一種同時測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮的方法與流程

本發明涉及一種同時測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮的方法，屬于檢測方法技術領域。

背景技術：

沉香為瑞香科植物沉香或白木香含有樹脂的木材，主產于中國、日本、印度以及其他東南亞國家，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥，是我國愈百種中成藥的主要組方原料藥材。除藥用外，沉香還是名貴的天然香料和熏香原料，市場需求巨大。但在自然界中，只有當沉香屬植物受到刺激或損傷時，才會產生沉香，結香過程往往需要幾十年甚至上百年時間，隨著生態環境破壞和沉香資源的過度采伐，沉香屬植物資源日漸枯竭，現被列為國家二級保護野生植物，并載入《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》，因此遠遠不能滿足市場的需求，導致沉香價格逐年攀升。目前市售沉香藥材良莠不齊，存在大量的沉香劣質品，甚至是偽品或白木香木材浸泡香料、涂炭后加工而成的假藥以及有香味的樹材如柏木等充代，嚴重影響醫療效果。

沉香中主要含有色酮類、芳香族類和倍半萜類等成分，有文獻對125個沉香品、其他25種有香味的樹材及健康的沉香樹材進行檢測，結果證明只有沉香中才能檢測到色酮類成分沉香四醇和芳香族成分芐基丙酮。由此可知，沉香四醇和芐基丙酮是沉香的特征成分，其含量可作為沉香真偽鑒定和質量評價的重要依據。因此，2015年版《中國藥典》規定沉香中沉香四醇含量不小于0.10％。

目前，測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮含量的方法分別為液相色譜法和氣相色譜法，但尚無同時測定沉香中兩種化合物的方法。雖然液相色譜法和氣相色譜法具有較強的分離分析能力，但它們只能定量的測定產品中各個組分含量，對于快速、準確地定性鑒別卻存在一定的局限性，且使用液相色譜分析溶劑消耗大，檢測成本高。本發明采用氣相色譜-串聯質譜方法，能夠同時準確、快速、方便地測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮含量。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種既能快速、準確定性鑒別,又能同時測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮的方法。本發明方法采用氣相色譜-質譜聯用檢測方法，具有操作簡單，靈敏度高，重復性好，目標化合物同時測定的優點。

本發明為實現上述目的，采用以下技術方案：

本發明所使用的測量儀器和設備為：氣相色譜-質譜聯用儀，超聲波清洗機，電子天平。

一種同時測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮的方法，其特征在于包括以下步驟：

a、制備待測樣品溶液：將沉香樣品用超純水洗凈晾干，粉碎后過三號篩，準確稱取0.3g于置于塞錐形瓶中，精確到0.0001g，精密加入甲醇12～15mL，稱定重量，浸泡1h，頻率40kHz，功率300W超聲處理50min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足損失的重量，搖勻，離心，靜置，取上層清液即得樣品溶液，待測，同時做空白溶液；

b、制備標準工作溶液：用甲醇配制具有濃度梯度的沉香四醇和具有濃度梯度的芐基丙酮混合標準工作溶液，其中沉香四醇的濃度范圍為20～200μg/mL，芐基丙酮的濃度范圍為0.5～5μg/mL；

c、氣相色譜-質譜分析：利用氣相色譜-質譜聯用儀對標準工作溶液、空白溶液和樣品溶液進行分析檢測，得到相關色譜圖，以樣品溶液與標準工作溶液中目標物的保留時間和特征離子豐度比進行定性分析，以外標法進行定量分析；

其中所述的氣相色譜-質譜條件為：

色譜柱：HP-5MS毛細管柱，30m×0.25mm×0.25μm；進樣方式：不分流進樣，進樣口溫度：250℃；載氣：He，99.999％，柱流量1.2mL/min；柱溫采用程序升溫：初始溫度40℃，保持1min，以10℃/min升至210℃，保持1min，再以2℃/min升至220℃，保持1min，再以8℃/min升至300℃，保持4min；進樣量：1μL；

