本發明涉及一種抗環瓜氨酸肽的測定試劑及其制備方法，屬于生化手段測試
技術領域：
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背景技術：
：類風濕關節炎(RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統性疾病。其特征是手、足小關節的多關節、對稱性、侵襲性關節炎癥，經常伴有關節外器官受累及血清類風濕因子陽性，可以導致關節畸形及功能喪失。RA的發病可能與遺傳、感染、性激素等有關。RA關節炎的病理主要有滑膜襯里細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤，以及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等。目前該病影響到全世界1-2％的人口，女性的發病率為男性的2～3倍，可發生于任何年齡，高發年齡為40～60歲。RA的癥狀表現如下：(1)晨僵：早晨起床時關節活動不靈活的主觀感覺，它是關節炎癥的一種非特異表現，其持續時間與炎癥的嚴重程度成正比。(2)關節受累的表現：①多關節受累：呈對稱性多關節炎(常≥5個關節)。易受累的關節有手、足、腕、踝及顳頜關節等。②關節畸形：手的畸形有梭形腫脹、尺側偏斜、天鵝頸樣畸形、鈕扣花樣畸形等。足的畸形有跖骨頭向下半脫位引起的仰趾畸形、外翻畸形、跖趾關節半脫位、彎曲呈錘狀趾及足外翻畸形。③其他：可有正中神經/脛后神經受壓引起的腕管/跗管綜合征，膝關節腔積液擠入關節后側形成腘窩囊腫(Baker囊腫)，頸椎受累(第2、3頸椎多見)可有頸部疼痛、頸部無力及難以保持其正常位置，寰樞關節半脫位，相應有脊髓受壓及椎基底動脈供血不足的表現。(3)關節外表現：①一般表現：可有發熱、類風濕結節、類風濕血管炎(主要累及小動脈的壞死性小動脈炎)及淋巴結腫大。②心臟受累：可有心包炎、心包積液、心外膜、心肌及瓣膜的結節、心肌炎、冠狀動脈炎、主動脈炎、傳導障礙，慢性心內膜炎及心瓣膜纖維化等表現。③呼吸系統受累：可有胸膜炎、胸腔積液、肺動脈炎、間質性肺疾病、結節性肺病等。④腎臟表現：主要有原發性腎小球及腎小管間質性腎炎、腎臟淀粉樣變和繼發于藥物治療(金制劑、青霉胺及NSAIDs)的腎損害。⑤神經系統：除周圍神經受壓的癥狀外，還可誘發神經疾病、脊髓病、外周神經病、繼發于血管炎的缺血性神經病、肌肥大及藥物引起的神經系統病變。⑥貧血：是RA最常見的關節外表現，屬于慢性疾病性貧血，常為輕至中度。⑦消化系統：可因RA血管炎、并發癥或藥物治療所致。⑧眼：幼年患者可有葡萄膜炎，成人可有鞏膜炎，可能由血管炎所致。還可有干燥性結膜角膜炎、鞏膜軟化、鞏膜軟化穿孔、角膜溶解。(4)Felty綜合征：1％的RA患者可有脾大、中性粒細胞減少(及血小板減少、紅細胞計數減少)，常有嚴重的關節病變、高滴度的RF及ANA陽性，屬于一種嚴重型RA。(5)老年發病的RA：常>65歲起病，性別差異小，多呈急性發病，發展較快(部分以OA為最初表現，幾年后出現典型的RA表現)。以手足水腫、腕管和跗管綜合征及多肌痛為突出表現，晨僵明顯。患者常因心血管、感染及腎功能受損等合并癥而死亡。類風濕關節炎(RA)的診斷目前主要依賴于臨床癥狀來判斷，僅有的血清學檢測是判斷血清中是否含有類風濕因子的存在。抗環瓜氨酸肽抗體(CCP)是環狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗體，對類風濕性關節炎(RA)具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴重。及早診斷RA及給予緩解病情的藥物治療，對控制病情非常重要。1998年，國外，首次報道的抗環瓜氨酸肽抗體(anti-cycliccirullinatedpeptideantibodies,抗CCP抗體)的檢測，對RA具有較高的敏感性和特異性，是RA新的血清標志物。可用于RA的早期診斷，療效檢測及預后評估。目前國內測定抗環瓜氨酸肽(CCP)的主要方法是ELISA法，雖然該方法已經比較成熟，但是缺點也顯而易見：定量準確性差，操作時間長，自動化程度低，一般只用于定性檢測。