檢測水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量的方法與流程

本發明涉及食品安全檢測領域，尤其指一種檢測水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量的方法。

背景技術：

作為食品家族的重要一員，水產品以其低脂肪、高蛋白、營養豐富、味道鮮美等優點正成為國內外消費者的首選食品之一，目前我國居民人均水產品消費處于副食品消費的核心地位。同時水產品也是我國重要的出口貨物，為出口創匯貢獻了重要力量。因此，水產品質量安全對于保障人民身體健康和生命安全、促進水產品對外貿易具有十分重要的意義。溴代阻燃劑(Brominated flame retardants)是世界上消費量最大的鹵素有機阻燃劑，目前正在使用的溴代阻燃劑約75種，其中最主要的是多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)，主要應用于建材、印刷電路板、塑料、涂層、電線電纜及聚氨酯泡沫中。這些物質會緩慢地從含有阻燃劑的產品中釋放出來。有文獻報道阻燃劑殘留已廣泛存在于土壤、沉積物、室內灰塵、水體、海洋生物、鳥類以及人體血液、乳液、體液和脂肪中，并具有很強的累積性、持久性、神經毒性及內分泌干擾特性。由于傳統溴代阻燃劑的巨大毒性，已紛紛被各國所禁止或限制生產與使用，其中商業五溴和八溴二苯醚已于2009年被列入控制持久性有機污染物的《斯德哥爾摩公約》，HBCDs也于2013年被列入該條約。英國和日本已將HBCDs列為優先控制的化學品，挪威已完成國家評估并將HBCDs列入了國家禁止使用的化學物質。而HBCDs是一種類似于持久性有機污染物潛在環境內分泌干擾物，它能在環境和生物體內累積，對環境和生物體產生嚴重影響，已有研究表明HBCDs對藻類、軟體動物、甲殼動物和魚體有明顯的毒性作用。

近年來，由于多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)的使用量大、殘留期長、在環境中的檢出率高，且具有生物毒性，已經受到國際社會廣泛關注。目前多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)的生產廠家集中在山東、河北和江蘇等省份，國內總需求量正在不斷增長，但是目前國內有關多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)環境問題的研究工作才剛剛起步，至今沒有形成有組織的系統研究，特別是缺少對水環境多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)全面調查評價，同時也缺乏相應檢測技術和控制策略。關于多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)檢測的研究報道主要集中在水體樣品和環境樣品方面，涉及的方法主要包括氣相色譜/質譜聯用法、液相色譜/質譜聯用法及高效液相色譜/串聯質譜聯用法等。由于HBCDs的3種主要異構體在160℃以上會發生熱重排，在240℃以上將脫溴降解，從而限制了氣相色譜/質譜聯用法的推廣應用。有關文獻報道采用氣相色譜-電子捕獲檢測(GC-ECD)、氣相色譜-質譜(GCMS)來檢驗環境樣品中痕量四溴雙酚A，GC-ECD方法對溴原子固然有很好的響應，但是在選擇性上尚有不足；而GC-MS具有較好的選擇性，但此檢測方法檢出限差，而且需要繁瑣的預處理以及樣品的衍生化。近年來，隨著高效液相色譜-質譜串聯(LC-MS/MS)技術的快速發展，LC-MS/MS已成為環境中多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)測定新興采用的方法。目前只有針對水中四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)同時測定的相關文獻報道，還未見同時分析六溴環十二烷、四溴雙酚A和多溴聯苯醚等3類阻燃劑的相關報道。

目前，對多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴環十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)進行檢測分析存在的主要困難包括：ESI電離對多溴聯苯醚分析的專屬性較弱，更易受到復雜基質的干擾，導致無法滿足樣品測定要求。而且由于有些水產品油脂高，原有的前處理方法需要大量時間。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種操作簡便，檢測快速準確的檢測水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量的方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：本檢測水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量的方法，其特征在于：包括以下步驟，建立加速溶劑萃取-快速液相色譜-串聯質譜測定水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量，將需檢測水產樣品經C₁₈色譜柱分離，以水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，質譜多反應監測模式檢測，基質標準校正，外標法定量測定，確證。