質譜條件為：離子源溫度：250℃；電離模式：電子轟擊電離；質譜傳輸線溫度280℃；溶劑延遲時間3.0min；

掃描方式:選擇性離子監測掃描(SIM)，對每個離子的監控時間為50ms；

d.繪制標準曲線及結果計算：將標準工作溶液引入氣相色譜-質譜聯用儀，以外標法進行定量分析，將目標化合物定量離子的峰面積與目標化合物的濃度進行線性回歸分析，得到標準曲線線性回歸方程，相關系數需不小于0.999；對制備的樣品溶液進行測定，測得樣品溶液中目標化合物的峰面積，代入一元線性回歸方程得到樣品溶液中目標化合物的含量，再根據以下計算公式(1)和計算公式(2)換算分別求得樣品中沉香四醇和芐基丙酮的含量：

計算公式(1)為：

$X_1=\frac{(C-C_0)\×V}{M\×10000}\mathrm{...}\left(1\right)$

計算公式(2)為：

$X_2=\frac{(C-C_0)\×V}{M}\mathrm{...}\left(2\right)$

式中：

X₁——樣品中沉香四醇的含量，單位為％；

X₂——樣品中芐基丙酮的含量，單位為mg/kg；

C——樣品溶液中目標化合物的濃度，單位為μg/mL；

C₀——空白溶液中目標化合物的濃度，單位為μg/mL；

V——樣品溶液定容體積，單位為毫升(mL)；

M——樣品稱取的質量，單位為g。

根據公式計算時，以兩次平行測定結果的平均值為最終測定結果，結果保留3位有效三數字。

本發明所針對的沉香包括進口沉香、國產沉香和采用人工結香技術生產的沉香。

本發明在制備標準工作溶液時，沉香四醇的梯度濃度為20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL，芐基丙酮的梯度濃度為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。具體制備方法為：

準確稱取0.1g芐基丙酮標準品，精確至0.1mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1mg/mL的芐基丙酮標準儲備液Ⅰ；準確稱取0.02g沉香四醇標準品，精確至0.1mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，同時準確移取0.500mL芐基丙酮標準儲備液Ⅰ置于同一10mL容量瓶中并定容，配制成混合標準儲備液Ⅱ，其中沉香四醇和芐基丙酮的濃度分別為2mg/mL和50μg/mL；準確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的混合標準儲備液Ⅱ，分別置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得標準工作溶液。

本發明中，選擇性離子監測掃描時，沉香四醇和芐基丙酮定量、定性離子及其豐度比見下表1：

表1：沉香四醇和芐基丙酮定量及定性選擇離子表

本發明在繪制標準曲線及結果計算中，樣品中目標化合物和標準品的選擇離子色譜峰在相同保留時間處(±0.5％)出現，并且對應質譜碎片離子的質荷比與標準品一致，其豐度比與標準品相比應符合：

相對豐度＞50％時，允許±10％偏差；

相對豐度20％～50％時，允許±15％偏差；

相對豐度10％～20％時，允許±20％偏差；

相對豐度≤10％時，允許±50％偏差；此時可確證目標分析物。

本發明比較了超聲和加熱回流二種提取方式，結果表明以甲醇為提取溶劑，超聲50min提取的目標物含量和加熱回流5h提取的目標物含量基本一致。超聲提取方法快速高效，且可在常溫操作，故選擇超聲提取方式。

本發明在待測樣品溶液的制備過程中選擇甲醇作為提取溶劑，與乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、環己烷、無水乙醚、石油醚相比，甲醇的提取效率最優。故優選甲醇作為提取溶劑。

本發明考察了樣品破碎度對測定結果的影響，結果表明當粒徑小于三號篩后，減小粒徑，樣品中目標化合物的測定結果無顯著變化，且測定結果的相對標準偏差小于5％，樣品均勻性能夠滿足本發明的測定要求。因此，本發明優選樣品前處理時過三號篩。

本發明在待測樣品溶液的制備過程中考察了溶劑用量對測定結果的影響，結果表明在溶劑用量為12～15mL的情況下，提取效率較好，再增加溶劑用量，提取效率變化不大。故從節約成本的角度考慮選擇溶劑用量為12～15mL。

