一種天然藥物活性成分的篩選方法與流程

本發明屬于醫藥學技術領域，尤其涉及一種天然藥物活性成分的篩選方法。

背景技術：

中藥或天然藥物復方是中醫臨床用藥的主要形式，具備長期民間應用基礎，是新藥研發主要來源。現代醫學研究表明由于中藥或天然藥物復方成分復雜、多樣，它們是以多途徑、多靶點、多受體形式發揮治療作用。目前，從中藥或天然藥物復方篩選活性成分的方法主要是提取分離法，它與藥理學相結合，為活性成分的發現與分離作出積極貢獻；近年，分離技術的發展與應用，大大加快藥物活性成分的篩選速度，發現了一大批活性成分。但值得關注的是，天然藥物分離技術忽略了中藥或天然藥物中多組分共存，在藥物提取過程中相互作用的特點。所以，在未考慮整個復雜體系中多種化學成分相互作用關系的前提下，傳統的溶劑提取法易于將多數的活性成分在分離過程中丟失。另外，由于不能夠及時地進行活性跟蹤，花費大量時間分離得到的化學成分往往沒有活性，造成了大量人力、物力及資源的浪費。

中藥復方是在中醫藥理論指導下，根據經典的“君臣佐使”配伍規律而組成。中藥復方活性成分研究有助于闡明中藥復方配伍的組成原理及作用機制，為臨床用藥提供科學依據，也為創新中藥奠定理論基礎。中藥復方作為一個復雜的科學系統，通過多成分、多靶點協同發揮作用，其主要藥效物質是中藥活性成分的組合。任何中藥(單味或復方)的任何一種生物效應，均來自該中藥的一種特定中藥分子組合(包括種類與數量)，但其活性成分組合的總體效應不能用每一成分單獨作用結果的線性疊加來表示。拆方研究是中藥復方配伍規律的重要手段之一，采取整體藥理試驗，并以藥效學指標為依據對中藥復方進行拆分研究。但上述研究均是以動物生理機能改變、生化指標變化或組織形態學 變化等作為觀測其藥理作用和探討其作用機理的指標。這些指標無法體現復方成分的加減或劑量改變對藥效的影響，難以闡明復方組成藥材或單一成分在復方中的貢獻。

代謝組學作為一門新興的系統生物學技術，主要用于研究生物體受到外界環境、疾病、藥物等干預后其代謝產物種類和數量的變化及變化規律。代謝組學能夠描述病癥的整個代謝過程所產生內源性代謝產物的動態變化，能忠實反映外界干預對機體代謝網絡調控過程的微觀變化，其研究思路與中醫學整體觀及辯證論治等思維方式基本吻合。近年來代謝組學在中醫藥領域的研究方興未艾，主要包括中醫癥候診斷、中藥質量標準化、中藥作用機制和中藥安全性評價等方面。研究結果表明，中藥尤其是復方藥物起效是通過多種成分作用于多個靶點、涉及多基因和多生化通路來實現的，對機體代謝網絡進行整體調節，因此代謝組學這一技術適用于中醫藥研究。基于液質聯用技術的中藥或天然藥物復方化學成分定性、定量分析方法，被廣泛應用于物質基礎研究并作為評價中藥質量標準的有效工具，但無法提供中藥或天然藥物復方的藥效學信息，無法使復方化學成分研究與藥效學研究進行有機結合。

綜上所述，如何將各化學成分與藥效學有機結合且不破壞整體用藥的特點，是從中藥或天然藥物中活性成分篩選方法亟待解決的問題。

己糖激酶(hexokinase，HK)是催化己糖使之磷酸化的酶，在正常組織中表達量很少。它是糖酵解途徑的第一個酶，也是糖酵解途徑的限速酶。己糖激酶在腫瘤組織中表達的量及活性的增加，使得腫瘤組織在缺乏氧的情況下，仍能保證足夠的能源，并且糖酵解的許多中間產物可以被瘤細胞所利用，以合成蛋白質、核酸及脂類等，從而為瘤細胞本身的生長和增生提供了必需的物質基礎。研究發現腫瘤具有高糖代謝的特點：腫瘤細胞中大約60％的ATP來源于糖酵解途徑。鑒于己糖激酶對于各種腫瘤細胞活動的重要意義，研究人員合理推測，若能尋找到有效的己糖激酶抑制劑，抑制該酶的活性，則抑制了腫瘤細胞的糖酵解，使腫瘤細胞不能獲得足夠的6-磷酸葡萄糖，ATP無法轉換為ADP為細胞 各種活動提供能量，繼而導致腫瘤細胞發生調亡。