基于此，做出本申請。技術實現要素：為了克服現有抗環瓜氨酸肽(CCP)在測試過程中存在的上述缺陷，本發明首先提供一種快速靈敏、準確性好、穩定性好、操作簡便，適用于臨床全自動或半自動生化分析的抗環瓜氨酸肽(CCP)測定試劑。為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：一種抗環瓜氨酸肽(CCP)測定試劑，包括R1試劑、R2試劑和抗環瓜氨酸肽標準品，所述的R1試劑主要成分是Phosphate/NaCL緩沖液；所述的R2試劑主要成分是環瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS；所述的抗環瓜氨酸肽標準品的主要成分是抗環瓜氨酸肽、磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白(BSA)和疊氮鈉。具有上述特征抗環瓜氨酸肽(CCP)測定試劑的制備方法：(1)R1試劑配制：將Phosphate/NaCL緩沖液加入到容器中；開啟攪拌，攪拌速度為300-500轉/分，攪拌均勻。(2)R2試劑配制：將環瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS加入純化水中，開啟攪拌，攪拌速度均為300-500轉/分；加入疊氮鈉，繼續攪拌十分鐘，直至疊氮鈉完全溶解；加純化水定容。(3)抗環瓜氨酸肽標準品：在容器中加入磷酸鹽緩沖液，開啟攪拌，攪拌速度均為300-500轉/分；加入抗環瓜氨酸肽，攪拌十分鐘，直至完全溶解；加入牛血清蛋白，攪拌十分鐘，直至完全溶解；加入疊氮鈉，攪拌十分鐘，直至完全溶解，定容。本發明的工作原理如下：采用膠乳增強免疫比濁法定量檢測人血清中抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體。將環瓜氨酸肽結合BSA吸附于膠乳顆粒上，通過孵育使稀釋的人血清或血漿中特異性抗體與抗原結合，經孵育后，產生的吸亮度變化量與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。具體實施方式本實施例一種抗環瓜氨酸肽(CCP)測定試劑，包括R1試劑、R2試劑和抗環瓜氨酸肽標準品，所述的R1試劑主要成分是Phosphate/NaCL緩沖液；所述的R2試劑主要成分是環瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS；所述的抗環瓜氨酸肽標準品的主要成分是抗環瓜氨酸肽、磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白(BSA)和疊氮鈉。抗環瓜氨酸肽(CCP)測定試劑的制備方法：(1)R1試劑配制：①將3LPhosphate/NaCL緩沖液加入到適當容器中；②開啟電動攪拌器，攪拌速度為450轉/分，攪拌十分鐘。(2)R2試劑配制：①將10mL環瓜氨酸抗原與膠乳顆粒/PBS加入到約0.8L純化水中，開啟電動攪拌器，攪拌十分鐘；②將2g疊氮鈉加入上述溶液中，繼續攪拌十分鐘，直至完全溶解；③加純化水定容至1L。(3)抗環瓜氨酸肽標準品：①在適當容器中加入約150ml的磷酸鹽緩沖液；②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉/分；③在上述溶液中加入0.02001g抗環瓜氨酸肽，攪拌十分鐘，直至完全溶解；④在上述溶液中加入0.0091g牛血清蛋白，攪拌十分鐘，直至完全溶解；⑤在上述溶液中加入0.0842g疊氮鈉，攪拌十分鐘，直至完全溶解；⑥定容至200ml。(4)試劑檢驗①儀器配置:儀器使用日立7100全自動生化分析儀。測定參數嚴格按照產品說明書在儀器中設定，基本測定參數如下：方法：終點法；反應方向：遞增；波長：546nm(主)、800nm(副)；溫度：37℃。比色杯光徑：1cm；R1試劑：150μl,R2試劑：50μl，樣品：5μl。第一測光點：在R1試劑加入后5分鐘讀取；第二測光點：在R2試劑加入后5分鐘讀取。②試劑外觀檢查：目測檢查。③裝量檢查：用通用量具測量。