本發明在待測樣品溶液的制備過程中考察了提取時間對測定結果的影響，結果表明提取時間超過50min，提取效率相差不大。故從節約時間的角度考慮選擇提取時間為50min。

本發明選擇了適宜的標準工作溶液范圍，適用于沉香中沉香四醇和芐基丙酮的測定。

本發明在氣相色譜-質譜分析過程中，為了獲得更佳的分離效果，并且避免其它組分對芐基丙酮和沉香四醇造成干擾，經多次調試優化，選擇了210℃前和220℃后升溫較快，210℃～220℃之間升溫較慢的升溫程序進行檢測。

本發明中，首先通過全掃描方式(SCAN)獲得芐基丙酮和沉香四醇標準品的保留時間和全掃描譜圖，再分別提取芐基丙酮和沉香四醇的質譜圖，并結合質譜圖碎片離子的相關信息，確定目標化合物的定性定量離子。

與現有技術相比，本發明有如下優點：

本發明提供了一種氣相色譜-質譜聯用測定沉香中沉香四醇和芐基丙酮的方法，該檢測方法具有操作快速，簡單易行，目標物可同時測定等優點，適用于沉香中沉香四醇和芐基丙酮的測定。

本發明為了得到合適的前處理條件，對提取方式、提取溶劑、樣品破碎度、溶劑用量和提取時間進行優化和選擇，并采用能同時給出定性和定量信息的氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS)作為檢測儀器，對沉香樣品中的沉香四醇和芐基丙酮進行測定，結果表明標準曲線線形關系良好，沉香四醇的檢出限為80mg/kg，相對標準偏差為3.47％，平均加標回收率在92.6％～97.5％之間，芐基丙酮的檢出限為2mg/kg，相對標準偏差為4.04％，平均加標回收率在之間94.7％～103％，這表明本方法靈敏度高，重復性好，回收率高。

【附圖說明】

圖1是標準工作溶液的色譜圖；

圖2是空白溶液的色譜圖；

圖3是樣品溶液的色譜圖；

圖4是標準工作溶液的全掃描色譜圖；

圖5是沉香四醇提取離子質譜圖；

圖6是芐基丙酮提取離子質譜圖。

【具體實施方式】

以下結合具體實施方式對本發明做進一步更詳細的說明。

實施例1：

主要儀器和試劑：

TSQ Quantum XLS系列氣相色譜-質譜聯用儀及其工作站(美國賽默飛世爾公司)；UA22MFD超聲波清洗機(中國WIGGENS公司)；SIGMA 2-16K臺式離心機(德國sartoriussigma公司)；CP 225D型電子天平(感量：0.0001g，北京賽多利斯公司)。

沉香四醇標準品(96.8％，中國食品藥品檢定研究院)，芐基丙酮標準品(98.0％，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、環己烷、無水乙醚、石油醚(色譜醇，德國Merck公司)。所有用水均為超純水(電阻率小于18.2μs/cm)。

制備待測樣品溶液：

將沉香樣品用超純水洗凈晾干，粉碎后過三號篩，準確稱取0.3g置于具塞錐形瓶中，精確到0.0001g。精密加入甲醇15mL，稱定重量，浸泡1h，超聲處理(頻率40kHz，功率300W)50min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足損失的重量，搖勻，離心，靜置，取上層清液即得樣品溶液，待測，同時做空白試驗。

制備標準工作溶液：

準確稱取0.1020g芐基丙酮標準品，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1mg/mL的芐基丙酮標準儲備液Ⅰ；準確稱取0.0207g沉香四醇標準品，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，同時準確移取0.500mL芐基丙酮標準儲備液Ⅰ置于同一10mL容量瓶中并定容，配制成混合標準儲備液Ⅱ，其中沉香四醇和芐基丙酮的濃度分別為2mg/mL和50μg/mL；準確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的混合標準儲備液Ⅱ，置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得標準工作溶液，其中沉香四醇的梯度濃度為20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL，芐基丙酮的梯度濃度為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。