現有制備工藝會消耗大量能源和有機溶劑，提取過程時間較長，提取的活性成分會含有大分子雜物，影響提取物的穩定性。

目前，在醫藥、化工以及食品等行業中，涉及有效成份提取及濃縮方面的技術改進大部分只是針對與各單獨的步驟，如針對提取階段應用微波、超聲等手段加快提取效率，針對濃縮階段提出的微波濃縮及真空濃縮等；而且國內的大部分制造廠商對于這兩種工序都是單獨設計單獨制造的，操作時也是分步操作，造成了提取劑及物料的極大浪費，且易揮發的提取劑容易對環境造成污染。

在掃描成像過程中目前的掃描和成像方法，耗時較長，因此對物品存在一定程度的缺陷。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種天然藥物活性成分的篩選方法，旨在解決現有天然藥物活性成分提取方法浪費提取劑及物料，提取劑容易對環境造成污染，在掃描成像過程中存在一定程度的缺陷的問題。

本發明是這樣實現的，一種天然藥物活性成分的篩選方法，通過提取天然藥物的顯微圖像的特征，以ATP為底物的己糖激酶催化反應，通過對ATP以及產物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，該天然藥物活性成分的篩選方法包括以下步驟：

步驟一、采集天然藥物原始圖像，對原始圖像進行預處理，分割出目標區域的輪廓，進行圖像去噪；

步驟二、將神經網絡PCNN與圖像對應，將中心神經元與圖像的像素點對應，中心神經元的鄰域與鄰域像素點對應，神經元的輸入為像素點的灰度值；

步驟三、基于Gabor函數計算所述像素點的K×K鄰域內各個像素點的M的方向相似性；其中，K為所確定的W的矩陣的行數或列數；如果所述方向相似性在指定范圍內，對所述K×K鄰域內的像素點進行一次點火，得到所述K×K鄰域內的像素點的圖像分析數據，根據分析數據優選出用于活性提取的天然藥物；

步驟四、建立高效液相-質譜聯用方法，在流動相中添加5mM的醋酸銨，對ATP以及產物ADP檢測及定量分析；

步驟五、利用PCNN模型處理天然藥物顯微圖像，提取各顯微圖像的一維時間序列信號特征并存儲特征信息，作為PCNN處理的另一圖像特征，并結合天然藥物顯微圖像體視學要求的圖像目標特征，提取天然藥物顯微圖像空域特征；

步驟六、基于高效液相-質譜聯用方法對ATP進行定量分析，測定以ATP作為底物的己糖激酶活性；

步驟七、對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物進行測定及計算。

進一步，利用下列公式運行PCNN模型：

F_ij[n]＝S_ij

L_ij[n]＝VLΣ_wijklY_kl[n-1]

U_ij[n]＝F_ij[n](1+βL_ij[n])

I_ij[n]＝N-n

式中：U_ij[n]為內部活動項，Y_ij[n]為PCNN脈沖輸出，I_ij[n]為索引值；

當n＝1時，L_ij[1]＝0，則U_ij[1]＝F_ij[1]＝Sij，θ_ij[1]＝LT(N-1)＝S_{ij_max}，對應的反饋輸入中值為S_{ij_max}的神經元將自然點火；神經元點火后，輸出Y_ij[1]＝1，θ_ij[2]變為V_θ，點火神經元的索引值標記為I_ij＝N-1。

原始圖像采集方法包括：

固定好圖像采集設備；

獲取天然藥物圖像掃描的投影數據；

根據所述投影數據進行迭代處理，以獲取目標圖像；

對所述目標圖像進行非負處理，獲取所述目標圖像的非負圖像；

對所述非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像；

對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取滿足目標函數的最優化稀疏解；

根據所述最優化稀疏解獲取重建圖像。

所述根據所述投影數據進行迭代處理以獲取目標圖像的步驟包括：

基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據所述投影數據計算目標圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標圖像，M為系統矩陣，G為所述投影數據，i表示迭代次數，Xi表示第i次迭代后得到的迭代結果；λ表示收斂系數，且λ∈(0,1)，MT表示對矩陣M的轉置；

設置所述目標圖像的初始值，并根據預先設置的迭代次數利用所述迭代模型對所述目標圖像中的每個像素點進行迭代更新，獲取所述目標圖像，所述迭代模型中的像素點的當前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