作為改進，所述質譜多反應監測模式：利用流動注射泵連續進樣，在負離子模式下進行全掃描，以選擇適配的分子離子峰和電離方式。

進一步改進，所述質譜多反應監測模式，為負離子電噴霧模式；ΔEMV600V，干燥氣體溫度為300℃；干燥氣體流量為7L/min；霧化器壓力為30psi；鞘氣溫度為300℃；鞘氣流量為10L/min；毛細管電壓為2000V；噴嘴電壓為1900V。

進一步改進，色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH-C₁₈色譜柱，色譜柱規格為：2.1mm×100mm，1.7μm；色譜柱控制為40℃；進樣量為10μL；流速為0.3mL/min；流動相A為水，流動相B為甲醇。

再改進，樣品預處理：

一)制樣，稱取約100g試樣，切成小塊后再用研磨機粉碎；

二)提取，稱取粉碎好的1g試樣于定性濾紙中，試樣稱處要求準確到0.01g，包好后置于萃取池中進行加速溶劑萃取，萃取劑為丙酮-正己烷溶液，樣品池溫度120℃，壓力10.3MPa，加熱時間5min，靜態萃取時間10min，氮氣吹掃時間100秒，循環次數為3次，沖洗樣品池的體積為20％，萃取結束后，萃取液在40℃以下減壓濃縮至近干，用正己烷定容至3mL，待凈化；

三)凈化，將C₁₈色譜柱依次用2mL二氯甲烷和2mL甲醇活化后，將試樣溶液過柱，先用12mL正己烷淋洗，再用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干后加入甲醇與水混合比為1∶1的溶液定容至1mL，攪拌均勻，經0.22μm針頭過濾器過濾，供快速液相色譜-串聯質譜測定。

作為改進，所述加速溶劑萃取，根據檢測樣品的物理性質，通過加入濃度為100μg/kg溶液回收實驗，并選擇丙酮和正己烷為提取溶劑，丙酮與正己烷的混合體積比為＝1∶1。

作為改進，標準溶液的配置：用電子天平分別準確稱取四溴雙酚A、十溴聯苯醚、六溴環十二烷，所述六溴環十二烷于100mL容量瓶中，以1∶1體積比的甲醇與水為溶劑準確配制1000μg/mL儲備液，使用時用甲醇與水溶液逐級稀釋至所需濃度，儲備液于4℃下避光儲存，所述儲備液最長存放時為1個月，所述六溴環十二烷有三種異構體，分別為：α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD。

作為改進，標準曲線繪制，與精密度關系：分別量取儲備液適量，用以1∶1體積比的甲醇與水的溶液稀釋至濃度為1.0，2.0，5.0，10，50和100μg/L的標準工作液，自動進樣10μL，進行HPLC-MS/MS分析，以水產品待測物在選擇反應監測MRM模式下的峰面積Y對相應的水產品待測物質量濃度X，X的單位為μg/L)使用外標法繪制標準曲線，并將10μg/L的標準工作液，連續重復進樣6次，計算峰面積的相對標準偏差，結果見下表1：從表可知，水產品待測物質量濃度為1.0～100.0μg/L時線性良好，相關系數r≥0.9988，滿足定量分析的要求，

表1 5種水產品待測物的線性范圍、回歸方程、相關系數r和峰面積的RSD

上述的MRM指的是：質譜多反應監測，所述的HPLC-MS/MS指的是：超快速液相色譜-串聯質譜，峰面積的RSD是指波形圖里面波峰與X軸所包圍的面積。

進一步改進，選取進入市場的22種水產品，進行隨機抽樣檢測，如果未發現陽性樣品，接著將以水產品加工品作為采集對象，擴大篩查范圍；回收率、檢出限與定量限的確定，根據3倍，10倍信噪比分別確定檢出限，定量限，在陰性樣品基質中添加5，50和100μg/kg 3個水平的混合標準溶液，按樣品預處的方法進行處理，每個水平重復測定6次，得到5種目標物的回收率，檢出限與定量限見下表2。目標物的檢出限為1.0μg/kg和2.0μg/kg，定量限為3.0μg/kg和5.0μg/kg；且在3個不同加入標準溶液濃度的水平下5種目標物的回收率在83.6％～95.9％范圍內，完全滿足國內外水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑檢測的要求，

