一種基于量子點的CA199免疫層析試紙條的制備方法與流程

本發明涉及檢測探針制備技術領域，更具體的是涉及一種基于量子點的CA199免疫層析試紙條的制備方法。

背景技術：

免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。

免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl₄)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。但膠體金免疫層析技術存在不能嚴格定量這一致命缺陷，所有目前大多數學者將層析技術的目光轉移到熒光檢測上。作為一種新穎的半導體納米材料，量子點具有許多獨特的納米性質，因此在免疫層析領域也獨樹一幟。

CA199是胰腺癌和結、直腸癌的標志物。血清CA199陽性的臨界值為37kU/L。胰腺癌患者85％-95％為陽性。腫瘤切除后CA199濃度會下降，再上升，則可表示復發。結直腸癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌和胃癌的陽性率也很高，若同時檢測CEA和AFP可進一步提高陽性檢測率。良性疾患時如胰腺炎和黃疸，CA199濃度也可增高，但往往呈“一過性”，而且其濃度多低于120kU/L，必須加以鑒別。腫瘤標志物可以對高危人群進行篩查，通過檢測腫瘤患者治療前后腫瘤標志物的濃度變化可以判斷對腫瘤的治療是否有效。對生物體內的腫瘤標志物實現高靈敏度的檢測是生命科學領域研究的一項重要課題，發展一種新的靈敏度高的檢測方法也成為研究者們努力的目標。目前量子點因具有優異的光學性質已經被廣泛應用于示蹤、成像以及標記等方面,而免疫層析試紙條檢測則因為它的簡單迅速、價格低廉、可以隨時隨地等優點在檢測領域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制CA199量子點免疫熒光試紙條，對CA199腫瘤標志物進行檢測，建立CA199腫瘤標志物檢測的新方法。

技術實現要素：

鑒于腫瘤標志物在腫瘤檢測中的重要地位、量子點這種納米粒子獨特的光學性質以及層析技術簡便和價格方面的優勢。我們將結合量子點和免疫層析試紙條兩種技術，利用量子點羧基和腫瘤標志物相應抗體的氨基反應，制得量子點熒光探針。探針、腫瘤標志物和包埋在試紙條的另一種腫瘤標志物抗體通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結構。對腫瘤標志物CA199進行定性定量的檢測，建立腫瘤標志物檢測的新方法，致力于簡單迅速、價格低廉、定性定量、操作簡便的消化系統腫瘤早期診斷方法。

本發明的技術方案如下：

一種基于量子點的癌胚抗原免疫層析試紙條的制備方法；其步驟如下：

1)將量子點QDs、EDC和PBS緩沖液加入反應器，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199抗體和步驟1)得到的免疫量子點混合，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白封閉QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

所述QDs：EDC摩爾質量分數配比為1:4000～10000。

所述QDs和CA199抗體摩爾質量份數比＝1:10～50。

所述PBS緩沖液用以充當反應溶劑和保持CA199抗體的活性。

所述偶聯抗體時間優選2～3h。

所述處理液是蔗糖Sugar、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯Tween-20的混合溶液。

通過EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)的活化作用，量子點的羧基和CA199標記抗體Ab₁(分子量150000～200000)的氨基生成牢固的化學鍵，離心純化后分散在含牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，得到QDs-Ab₁的熒光探針。如圖4所示，將CA199包被抗體Ab₂均勻噴在硝酸纖維素膜上作為檢測線T，而將羊抗鼠抗體Ab₃硝酸纖維素膜上作為質控線C。將試紙條的四個部分樣品墊、結合墊、吸水墊以及硝酸纖維素膜組裝的一起，最后得到CA199量子點免疫層析試紙條。滴加檢測樣品到樣品墊上，檢測樣品會在吸水墊的層析作用下向前移動：如果檢測樣品有Ag(CA199抗原)存在，探針QDs-Ab₁、CA199和包埋在硝酸纖維素膜上的CA199包被抗體Ab₂通過抗體抗原之間的作用，在T線上形成一種類似夾心的結構QDs-Ab₁-Ag-Ab₂，而在C線上形成QDs-Ab₁-Ab₃的結構，此時T線和C線同時亮；如果檢測樣品沒有Ag存在，則探針QDs-Ab₁僅僅和包埋在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠抗體，形成QDs-Ab₁-Ab₃的結構，此時C線亮而T線不亮。

