成的；或者由無水乙醇、丙酮與水按體積比為7：3：4混合而成的；其它與具體實(shí)施方式三相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟二中離心分離處理，離心速度為100～10000轉(zhuǎn)/秒；其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三中組裝Ag NPs的玻璃基片放在上清液中浸漬的時(shí)間為5～11小時(shí)；其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是：步驟四中拉曼光譜儀是HORIBA LabRam ARAMIS型，其激發(fā)光源的波長(zhǎng)為633nm；其它與具體實(shí)施方式一至六之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟四中，拉曼光譜儀采集信號(hào)的時(shí)間為3～5min；其它與具體實(shí)施方式一至七之一相同。

具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至八之一不同的是所述的青霉素為青霉素G、青霉素K或青霉素V；其它與具體實(shí)施方式一至八之一相同。

本實(shí)施方式的青霉素G、青霉素K和青霉素V均是包括一個(gè)β-內(nèi)酰胺環(huán)的典型青霉素類抗生素。

用以下的試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)1：牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將0.3564g青霉素G(PEN)藥物直接添加到無青霉素藥物的牛奶中并定容至10mL，獲得濃度為1×10^-1mol/L的PEN加標(biāo)牛奶母液，然后以無青霉素藥物的空白液態(tài)牛奶作為溶劑將加標(biāo)牛奶母液分別稀釋成一系列的所需濃度：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L，得到加標(biāo)牛奶樣品，將制備好的加標(biāo)牛奶樣品在4攝氏度的冷藏條件下儲(chǔ)存7天；該操作的目的是使待測(cè)樣品更接近于含有藥物殘留的真實(shí)牛奶樣品；

二、制備具有SERS活性的銀納米粒子(Ag NPs)溶膠，然后利用層層自組裝技術(shù)在玻璃基片上制備Ag NPs組裝基底；具體的操作步驟如下：a、將36mg AgNO₃加入到裝有200mL去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；當(dāng)溶液加熱至98℃的沸騰狀態(tài)時(shí)快速加入4mL濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，三口燒瓶中溶液由無色透明逐漸轉(zhuǎn)變成淡黃色、棕色，最終生成灰綠色的透明溶膠；透明溶膠在95℃的微沸狀態(tài)下保持50min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到銀溶膠；b、將干凈玻璃基片先放在硫酸和雙氧水的體積比為7：3的混合溶液中煮沸1.5小時(shí)，然后用去離子水沖洗、N₂氣吹干，得到羥基化玻璃基片；再將該羥基化玻璃基片浸漬在質(zhì)量濃度為0.5％的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)水溶液中保持1h，取出后用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到PDDA衍生化的玻璃基片；再將PDDA衍生化的玻璃基片在銀溶膠中浸漬4h，取出用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到Ag NPs組裝基底；

三、向各待測(cè)加標(biāo)牛奶樣品中添加由無水乙醇、氯仿與水按體積比為7：2：3混合而成的混合溶劑，超聲處理2min促進(jìn)溶解，再在離心速度為10000轉(zhuǎn)/秒的條件下離心分離10min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入去離子水4mL并超聲處理3min，再在離心速度為10000轉(zhuǎn)/秒的條件下離心分離處理5min后有沉淀析出，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，得到不同青霉素G濃度的待測(cè)加標(biāo)牛奶樣品上清液；

四、將組裝Ag NPs的玻璃基片放到不同青霉素G濃度的加標(biāo)牛奶樣品上清液中浸漬8小時(shí)，然后將玻璃基片取出，用去離子水沖洗三次并自然晾干，得到一系列不同青霉素G濃度的加標(biāo)牛奶樣品檢測(cè)片；

五、用HORIBA LabRam ARAMIS型拉曼光譜儀采集步驟四得到的一系列加標(biāo)牛奶樣品檢測(cè)片的光譜數(shù)據(jù)，激發(fā)光源的波長(zhǎng)為633nm，信號(hào)采集時(shí)間為5min，將該光譜與青霉素G藥物標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)牛奶樣品中青霉素G藥物的定性檢測(cè)。