對所述目標圖像進行非負處理的步驟包括：將所述目標圖像中灰度值小于0的像素點置零；

獲取掃描的投影數據的步驟之前，原始圖像采集方法還包括：獲取掃描的投影圖像序列集，對所述投影圖像序列集進行預處理獲取所述投影數據；

對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行稀疏化處理的步驟包括：

從所述第一非負圖像和所述第二非負圖像中提取可以部分重疊的多個圖像塊；獲取所述多個圖像塊對應的稀疏系數；對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行最優化求解，得到滿足所述目標函數的最優化稀疏解。

進一步，原始圖像采集系統包括：

圖像采集設備、數據采集模塊、處理器模塊；處理器模塊包括目標圖像獲 取模塊、非負圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊和重建模塊；所述圖像采集設備用于掃描投影天然藥物，并將獲取的天然藥物的投影數據傳輸到數據采集模塊，數據采集模塊將接受的投影數據傳輸到目標圖像獲取模塊，所述目標圖像獲取模塊、非負圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊、重建模塊依次連接；

所述目標圖像獲取模塊，用于接收數據采集模塊傳輸的投影數據并進行迭代處理，以獲取目標圖像；

所述非負圖像獲取模塊，用于對所述目標圖像進行非負處理，獲取所述目標圖像的非負圖像；

所述分解模塊，用于對所述非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像；

所述稀疏化處理模塊，用于對第一非負圖像和第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取滿足預定條件的最優化稀疏解；

所述重建模塊，用于對獲取的滿足預定條件的最優化稀疏解進行重建；

所述目標圖像獲取模塊還用于基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據所

述投影數據計算目標圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標圖像，M為系統矩陣，G為所述投影數據，i表示迭代次數，Xi表示第i次迭代后得的迭代結果；λ表示收斂系數，且λ∈(0,1)，MT表示對矩陣M的轉置；設置所述目標圖像的初始值，并根據預先設置的迭代次數利用所述迭代模型對所述目標圖像中的每個像素點進行迭代更新，獲取最終的目標圖像，所述迭代模型中的像素點的當前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

所述稀疏化處理模塊包括：圖像塊提取模塊、稀疏系數獲取模塊、最優化求解模塊；

圖像塊提取模塊，用于從所述第一非負圖像和所述第二非負圖像中提取部分重疊的多個圖像塊；

稀疏系數獲取模塊，用于獲取所述多個圖像塊對應的稀疏系數；

最優化求解模塊，用于對對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行最優化求解，得到滿足所述目標函數的最優化稀疏解，

所述目標函數為：

其中，R_i∈R^M×N，Δ表示所述第一非負圖像或所述第二非負圖像，R_iΔ表示從Δ中提取的圖像塊，||||₂表示2-范數，||||₁表示1-范數，γ為正則化參數，D表示過完備字典，α_i為第i個圖像塊R_iΔ對應的稀疏系數，Γ為所有圖像塊的稀疏系數集合；

所述非負圖像獲取模塊還用于將所述目標圖像中灰度值小于0的像素點置零；

所述原始圖像采集系統還包括預處理模塊，所述預處理模塊用于對圖像采集設備掃描獲取的投影圖像序列集進行預處理以獲取所述投影數據。

進一步，該天然藥物活性成分的智能篩選方式包括以下步驟：

步驟一、將天然藥物于45-60℃干燥12-17小時后，粉碎成40-300目的粉末，冷藏保存，備用；

步驟二、超臨界CO₂萃取：

將步驟一中所得粉末裝入萃取釜中，萃取溫度25～35℃，萃取壓力20～60MPa，CO₂流速10mL/min；

萃取物在分離釜中進行兩級減壓分離，一級分離釜的壓力為10～18MPa，溫度為25～35℃；二級分離釜壓力為5～8MPa，溫度為25～50℃，收集產物，備用；

步驟三、超聲波強化浸提：將步驟二所得產物按重量比加入3～10倍的 提取溶劑，超聲波強化浸提溫度為20～50℃，超聲功率為120～250w，超聲時間為30～60min；浸提液在-5～0℃、以5000r/min速度離心10～20min；然后沉淀部分加入3～5倍重量比的同種溶劑，重復上述步驟；合并所得上清液，備用；