如圖1量子點改性前后電鏡照片顯示，量子點分散均一，適合偶聯抗體完成免疫實驗；如圖2所示通過自主研發的量子點免疫熒光檢測儀，分別檢測各個試紙條檢測線和質控線上量子點的熒光強度，選擇二者的比值作為參數進行比較，發現CA199組T/C可以達到1.1，而其余幾組T/C均低于0.2，可以看出量子點免疫熒光試紙條的非特異性吸附很低，可以忽略，這也表明這種試紙條可以用于檢測。以CA199的濃度作為橫坐標，以對應的每個濃度下檢測到的T/C的值作為為縱坐標時，可以擬合出一條呈多項式的標準曲線，如圖3所示，R²＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10^-4x²+6.82*10^-7x³。

本發明制備的新型基于量子點的免疫層析試紙條優勢在于：

1.采用量子點這種具有優異的光學性質，已經被廣泛應用于示蹤、成像以及標記等方面的納米材料作為探針熒光來源，將納米技術應用到腫瘤檢測領域。

2.采用免疫層析技術作為檢測用的基材，免疫層析技術因為它的簡單迅速、價格低廉、可以隨時隨地等優點在檢測領域處于特殊重要的地位。

3.采用量子點的羧基和抗體的氨基之間的反應形成的牢固的化學鍵，而非傳統的靜電吸附作用，提高了試紙條抵抗非特異性吸附的能力，量子點熒光強度和CA199抗原濃度之間的線性關系可同時實現定性定量檢測。

附圖說明

圖1本發明制備的基于量子點的CA199試紙條的量子點透射電鏡照片，(a)為改性前量子點透射電鏡照片；(b)為改性后量子點透射電鏡照片。

圖2本發明制備的基于量子點的CA199試紙條的特異性實驗結果，(a)為CA199試紙條特異性實驗圖譜；(b)為CA199試紙條特異性實驗紫外燈照片。

圖3本發明制備的基于量子點的CA199試紙條的靈敏度測試，(a)為CA199試紙條標準曲線；(b)為CA199試紙條標準曲線紫外燈照片。

圖4本發明制備的基于量子點的CA199試紙條的檢測示意圖。

具體實施方式

下面的實施案例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。

實施案例1：

1)將質量分數配比為1：4000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。在10個試紙條的樣品墊分別滴加濃度為1.56kU/L、3.125kU/L、6.25kU/L、12.5kU/L、20kU/L、25kU/L、50kU/L、75kU/L、100kU/L和150kU/L的CA199抗原。

以CA199的濃度作為橫坐標，以對應的每個濃度下檢測到的T/C的值作為為縱坐標時，可以擬合出一條呈多項式的標準曲線，如圖3所示，R²＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10^-4x²+6.82*10^-7x³。

實施案例2：

1)將質量分數配比為1：4000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：30)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。在8個試紙條的樣品墊分別滴加濃度為150kU/L的PSA、CEA、BSA、CA125、CA153、HCG、AFP和CA199抗原。

通過自主研發的量子點免疫熒光檢測儀，分別檢測各個試紙條檢測線和質控線上量子點的熒光強度，選擇二者的比值作為參數進行比較，如圖2所示，發現CA199組T/C可以達到1.1，而其余幾組T/C均低于0.2，可以看出量子點免疫熒光試紙條的非特異性吸附很低，可以忽略，這也表明這種CA199量子點試紙條可以用于檢測。

實施案例3：

1)將質量分數配比為1：4000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：50)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

實施案例4：

1)將質量分數配比為1：6000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

實施案例5：

1)將質量分數配比為1：8000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

實施案例6：

1)將質量分數配比為1：10000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

實施案例7：

1)將質量分數配比為1：4000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體2.5h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。

實施案例8：

1)將質量分數配比為1：4000的量子點QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應器，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到免疫量子點；

2)將CA199標記抗體和上述免疫量子點混合(量子點和CA199標記抗體質量分數配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上偶聯抗體3h，離心得到QDs-CA199標記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標記抗體熒光探針上未反應的羧基，同時用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結合墊組裝在一起，得到CA199量子點免疫層析試紙條。