④試劑空白測定:用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測試試劑盒，在測試主波長下，記錄測試啟動時吸光度(A1試劑)和約5分鐘后的吸光度(A2試劑)，A2即為工作試劑的空白吸光度。⑤線性范圍測定:取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣本系列。以H值與稀釋比例計算出預期值。稀釋方法參照表1所示(根據高值的大小可相應調整稀釋梯度)。表1樣本稀釋表實施例12345生理鹽水(ml)00.50.50.50.5高值標本H(ml)10.50.50.50.5稀釋比例原倍1/21/41/81/16表中：實施例1樣本的濃度為已知定值CH，實施例2-5樣本濃度按公式：樣本濃度＝CH×稀釋比例，計算作為預期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測定系統上按從低值到高值順序平行測定2次，均值作為對應實施例樣本實測值(如2次測定結果有明顯偏差應剔除重測)。統計學分析：以預期值為橫坐標，樣本實測值為縱坐標作圖及直線回歸分析，確定線性區間計算出直線方程y＝a+bx及相關系數，當相關系數r≥0.990時為線性良好。數據分析處理采用MicrosoftExcel軟件。相關公式如下：b=nΣXiYi-ΣXi·ΣYinΣXi2-(ΣXi)2...(1)]]>|a|=|ΣYi-bΣXi|n...(2)]]>r=nΣXiYi-ΣXi·ΣYi[n·ΣXi-(ΣXi)][nΣYi-(ΣYi)]...(3)]]>式中，C：濃度；V：容積；b：回歸線的斜率；∣a∣：回歸線截距的絕對值；r：相關系數；Xi：各管預期值；Yi：各管測定值；i：1、2、3.……、n；n：測定樣本數。⑥精密度測定:a.重復性測定:用臨床標本或質控血清測試試劑盒，重復測試10次，計算測量值的平均值和標準差(s)。按如下公式計算變異系數(CV)。與變異系數CV(％)X‾=ΣX1/n...(4)]]>CV=Σ(X‾-Xi)(X‾)2(n-1)...(5)]]>式中：——待測血清樣本的均值；Xi——測定血清樣本的測定結果；n——測定次數CV——變異系數b.批間差測定取三個批號送檢試劑，每個批號取3瓶，分別測定1份臨床樣本或質控血清，可選用羅氏質控品，分別計算9份試劑測定均值和每個批號3份試劑的測定均值并用MicrosoftExcel軟件統計三個批號試劑測定的變異系數。相關公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——總均值。⑦準確性測定:取校準品(有證參考物質，CRM)對試劑盒進行測試，重復檢測3次，取測試結果均值(M)，按公式(7)計算相對偏差(B)。相對偏差(B)＝(M-T)/T×100％…………………………………………(7)式中：T——有證參考物質(CRM)標示值；M——樣品測定結果均值；⑧分析靈敏度:用已知濃度或活性的樣品測試試劑盒，記錄在試劑盒規定參數下產生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度差值(ΔA)。(5)試劑測定結果如下：線性范圍：在線性范圍(5-100U/ml)內，線性回歸的相關系數r≥0.990。濃度≤45U/ml時，絕對偏差不超過±5U/ml；當濃度＞45U/ml時，相對偏差在±10％范圍內。準確度：比對試驗：相關系數r≥0.990。相對偏差≤15％。測量精密度：變異系數CV≤10％,相對偏差R≤10％。空白吸光度：空白吸光度(A)≦0.20(在溫度37℃；波長546nm；比色皿光徑1.0cm)。分析靈敏度：試劑盒測試20U/ml被測物時，吸光度差值(ΔA)≥0.006ABS。以上內容是結合本發明創造的優選實施方式對所提供技術方案所作的進一步詳細說明，不能認定本發明創造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發明創造所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明創造的保護范圍。當前第1頁1 2 3