步驟四、濃縮上清液：將步驟三所得上清液在50～60℃，0.01MPa下減壓蒸發并真空干燥得膏狀物，備用；

步驟五、制得活性成分：將步驟四所得膏狀物用蒸餾水進行溶解，再用酸調節pH值1～7后，上大孔吸附樹脂，依次以0.3-1.0ml/min的流速用水、乙酸銨和甲醇混合的水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫液，再用有機溶劑進行萃取，減壓回收有機溶劑，最后得到活性成分。

本發明將ATP與中藥提取物在一定條件下混合，以LC-MS方法為手段，分別測定反應前后，ATP的變化量及生成ADP的量，用以評價中藥提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS法的實施過程中，在流動相中加入5mM醋酸銨，極大地提高了ATP的質譜信號及對ATP定量的穩定性。篩選結果顯示，本發明的LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法操作簡單、自動化程度高、靈敏度高且篩選快速。

本方法無需進行大批量的動物實驗，相比細胞試驗，本發明提取物用量少，生化試劑節省且篩選周期短，對于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義。快速簡便，經濟有效，適合中藥材中具己糖激酶活性抑制作用的活性組分的篩選。本發明方法可用于各種復雜基質中ATP的檢測；

本發明提供的圖像采集系統和圖像采集方法，通過對目標圖像進行非負處理，獲取目標圖像的非負圖像，然后對非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像，最后對第一非負圖像和第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取最優化稀疏解，根據該最優化稀疏解實現CT圖像重建，降低了運算過程中的圖像矩陣的維數，提高了圖像成像的準確效率。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的天然藥物活性成分的篩選方法流程圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作進一步描述。

如圖1所示:

一種天然藥物活性成分的篩選方法，通過提取天然藥物的顯微圖像的特征，以ATP為底物的己糖激酶催化反應，通過對ATP以及產物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，該天然藥物活性成分的篩選方法包括以下步驟：

S101、采集天然藥物原始圖像，對原始圖像進行預處理，分割出目標區域的輪廓，進行圖像去噪；

S102、將神經網絡PCNN與圖像對應，將中心神經元與圖像的像素點對應，中心神經元的鄰域與鄰域像素點對應，神經元的輸入為像素點的灰度值；

S103、基于Gabor函數計算所述像素點的K×K鄰域內各個像素點的M的方向相似性；其中，K為所確定的W的矩陣的行數或列數；如果所述方向相似性在指定范圍內，對所述K×K鄰域內的像素點進行一次點火，得到所述K×K鄰域內的像素點的圖像分析數據，根據分析數據優選出用于活性提取的天然藥物；

S104、建立高效液相-質譜聯用方法，在流動相中添加5mM的醋酸銨，對ATP以及產物ADP檢測及定量分析；

S105、利用PCNN模型處理天然藥物顯微圖像，提取各顯微圖像的一維時間序列信號特征并存儲特征信息，作為PCNN處理的另一圖像特征，并結合天然藥物顯微圖像體視學要求的圖像目標特征，提取天然藥物顯微圖像空域特征；

S106、基于高效液相-質譜聯用方法對ATP進行定量分析，測定以ATP作 為底物的己糖激酶活性；

S107、對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物進行測定及計算。

進一步，利用下列公式運行PCNN模型模型：

F_ij[n]＝S_ij

L_ij[n]＝VLΣ_wijklY_kl[n-1]

U_ij[n]＝F_ij[n](1+βL_ij[n])

I_ij[n]＝N-n

式中：U_ij[n]為內部活動項，Y_ij[n]為PCNN脈沖輸出，I_ij[n]為索引值；

當n＝1時，L_ij[1]＝0，則U_ij[1]＝F_ij[1]＝Sij，θ_ij[1]＝LT(N-1)＝S_{ij_max}，對應的反饋輸入中值為S_{ij_max}的神經元將自然點火；神經元點火后，輸出Y_ij[1]＝1，θ_ij[2]變為V_θ，點火神經元的索引值標記為I_ij＝N-1。

所述S104中對極性分子ATP的最低定量限為5μg/mL。

所述S104中，流動相添加5mM的醋酸銨，以質譜為檢測器，毛細管電壓設置為3000V，監測離子分別是ATP：m/z 508，ADP：m/z 428。

所述S104中，對ATP以及產物ADP檢測及定量分析：

色譜柱：Agilent Extend C-18(3.1×100mm，3μm；Agilent，Palo Alto，CA，USA)；

流動相：5mM乙酸銨(pH7.5)∶甲醇＝6∶4；流速：0.3mL/min；柱溫：20℃；進樣量：10μL；離子源：液相色譜-質譜聯用接口：電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positive ion)；干燥氣流速：10mL/min；干燥氣溫度：300℃；霧化氣壓力：30psi(上限60psi)；毛細管電壓：3000V；質量分析器：檢測方式：選擇離子監測(SIM)；檢測區間：0-1.6min；碎片電壓：100V；監測離子：ATP，準分子離子峰(m/z 508)；ADP，準分子離子峰(m/z428)。