本試驗(yàn)中，青霉素G濃度為1×10^-4mol/L的加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜圖如圖1中的曲線a所示，圖1中的曲線b是將組裝Ag NPs玻璃基片浸漬到未經(jīng)混合溶劑前處理的濃度為1×10^-4mol/L青霉素G加標(biāo)牛奶樣品中浸漬8小時(shí)，再將玻璃基片取出用去離子水沖洗三次并自然晾干，得到的對(duì)比測(cè)試樣品1的SERS光譜圖；c是經(jīng)混合溶劑前處理的空白牛奶樣品的SERS光譜；d是Ag NPs基底的拉曼光譜。從圖1可以看出，未經(jīng)前處理的1×10^-4mol/L加標(biāo)牛奶樣品在Ag NPs基底上不產(chǎn)生拉曼信號(hào)。而經(jīng)過混合溶劑前處理的加標(biāo)牛奶樣品則表現(xiàn)出了很強(qiáng)的拉曼信號(hào)強(qiáng)度和較低的背景干擾?？梢姡w積比為7：2：3的混合溶劑對(duì)加標(biāo)牛奶中青霉素G的拉曼信號(hào)增強(qiáng)有巨大貢獻(xiàn)。

本試驗(yàn)中，青霉素G濃度為1×10^-2mol/L的加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜圖如圖2中的曲線c所示，圖2中的a為青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末的本體拉曼光譜，圖2中的b為濃度為1×10^-1mol/L青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的本體拉曼光譜。從圖2中的c可以看出，青霉素G的特征SERS信號(hào)峰出現(xiàn)在1000cm^-1處，歸屬于β-內(nèi)酰胺環(huán)的特征振動(dòng)。通過與青霉素G固體粉末及水溶液的本體拉曼光譜對(duì)比，可以指認(rèn)加標(biāo)牛奶樣品中的青霉素G在Ag NPs組裝基底上的SERS光譜，證明本試驗(yàn)?zāi)軌蚨ㄐ澡b別牛奶中殘留的青霉素G藥物分子；也可以通過青霉噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖判斷殘留的青霉素G藥物分子是否發(fā)生了分解反應(yīng)并產(chǎn)生了對(duì)人體有致命危害的青霉噻唑酸等衍生物。

本試驗(yàn)中，青霉素G濃度分別為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L的加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜如圖3所示。圖3中濃度由上到下的a～h曲線依次對(duì)應(yīng)著濃度為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L的樣品，從圖3可以看出，隨著牛奶待測(cè)樣品中加標(biāo)物青霉素G濃度的變化，加標(biāo)物的拉曼峰強(qiáng)度也隨之變化。由拉曼峰強(qiáng)度隨加標(biāo)牛奶樣品青霉素G濃度的變化可以對(duì)牛奶樣品中青霉素G的含量進(jìn)行痕量檢測(cè)?？梢?，本試驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中殘留的青霉素G藥物進(jìn)行痕量SERS檢測(cè)。通過本方法，牛奶中青霉素G殘留的最低檢出限達(dá)到1×10^-7mol/L。另外，在青霉素G1×10^-3～1×10^-7mol/L濃度范圍內(nèi)，以拉曼位移1000cm^-1處的峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以加標(biāo)牛奶中青霉素G濃度為橫坐標(biāo)作圖，可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)牛奶樣品中青霉素G濃度的定量檢測(cè)。