氣相色譜-質譜分析：

利用氣相色譜-質譜聯用儀對標準工作溶液、空白溶液和樣品溶液進行分析檢測，得到相關色譜圖，見圖1、圖2和圖3，圖中橫坐標表示保留時間，縱坐標表示響應值。以樣品溶液與標準工作溶液中目標物的保留時間和特征離子豐度比進行定性分析，以外標法進行定量分析，所述的氣相色譜-質譜條件為：

色譜柱：HP-5MS毛細管柱，30m×0.25mm×0.25μm；進樣方式：不分流進樣，進樣口溫度：250℃；載氣：He，99.999％，柱流量1.2mL/min；柱溫采用程序升溫：初始溫度40℃，保持1min，以10℃/min升至210℃，保持1min，再以2℃/min升至220℃，保持1min，再以8℃/min升至300℃，保持4min；進樣量：1μL；

質譜條件為：離子源溫度：250℃；電離模式：電子轟擊電離；質譜傳輸線溫度280℃；溶劑延遲時間3.0min；

掃描方式為選擇離子監測掃描(SIM)，其中沉香四醇和芐基丙酮定量、定性離子及其豐度比見表1，對每個離子的監控時間為50ms。

繪制標準曲線并計算結果：

將標準工作溶液引入氣相色譜-質譜聯用儀，以外標法進行定量分析，將目標化合物的峰面積與目標化合物的濃度進行線性回歸分析，得到標準曲線線性回歸方程，相關系數需不小于0.999；對制備的樣品溶液進行測定，測得樣品溶液中目標化合物的峰面積，代入一元線性回歸方程得到樣品溶液中目標化合物的含量，根據以下計算公式(1)和計算公式(2)換算分別求得樣品中沉香四醇和芐基丙酮的含量：

計算公式(1)為：

$X_1=\frac{(C-C_0)\×V}{M\×10000}\mathrm{...}\left(1\right)$

計算公式(2)為：

$X_2=\frac{(C-C_0)\×V}{M}\mathrm{...}\left(2\right)$

式中：

X₁——樣品中沉香四醇的含量，單位為％；

X₂——樣品中芐基丙酮的含量，單位為mg/kg；

C——樣品溶液中目標化合物的濃度，單位為μg/mL；

C₀——空白溶液中目標化合物的濃度，單位為μg/mL；

V——樣品溶液定容體積，單位為mL；

M——樣品稱取的質量，單位為g；

以兩次平行測定結果的平均值為最終測定結果，結果保留3位有效三數字。

本發明方法的線性范圍，檢出限和定量限：

將標準工作溶液引入氣相色譜-質譜聯用儀，以外標法進行定量分析，將目標化合物的峰面積與目標化合物的濃度進行線性回歸分析，得到標準曲線線性范圍、回歸方程、相關系數，另根據標準工作溶液進樣后各組分定量離子的譜圖，同時結合樣品溶液譜圖，再以三倍信噪比(S/N＝3)計算檢出限，經計算評估得出芐基丙酮和沉香四醇的檢出限。結果見表2。

表2：線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限

本發明方法精密度和回收率試驗：

平行稱取沉香樣品7份，按上述方法進行7次獨立試驗，測量結果的相對標準偏差(RSD)即為方法精密度，沉香四醇和芐基丙酮的RSD分別為3.47％和4.04％。另平行稱取可沉香樣品9份，分別進行高、中、低3個濃度水平的加標回收試驗，目標化合物的平均回收率在92.6％～103％之間，其結果列于表3。

表3：方法精密度和回收率

前處理條件的優化和選擇：

一、為了得到合適的前處理條件，對提取方式、提取溶劑、樣品破碎度、溶劑用量和提取時間進行優化和選擇。

1.提取方式的優化和選擇：

本發明比較了超聲和加熱回流二種提取方式，結果表明以甲醇為提取溶劑，超聲50min提取的目標化合物含量和加熱回流5h提取的目標物測定值基本一致。因超聲提取方法快速高效，且可在常溫操作，故選擇超聲提取方式，詳見表4。

