基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖檢測方法與流程

本發明涉及血糖檢測領域，更具體地，涉及一種基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖定量檢測方法。

背景技術：

臨床上和家庭血糖檢測儀中普遍采用的是血液直接檢測，頻繁的血液采集會給患者帶來不適。尿糖檢查是無創式糖尿病初篩最簡單的方法，健康人尿液中幾乎沒有葡萄糖，只有當血糖濃度高于腎糖閾（8.88~9.99 mmol/l）時，尿液中才會出現葡萄糖，且濃度與血糖濃度具有較好的相關性，但目前因篩查試紙受多種因素的影響, 不能較準確的反應血糖濃度，因而其參考價值有限。已有研究證實，對于個體而言，人體餐前唾液、汗液等體液中的葡萄糖濃度也與血糖濃度具有良好的相關性，可用于間接反應血糖濃度，若能精確測量其中的葡萄糖含量，將在糖尿病早期篩查、血糖檢測等領域具有巨大的應用價值，但由于其葡萄糖濃度較低，一般為2*10^-2 mmol/l ~ 2.4*10^-1 mmo/l)， 尚無法用市售血糖檢測儀器準確檢測出來。因此，檢測靈敏度高、速度快的葡萄糖定量檢測方法將為臨床應用帶來新的契機。

表面增強拉曼散射（SERS）檢測技術是一種無創、靈敏度高的指紋式光譜檢測技術，可在分子水平上給出有關物質結構的信息，對拉曼信號的增強可高達10¹⁴倍。因此，SERS檢測技術在生物醫學傳感檢測領域具有廣泛的應用價值。中國專利CN103411949A公布了一種利用SERS技術間接檢測血清中葡萄糖含量的方法，該方法是通過葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生產過氧化氫分子，在所產生的過氧化氫分子的存在下，通過氧化態顯色底物分子的表面增強拉曼信號的強度大小來間接獲得血清中的葡萄糖含量。證明了表面增強拉曼技術在葡萄糖定量檢測中的可行性。

Malini Olivo等人（期刊論文，Biosensors and Bioelectronics, 56 (2014) 186– 191; J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 18028?18031) 提出利用三明治式雙分子探針技術實現葡萄糖的專一性檢測，利用4-巰基苯酸-三鋨羰基簇合物共軛物或炔基苯硼酸與4-巰基苯硼酸配合使用選擇性的捕捉葡萄糖分子進行SERS檢測，以實現葡萄糖的高選擇性定量檢測。然而，由于該方法是通過旋涂聚合物微球和濺射銀、金薄膜，在玻片上制備較為均勻的納米結構SERS活性基底，基底的穩定時間較短，并且由于其納米結構的等離激元波長無法調節，導致其檢測靈敏度有限，這些都不利于臨床應用。

技術實現要素：

本發明為克服上述現有技術所述的檢測靈敏度有限的缺陷，提供一種專一性強、靈敏度高、無創的基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：

基于表面增強拉曼散射（SERS）和雙分子探針的葡萄糖檢測方法，所述方法包括以下步驟：

S1：將制備好的幣族金屬納米棒均勻沉積在載體表面，制備成表面增強拉曼散射（SERS）活性基底，調節幣族金屬納米棒的尺寸和橫縱比，使SERS活性基底的等離激元波長與入射光共振；

S2：用初級葡萄糖受體分子修飾SERS活性基底，使其固定于SERS活性基底上；

將SERS活性基底浸泡于不同濃度的葡萄糖標準水溶液中，將溶液中的葡萄糖捕捉到SERS活性基底上；

往SERS活性基底中加入二級葡萄糖受體分子，二級葡萄糖受體分子選擇性的與基底上葡萄糖分子共價結合；

進行SERS光譜測試，以二級葡萄糖受體分子的拉曼特征峰強度來標定已知濃度的標準葡萄糖水溶液，建立定量分析標準曲線；

S3：采集葡萄糖濃度未知的待測樣本，適當稀釋后，用步驟S2的方法進行處理和SERS光譜測試，將得到的二級葡萄受體分子的拉曼特征峰強度代入步驟S2所建立的定量分析標準曲線，得到待測樣本的葡萄糖濃度值。