中藥提取物為中藥材木鱉子的四種提取物MBZA，MBZB，MBZC和MBZD。

所述S106中，對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物MBZA進行測定及計算。

原始圖像采集方法包括：

固定好圖像采集設備；

獲取天然藥物圖像掃描的投影數據；

根據所述投影數據進行迭代處理，以獲取目標圖像；

對所述目標圖像進行非負處理，獲取所述目標圖像的非負圖像；

對所述非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像；

對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取滿足目標函數的最優化稀疏解；

根據所述最優化稀疏解獲取重建圖像。

所述根據所述投影數據進行迭代處理以獲取目標圖像的步驟包括：

基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據所述投影數據計算目標圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標圖像，M為系統矩陣，G為所述投影數據，i表示迭代次數，Xi表示第i次迭代后得到的迭代結果；λ表示收斂系數，且λ∈(0,1)，MT表示對矩陣M的轉置；

設置所述目標圖像的初始值，并根據預先設置的迭代次數利用所述迭代模型對所述目標圖像中的每個像素點進行迭代更新，獲取所述目標圖像，所述迭代模型中的像素點的當前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

對所述目標圖像進行非負處理的步驟包括：將所述目標圖像中灰度值小于0的像素點置零；

獲取掃描的投影數據的步驟之前，原始圖像采集方法還包括：獲取掃描的投影圖像序列集，對所述投影圖像序列集進行預處理獲取所述投影數據；

對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行稀疏化處理的步驟包括：

從所述第一非負圖像和所述第二非負圖像中提取可以部分重疊的多個圖像塊；獲取所述多個圖像塊對應的稀疏系數；對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行最優化求解，得到滿足所述目標函數的最優化稀疏解。

進一步，原始圖像采集系統包括：

圖像采集設備、數據采集模塊、處理器模塊；處理器模塊包括目標圖像獲取模塊、非負圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊和重建模塊；所述圖像采集設備用于掃描投影天然藥物，并將獲取的天然藥物的投影數據傳輸到數據采集模塊，數據采集模塊將接受的投影數據傳輸到目標圖像獲取模塊，所述目標圖像獲取模塊、非負圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊、重建模塊依次連接；

所述目標圖像獲取模塊，用于接收數據采集模塊傳輸的投影數據并進行迭代處理，以獲取目標圖像；

所述非負圖像獲取模塊，用于對所述目標圖像進行非負處理，獲取所述目標圖像的非負圖像；

所述分解模塊，用于對所述非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像；

所述稀疏化處理模塊，用于對第一非負圖像和第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取滿足預定條件的最優化稀疏解；

所述重建模塊，用于對獲取的滿足預定條件的最優化稀疏解進行重建；

所述目標圖像獲取模塊還用于基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據所

述投影數據計算目標圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標圖像，M為系統矩陣，G為所述投影數據，i表示迭代次數，Xi表示第i次迭代后得的迭代結果；λ表示收斂系數，且λ∈(0,1)，MT表示對矩陣M的轉置；設置所述目標圖像的初始值，并根據預先設置的迭代次數利用所述迭代模型對所述目標圖像中的每個像素點進行迭代更新，獲取最終的目標圖像，所述迭代模型中的像素點的當前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

所述稀疏化處理模塊包括：圖像塊提取模塊、稀疏系數獲取模塊、最優化求解模塊；

圖像塊提取模塊，用于從所述第一非負圖像和所述第二非負圖像中提取部分重疊的多個圖像塊；

稀疏系數獲取模塊，用于獲取所述多個圖像塊對應的稀疏系數；

最優化求解模塊，用于對對所述第一非負圖像和所述第二非負圖像進行最優化求解，得到滿足所述目標函數的最優化稀疏解，

所述目標函數為：

其中，R_i∈R^M×N，Δ表示所述第一非負圖像或所述第二非負圖像，R_iΔ表示從Δ中提取的圖像塊，||||₂表示2-范數，||||₁表示1-范數，γ為正則化參數，D表示過完備字典，α_i為第i個圖像塊R_iΔ對應的稀疏系數，Γ為所有圖像塊的稀疏系數集合；