表2 水產品中5種目標物的加標回收率，RSDs，檢出限和定量限

所述22種水產品為：白蟹、富貴蝦、小黃魚、大黃魚、龍頭魚、黃姑魚、梅童魚、鮸魚、玉禿、鯧魚、帶魚、青占魚、馬鮫魚、鰳魚、鯖魚、魷魚、烏賊、海帶、海蜇、海地瓜、蟶子和文蛤。所述RSDs即指：峰面積的RSD是指波形圖里面波峰與X軸所包圍的面積。

現有技術相比，本發明的優點在于：本發明的檢測方法操作簡便，檢測快速準確，針對三類溴系阻燃劑，通過比較加速溶劑萃取與液液萃取的優缺點，優化試驗方案，建立合適的提取方法，并保證方法簡單快捷并具有出色的通用性。對加速溶劑萃取的參數進行考察與優化，考察壓力，萃取時間，溫度，樣品量與解析時間對三類溴系阻燃劑萃取效率的影響，取得最佳萃取條件；根據三類溴系阻燃劑的性質，確定最佳的樣品凈化條件，進而建立起分辨率好、靈敏度高的分析方法，以保障測試結果的準確性和穩定性，降低對儀器和色譜柱的損害和污染；優化檢測方法，通過重現性、線性、加標回收等試驗，確定方法回收率，方法最小檢出限、方法穩定性、靈敏度、校準曲線線性范圍等方法技術指標，滿足分析要求；通過優化液相及質譜各種參數和條件，實現三類溴系阻燃劑的快速分離和準確定量，形成高通量檢測方法；集成共性技術，提取和凈化高效，分離度好、定量準確；基質簡單，避免三類溴系阻燃劑受到復雜基質的干擾，在提取過程中避免待測組分的損失；采用先進的加速溶劑萃取-液相色譜-質譜聯用技術，建立可以同時檢測水產品中三類溴系阻燃劑的方法，進而健全三類溴系阻燃劑檢驗鑒定技術和方法標準體系。本發明不僅對保障消費者身體健康和生命安全，促進水產品加工業持續健康發展有巨大的現實意義，也可為食品行業監管部門和檢測機構提供有利的技術儲備，應用前景廣。

附圖說明

圖1與圖2是本發明實施例中20μg/L TBBPA標準溶液的MRM譜圖；

圖3與圖4是本發明實施例中20μg/L α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD標準溶液的MRM譜圖；

圖5與圖6是本發明實施例中20μg/L BDE209標準溶液的MRM譜圖。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。

本檢測水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量的方法，包括以下步驟，建立加速溶劑萃取-快速液相色譜-串聯質譜測定水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑含量，將需檢測水產樣品經C₁₈色譜柱分離，以水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，質譜多反應監測模式檢測，基質標準校正，外標法定量測定，確證。所述質譜多反應監測模式：利用流動注射泵連續進樣，在負離子模式下進行全掃描，以選擇適配的分子離子峰和電離方式。所述質譜多反應監測模式，為負離子電噴霧模式；ΔEMV600V，干燥氣體溫度為300℃；干燥氣體流量為7L/min；霧化器壓力為30psi；鞘氣溫度為300℃；鞘氣流量為10L/min；毛細管電壓為2000V；噴嘴電壓為1900V。色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH-C₁₈色譜柱，色譜柱規格為：2.1mm×100mm，1.7μm；色譜柱控制為40℃；進樣量為10μL；流速為0.3mL/min；流動相A為水，流動相B為甲醇。