試驗(yàn)2：牛奶中青霉素藥物的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將0.3564g青霉素G(PEN)藥物直接添加到無青霉素藥物的牛奶中并定容至10mL，獲得濃度為1×10^-1mol/L的PEN加標(biāo)牛奶母液，然后以無青霉素藥物的空白液態(tài)牛奶作為溶劑將加標(biāo)牛奶母液分別稀釋成一系列的所需濃度：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L，得到加標(biāo)牛奶樣品，將制備好的加標(biāo)牛奶樣品在4攝氏度的冷藏條件下儲(chǔ)存7天使待測(cè)樣品更接近于含有藥物殘留的真實(shí)牛奶；

二、制備具有SERS活性的銀納米粒子(Ag NPs)溶膠，然后利用層層自組裝技術(shù)在玻璃基片上制備Ag NPs組裝基底；具體的操作步驟如下：a、將36mg AgNO₃加入到裝有200mL去離子水的三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱使其溶解；當(dāng)溶液加熱至98℃的沸騰狀態(tài)時(shí)快速加入4mL濃度為1％的檸檬酸鈉水溶液，三口燒瓶中溶液由無色透明逐漸轉(zhuǎn)變成淡黃色、棕色，最終生成灰綠色的透明溶膠；透明溶膠在95℃的微沸狀態(tài)下保持50min，然后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到銀溶膠；b、將干凈玻璃基片先放在硫酸和雙氧水的體積比為7：3的混合溶液中煮沸1.5小時(shí)，然后用去離子水沖洗、N₂氣吹干，得到羥基化玻璃基片；再將該羥基化玻璃基片浸漬在質(zhì)量濃度為0.5％的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)水溶液中保持1h，取出后用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到PDDA衍生化的玻璃基片；再將PDDA衍生化的玻璃基片在銀溶膠中浸漬4h，取出用水沖洗干凈，并用N₂吹干，得到Ag NPs組裝基底；

三、向各加標(biāo)牛奶樣品中添加由無水乙醇、丙酮與水按體積比為7：3：4混合而成的混合溶劑，超聲處理3min促進(jìn)溶解，再在離心速度為8000轉(zhuǎn)/秒的條件下離心分離10min，移出上清液在室溫下自然蒸發(fā)至干得到殘余物；再向殘余物中加入去離子水4mL并超聲處理3min，再在離心速度為8000轉(zhuǎn)/秒的條件下離心分離處理5min后有沉淀析出，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，得到一系列不同待測(cè)加標(biāo)牛奶樣品上清液；

四、將組裝Ag NPs的玻璃基片放到不同青霉素G濃度的加標(biāo)牛奶樣品上清液中浸漬10小時(shí)，然后將玻璃基片取出，用去離子水沖洗三次并自然晾干，得到一系列不同的加標(biāo)牛奶樣品檢測(cè)片；

五、用HORIBA LabRam ARAMIS型拉曼光譜儀采集步驟四得到的加標(biāo)牛奶樣品檢測(cè)片的光譜數(shù)據(jù)，激發(fā)光源的波長(zhǎng)為633nm，信號(hào)采集時(shí)間為5min；將該光譜與青霉素G藥物標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)牛奶樣品中青霉素藥物的定性檢測(cè)。

本試驗(yàn)中，青霉素G濃度分別為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L的加標(biāo)牛奶樣品的SERS光譜如圖5中的a～h所示，圖5中I為青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末的本體拉曼光譜。圖5中濃度由上到下的a～h曲線依次對(duì)應(yīng)著濃度為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8mol/L的樣品，可以看出，青霉素G的特征SERS信號(hào)峰出現(xiàn)在1000cm^-1處，歸屬于β-內(nèi)酰胺環(huán)的特征振動(dòng)。通過與青霉素G固體粉末的本體拉曼光譜對(duì)比，可以指認(rèn)加標(biāo)牛奶樣品中的青霉素G在Ag NPs組裝基底上的SERS光譜，證明本試驗(yàn)?zāi)軌蚨ㄐ澡b別牛奶中殘留的青霉素G藥物的存在，牛奶中青霉素G殘留的最低檢出限達(dá)到1×10^-7mol/L。本發(fā)明專利得到了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21473078)資助。