所述非負圖像獲取模塊還用于將所述目標圖像中灰度值小于0的像素點置零；

所述原始圖像采集系統還包括預處理模塊，所述預處理模塊用于對圖像采集設備掃描獲取的投影圖像序列集進行預處理以獲取所述投影數據。

在開始掃描前，根據被掃描藥品的性質來設定掃描參數，被掃描物體的性質可以是密度、組成成分等物理性質，掃描參數包括圖像采集設備的數據采集 方式、電壓以及功率等，并且所有的掃描參數在后續的數據采集過程中保持不變。

分別采集暗場圖像及亮場圖像，并通過求和平均得到平均暗場圖像和平均亮場圖像。成像視場中不放置被掃描藥品，不打開光源獲取若干幅暗場圖像，例如可采集5～10幅暗場圖像，對暗場圖像按照對應像素灰度值疊加求和并取平均得到平均暗場圖像。打開光源采集若干幅亮場圖像，并對亮場圖像按照像素灰度疊加求和并取平均得到平均亮場圖像，通過暗場圖像及亮場圖像有效地降低了采集圖像中噪聲的影響。

測量處于成像視場中的被掃描藥品旋轉中心到圖像采集設備的距離，對被掃描藥品進行等角度間隔圓周掃描，得到投影圖像序列集。對被掃描藥品進行等角度間隔掃描的步驟為：將轉臺連續等角度間隔地轉動一周，并在每一次轉動后對被掃描藥品進行掃描。例如，等角度間隔掃描的過程可以是：將被掃描物體置于轉臺上，連續轉動360次，每次轉動1度，每轉動一次就進行一次拍攝，直至轉臺旋轉一周，得到投影圖像序列集。

目標圖像是指初始的待重建圖像，利用預先設定的迭代模型獲取的預處理后的掃描投影數據進行迭代處理，獲取用于重建的目標圖像。

天然藥物圖像的成像模型可以采用以下公式表示：G＝MX，其中，G為投影數據，M為系統矩陣，X為目標圖像。

設置目標圖像的初始值，并根據預先設置的迭代次數利用迭代模型對目標圖像中的每個像素點進行迭代更新，獲取最終的目標圖像。

對目標圖像進行非負處理，獲取目標圖像的非負圖像。

非負處理是指去除目標圖像中灰度值小于零的像素點，這樣可以降低目標圖像矩陣的維度，提高重建的效率。

對非負圖像進行非線性分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像。

第一非負圖像是指代表非負圖像矩陣中基向量的部分，第二非負圖像表示非負圖像矩陣的權重系數。依據預先設定的分解模型對非負圖像進行分解可以 將原有的復雜數據降維，從而提高圖像重建的速度。非線性分解的模型可以采用奇異值分解算法、三角分解法、QR分解法和非負矩陣分解法等等。

將獲取的非負圖像X+采用非負矩陣分解算法進行分解：X+＝W*H，其中，W表示第一非負圖像，即X+中的一列向量可以解釋為對左矩陣W中所有列向量的加權和，H表示第二非負圖像，即右矩陣H中對應列向量中的元素為權重系數。

對第一非負圖像和第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取滿足目標函數的最優化稀疏解。

根據最優化稀疏解獲取重建圖像。

根據獲得最優化稀疏解稀疏解后，便可以根據上述步驟的分解模型，獲得最終的重建圖像可以為以下三種情形：

(1)、第一非負圖像W的最優化稀疏解WDL和原第二非負圖像的乘積，即X＝W DL*H；

(2)、原第一非負圖像W和第二非負圖像的最優化稀疏解HDL的乘積，即X＝W*H DL；

(3)、第一非負圖像W的最優化稀疏解WDL和第二非負圖像的最優化稀疏解HDL的乘積，即X＝WDL*HDL。

通過對目標圖像進行非負處理，獲取目標圖像的非負圖像，然后對非負圖像進行分解，獲取第一非負圖像和第二非負圖像，最后對第一非負圖像和第二非負圖像進行稀疏化處理，獲取最優化稀疏解，根據該最優化稀疏解實現圖像重建，降低了運算過程中的圖像矩陣的維數，提高了圖像重建的效率。