在一種優選的方案中，所述幣族金屬納米棒為金-銀核殼納米棒。

在一種優選的方案中，所述載體為蓋玻片。

在一種優選的方案中，所述載體為濾紙或濾膜。

在一種優選的方案中，SERS光譜測試使用的儀器為拉曼光譜儀，其激發光的波長范圍為400~1000 nm。

在一種優選的方案中，所述待測樣本包括血液、尿液、唾液、汗液。

在一種優選的方案中，所述初級葡萄糖受體分子采用4-巰基苯硼酸分子，其固定于SERS活性基底上。

在一種優選的方案中，所述二級葡萄糖受體分子采用4-氰基苯硼酸，其與SERS活性基底上的葡萄糖分子結合。

在一種優選的方案中，采用4-氰基苯硼酸的氰基拉曼特征峰對葡萄糖濃度進行定量檢測。

與現有技術相比，本發明技術方案的有益效果是：本發明提供一種基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖檢測方法，為葡萄糖檢測提供了一種專一性強，靈敏度高的手段，不僅可用于血糖檢測，還可用于尿液、唾液和汗液等葡萄糖含量較低的人體樣本的檢測。SERS技術實現高靈敏度、無創方式的葡萄糖檢測，采用了形狀、尺寸等性質高度可控的金-銀核殼納米棒制備SERS活性基底，可將基底的等離激元波長精確調節至與入射光共振，從而達到最高的拉曼增強因子，最大化的提高檢測靈敏度。采用了4-巰基苯硼酸和4-氰基苯硼酸雙分子探針技術，從而實現了葡萄糖的專一性檢測，4-氰基苯硼酸的氰基特征拉曼峰位于生物寂靜區，從而有效避免了其他內源性生物分子的干擾，保證了檢測的專一性和準確性。

附圖說明

圖1為本發明葡萄糖檢測方法的原理圖。

圖2為金-銀核殼納米棒SERS基底的示意圖。

圖3為葡萄糖檢測的示意圖。

具體實施方式

附圖僅用于示例性說明，不能理解為對本專利的限制；

為了更好說明本實施例，附圖某些部件會有省略、放大或縮小，并不代表實際產品的尺寸；

對于本領域技術人員來說，附圖中某些公知結構及其說明可能省略是可以理解的。

下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案做進一步的說明。

實施例1

如圖1-3所示，基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖檢測方法，所述方法包括以下步驟：

S1：將制備好的金-銀核殼納米棒（銀包金納米棒）均勻沉積在蓋玻片表面，制備成SERS活性基底，調節金-銀核殼納米棒的尺寸和橫縱比，使SERS活性基底的等離激元波長與入射光共振；

S2：用4-巰基苯硼酸修飾SERS活性基底，使4-巰基苯硼酸固定于SERS活性基底上，作為初級葡萄糖受體；

將SERS活性基底浸泡于不同濃度的葡萄糖標準水溶液中，將溶液中的葡萄糖捕捉到SERS活性基底上；

往SERS活性基底中加入二級葡萄糖受體4-氰基苯硼酸，4-氰基苯硼酸分子選擇性地與基底上葡萄糖分子共價結合；

進行SERS光譜測試，以4-氰基苯硼酸的拉曼特征峰強度來標定已知濃度的標準葡萄糖水溶液，建立定量分析標準曲線；

S3：使用激發光的波長范圍為400~1000 nm的拉曼光譜儀，采集葡萄糖濃度未知的血液、尿液、唾液或汗液樣本，適當稀釋后，用步驟S2的方法進行處理和SERS光譜測試，將得到的4-氰基苯硼酸的拉曼特征峰強度代入步驟S2所建立的定量分析標準曲線，得到待測樣本的葡萄糖濃度值。

本發明提供一種基于表面增強拉曼散射和雙分子探針的葡萄糖檢測方法，為葡萄糖檢測提供了一種專一性強，靈敏度高的手段，不僅可用于血糖檢測，還可用于尿液、唾液和汗液等葡萄糖含量較低的人體樣本的檢測。SERS技術實現高靈敏度、無創方式的葡萄糖檢測，采用了形狀、尺寸等性質高度可控的金-銀核殼納米棒制備SERS活性基底，可將基底的等離激元波長精確調節至與入射光共振，從而達到最高的拉曼增強因子，最大化的提高檢測靈敏度。采用了4-巰基苯硼酸和4-氰基苯硼酸雙分子探針技術，從而實現了葡萄糖的專一性檢測，4-氰基苯硼酸的特征拉曼峰位于生物寂靜區，從而有效避免了其他內源性生物分子的干擾，保證了檢測的專一性和準確性。

相同或相似的標號對應相同或相似的部件；

附圖中描述位置關系的用語僅用于示例性說明，不能理解為對本專利的限制；

顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明權利要求的保護范圍之內。