表4：提取方式的優化和選擇

2.提取溶劑的優化和選擇：

本發明分別用甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、環己烷、無水乙醚和石油醚作為提取溶劑，對樣品進行檢測。測定結果表明，甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯對沉香四醇的提取效率明顯高于丙酮、乙腈、環己烷、無水乙醚和石油醚，且當選擇甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取溶劑時，沉香四醇的測定結果無明顯差異；甲醇和丙酮對芐基丙酮的提取效率明顯高于乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、環己烷、無水乙醚和石油醚，且當選擇甲醇和丙酮作為提取溶劑時，芐基丙酮的測定結果無明顯差異。因此，優選甲醇作為本發明的提取溶劑。詳見表5。

表5：提取溶劑的優化和選擇

注:：“ND”表示目標化合物未檢出。

3.樣品破碎度的優化和選擇：

將沉香樣品粉碎，分別過一號篩、二號篩、三號篩、四號篩后，按上述方法進行檢測。從表6可知，當粒徑大于三號篩時，測定結果的相對標準偏差(RSD)過大，檢測結果的重復性不能滿足本發明的測定要求，而當粒徑小于三號篩時，樣品均勻性增加，測定結果的RSD小于5％，能夠滿足本發明的測定要求。當粒徑小于三號篩時，對過三號篩、四號篩后的樣品進行測定，目標化合物的測定結果無明顯差異。因此，本發明優選樣品前處理時過三號篩。

表6：樣品粉碎度的優化和選擇

4.溶劑用量的優化和選擇：

本發明在沉香樣品中分別精密加入甲醇6、9、12、15、18mL進行檢測。測定結果表明，當甲醇用量超過9mL后，增加甲醇用量，沉香四醇的測定結果仍有增加，而芐基丙酮的測定結果無明顯變化；當甲醇用量超過12mL后，增加甲醇用量，沉香四醇和芐基丙酮的測定結果均無明顯變化，故從節約成本的角度考慮，選擇溶劑用量為12～15mL。詳見表7。

表7：溶劑用量的優化和選擇

5.提取時間的優化和選擇：

本發明在待測樣品溶液的制備過程中，分別超聲30、40、50、60、70min進行檢測。測定結果表明，當提取時間超過40min后，增加提取時間，沉香四醇的測定結果仍有增加，而芐基丙酮的測定結果無明顯變化；當提取時間超過50min后，增加提取時間，沉香四醇和芐基丙酮的測定結果均無明顯變化，故從節約時間的角度考慮，選擇提取時間為50min。詳見表8。

表8：提取時間的優化和選擇

二、氣相色譜--質譜聯用儀參數的優化和選擇：

為了得到合適的氣相色譜--質譜聯用儀參數，對升溫程序、定性離子及定量離子進行優化和選擇。

1.升溫程序優化：

實際樣品檢測時，當升溫速度較快時，210℃左右有很多芳香族組分和倍半帖組分集中出峰，保留時間較接近，為了獲得更佳的分離效果，并且避免其它組分對沉香四醇和芐基丙酮造成干擾，經多次調試優化，本發明選擇了210℃前和220℃后升溫較快，210℃～220℃之間升溫較慢的升溫程序進行檢測。

2.定性定量離子的優化和選擇：

本發明中，首先通過全掃描方式(SCAN)獲得沉香四醇和芐基丙酮的全掃描譜圖，見圖4，圖中橫坐標表示保留時間，縱坐標表示響應值；再分別提取芐基丙酮和沉香四醇的質譜圖，分別見圖5和圖6，圖中橫坐標表示質量數，縱坐標表示豐度。根據質譜圖中的碎片離子選擇豐度相對較高、質量數較大以及干擾少的特征離子碎片，最終確定目標化合物的定性定量離子，見表1。

實施例2：

根據實施例1所述的測定方法，對10批市售沉香樣品進行檢測，其沉香四醇和芐基丙酮的含量見表9。由表9可知，樣品溶液中沉香四醇和芐基丙酮的含量在本發明選擇的標準工作曲線范圍內，標準工作溶液適用于沉香中沉香四醇和芐基丙酮的測定。

表9：10批沉香樣品中沉香四醇和芐基丙酮的含量