本發明另一目的在于提供一種天然藥物活性成分的智能篩選方式，該天然藥物活性成分的智能篩選方式包括以下步驟：

a.將天然藥物于45-60℃干燥12-17小時后，粉碎成40-300目的粉末，冷藏保存，備用；

b.超臨界CO₂萃取：

將步驟a中所得粉末裝入萃取釜中，萃取溫度25～35℃，萃取壓力20～60MPa，CO₂流速10mL/min；

萃取物在分離釜中進行兩級減壓分離，一級分離釜的壓力為10～18MPa，溫度為25～35℃；二級分離釜壓力為5～8MPa，溫度為25～50℃，收集產物，備用；

c.超聲波強化浸提：將步驟b所得產物按重量比加入3～10倍的提取溶劑，超聲波強化浸提溫度為20～50℃，超聲功率為120～250w，超聲時間為30～60min；浸提液在-5～0℃、以5000r/min速度離心10～20min；

然后沉淀部分加入3～5倍重量比的同種溶劑，重復上述步驟；合并所得上清液，備用；

d.濃縮上清液：將步驟c所得上清液在50～60℃，0.01MPa下減壓蒸發并真空干燥得膏狀物，備用；

e.制得活性成分：將步驟d所得膏狀物用蒸餾水進行溶解，再用酸調節pH值1～7后，上大孔吸附樹脂，依次以0.3-1.0ml/min的流速用水、乙酸銨和甲醇混合的水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫液，再用有機溶劑進行萃取，減壓回收有機溶劑，最后得到活性成分。

進一步，所述步驟a中冷藏溫度為0-20℃。

進一步，所述步驟e中所述蒸餾水與膏狀物的重量比W浸膏：W蒸餾水＝1：10-25；步驟e中大孔吸附樹脂為D101大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂。

本發明利用超臨界CO₂萃取技術和超聲波提取既可以使附加值高的脂溶性活性揮發油成分得到回收利用，又有助于產品的后期純化，首次運用大孔吸附樹脂富集、溶劑萃取相結合的方法獲得產品含量高的提取物，建立了一套較為科學合理的提取分離工藝流程，該技術減少了常規提取過程中因沉淀造成的損失，提高有回收率，減少了常規提取液在后期過濾中的困難；該技術具有工藝簡單、成本低、易操作、適于工業化生產，所得活性成分可用于保健品或藥品 等諸多場合。

本發明選擇中藥材木鱉子為篩選對象，以LC-MS為手段，測定ATP作為底物的己糖激酶活性，對木鱉子四種提取物(MBZA，MBZB，MBZC和MBZD)進行己糖激酶抑制劑活性的篩選；所述的中藥材木鱉子已運用在抗腫瘤復方中，藥理證實其具有散結消腫，攻毒療瘡的作用。

本發明基于在糖酵解過程中，己糖激酶催化ATP轉化為ADP的反應，將ATP與中藥提取物在一定條件下混合，以LC-MS方法為手段，分別測定反應前后(加入或不加入中藥提取物)，ATP的變化量及生成ADP的量，用以評價中藥提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS法的實施過程中，在流動相中加入5mM醋酸銨，極大地提高了ATP的質譜信號及對ATP定量的穩定性。

篩選結果顯示，本發明的LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法操作簡單、自動化程度高、靈敏度高且篩選快速。

本方法無需進行大批量的動物實驗，相比細胞試驗，本發明提取物用量少，生化試劑節省且篩選周期短，對于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義。本發明中經優化的LC-MS中各項實驗參數對于利用質譜技術測定其它類似性質的生物分子具有很好的參考價值。

本發明方法快速簡便，經濟有效，適合中藥材中具己糖激酶活性抑制作用的活性組分的篩選。本發明方法可用于各種復雜基質中ATP的檢測。

下面結合具體實施例對本發明進一步說明。

實施例1：木鱉子提取物中己糖激酶抑制活性組分的篩選

1.LC-MS法測定ATP和ADP

色譜柱：Agilent Extend C-18(3.1×100mm，3μm；Agilent，Palo Alto，CA，USA)；流動相：5mM乙酸銨(pH7.5)∶甲醇＝6∶4；流速：0.3mL/min；柱溫：20℃；進樣量：10μL離子源：液相色譜-質譜聯用接口：電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positiveion)；干燥氣流速：10mL/min；干燥氣溫度：300℃；霧化氣壓力：30psi(上限60psi)；毛細管電壓：3000V；質量分析器：檢測方式： 選擇離子監測(SIM)；檢測區間：0-1.6min；碎片電壓：100V；監測離子：ATP，準分子離子峰(m/z 508)；ADP，準分子離子峰(m/z428)

專屬性：ATP保留時間為1.39分鐘，ADP保留時間為1.40分鐘，與空白色譜圖對比可知，出峰位置無明顯雜質干擾。結果顯示，用本方法定量ATP，專屬性良好。

線性范圍在5-60μg/mL范圍內，以ATP峰面積Y對ATP的理論濃度X，以1/x為權重系數作加權線性回歸，得標準曲線方程為：Y＝3022.6X+1902.9(r＝0.998)。

靈敏度本方法對ATP的最低定量限(LLOQ)為5μg/mL(S/N≥10)，最低檢測限(LLOD)為1μg/mL(LLOD)。LLOQ的天內及天間精密度分別為3.95％和11.36％，準確度分別為105.37％和101.09％。

精密度和準確度配制ATP低、中、高3個濃度質控樣品(12，35，55μg/mL)各5份，進樣分析，并以當天標準曲線計算天內精密度及準確度。依法連續測定3天，計算天間精密度及準確度。本方法低、中、高濃度質控樣品，天內及天間精密度均小于10％，準確度在100±5％之內。

2.己糖激酶活性的測定(米氏常數Km的測定)

ATP系列溶液的配制用底物緩沖液(精密稱取HEPES 300.0mg，氯化鎂60.0mg，無水葡萄糖50.0mg，50ml去離子水充分溶解，用1mol/L氫氧化鈉調pH至7.5，得25mM HEPES緩沖液。該緩沖溶液每日新鮮配制)將ATP儲備液分別稀釋至5，10，15，20，25，30，35μg/mL系列溶液，供酶促反應使用。

己糖激酶酶促反應于1.5mL離心管中分別加入100μL己糖激酶緩沖液(精密稱取HEPES 300.0mg，氯化鎂60.0mg，50ml去離子水充分溶解，并加入5％(m/v)甘油，用1mol/L氫氧化鈉調pH至7.5，得25mM HEPES緩沖液)及100μLATP系列溶液，渦旋10s后進樣。另于不同離心管中分別加入100μL底物緩沖液及100μLATP系列溶液，作為空白對照組。

己糖激酶米氏常數Km計算米氏方程為：1/V＝Km/Vm×1/[S]+1/Vm，其中1/V為反應速度，即ATP減少量或ADP生成量(本實驗以ATP減少量計算)，[S]為底物濃度，即ATP濃度，單位換算為。以對應濃度空白對照組中ATP峰面積與酶促反應組中ATP峰面積的差的倒數作為縱坐標，ATP的濃度作為橫坐標，則直線斜率即為己糖激酶Km。用最小二乘法計算得Km為0.36。

3.木鱉子提取物中己糖激酶抑制劑活性組分的篩選

木鱉子提取物的制備500g木鱉子去殼磨粉，在500ml石油醚中，加熱回流1小時后浸泡24小時除去油脂，重復三次。過濾后濾渣用500ml無水乙醇浸泡提取24小時，重復提取三次，合并提取液。低溫離心除去提取液中雜質后，回旋蒸干乙醇制成流浸膏。稱取木鱉子提取物餾浸膏500mg溶于5ml 50％乙醇，充分溶解后得到淡黃色溶液，離心過濾掉少量不溶雜質，配成100mg/mL母液，用高效液相色譜法進行分離。分別收集流出液并命名為MBZA(4.00～7.00min)，MBZB(16.00～20.00min)，MBZC(23.00～25.50min)，MBZD(27.00～28.00min)。合并收集液，回旋蒸干后制得四種提取物干粉。

溶液配制稱取適量木鱉子提取物MBZA、MBZB、MBZC和MBZD干粉用底物緩沖液分別配成30μg/ml的溶液，離心過濾不溶成分。另配制濃度為30μg/mL ATP溶液待用。

己糖激酶抑制活性提取物篩選配制各溶液后各進樣五次分析。進樣后，將加入木鱉子提取物樣品進樣五次后所得ATP峰面積的平均值與空白對照樣品及酶促反應對照樣品(無抑制劑)的ATP峰面積比較，加入木鱉子提取物樣品的ATP峰面積明顯高于酶促反應樣品中的ATP峰面積，說明MBZA中含有對己糖激酶有抑制作用的活性成分。

MBZA抑制活性的測定及計算精密稱取10.0mgMBZA于10ml容量瓶中，用底物緩沖液定容至刻度，制成母液。繼續用底物緩沖液將MBZA母液稀釋至10，15，20，25，30，50，80，100μg/mL系列溶液待用。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發 明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。