樣品預處理：

一)制樣，稱取約100g試樣，切成小塊后再用研磨機粉碎；

二)提取，稱取粉碎好的1g試樣于定性濾紙中，試樣稱處要求準確到0.01g，包好后置于萃取池中進行加速溶劑萃取，萃取劑為丙酮-正己烷溶液，樣品池溫度120℃，壓力10.3MPa，加熱時間5min，靜態萃取時間10min，氮氣吹掃時間100秒，循環次數為3次，沖洗樣品池的體積為20％，萃取結束后，萃取液在40℃以下減壓濃縮至近干，用正己烷定容至3mL，待凈化；

三)凈化，將C₁₈色譜柱依次用2mL二氯甲烷和2mL甲醇活化后，將試樣溶液過柱，先用12mL正己烷淋洗，再用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干后加入甲醇與水混合比為1∶1的溶液定容至1mL，攪拌均勻，經0.22μm針頭過濾器過濾，供快速液相色譜-串聯質譜測定。

加速溶劑萃取，根據檢測樣品的物理性質，通過加入濃度為100μg/kg溶液回收實驗，并選擇丙酮和正己烷為提取溶劑，丙酮與正己烷的混合體積比為＝1∶1。

標準溶液的配置：用電子天平分別準確稱取四溴雙酚A、十溴聯苯醚、六溴環十二烷，所述六溴環十二烷于100mL容量瓶中，以1∶1體積比的甲醇與水為溶劑準確配制1000μg/mL儲備液，使用時用甲醇與水溶液逐級稀釋至所需濃度，儲備液于4℃下避光儲存，所述儲備液最長存放時為1個月，所述六溴環十二烷有三種異構體，分別為：α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD。

標準曲線繪制，與精密度關系：分別量取儲備液適量，用以1∶1體積比的甲醇與水的溶液稀釋至濃度為1.0，2.0，5.0，10，50和100μg/L的標準工作液，自動進樣10μL，進行HPLC-MS/MS分析，以水產品待測物在選擇反應監測MRM模式下的峰面積Y對相應的水產品待測物質量濃度X，X的單位為μg/L)使用外標法繪制標準曲線，并將10μg/L的標準工作液，連續重復進樣6次，計算峰面積的相對標準偏差，結果見下表1：從表可知，水產品待測物質量濃度為1.0～100.0μg/L時線性良好，相關系數r≥0.9988，滿足定量分析的要求，

表1 5種水產品待測物的線性范圍、回歸方程、相關系數r和峰面積的RSD

上述的MRM指的是：質譜多反應監測，所述的HPLC-MS/MS指的是：超快速液相色譜-串聯質譜，峰面積的RSD是指波形圖里面波峰與X軸所包圍的面積。

選取進入市場的22種水產品，進行隨機抽樣檢測，如果未發現陽性樣品，接著將以水產品加工品作為采集對象，擴大篩查范圍；回收率、檢出限與定量限的確定，根據3倍，10倍信噪比分別確定檢出限，定量限，在陰性樣品基質中添加5，50和100μg/kg 3個水平的混合標準溶液，按樣品預處的方法進行處理，每個水平重復測定6次，得到5種目標物的回收率，檢出限與定量限見下表2。目標物的檢出限為1.0μg/kg和2.0μg/kg，定量限為3.0μg/kg和5.0μg/kg；且在3個不同加入標準溶液濃度的水平下5種目標物的回收率在83.6％～95.9％范圍內，完全滿足國內外水產品中四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷三類溴系阻燃劑檢測的要求，

表2 水產品中5種目標物的加標回收率，RSDs，檢出限和定量限

所述22種水產品為：白蟹、富貴蝦、小黃魚、大黃魚、龍頭魚、黃姑魚、梅童魚、鮸魚、玉禿、鯧魚、帶魚、青占魚、馬鮫魚、鰳魚、鯖魚、魷魚、烏賊、海帶、海蜇、海地瓜、蟶子和文蛤。所述RSDs即指：峰面積的RSD是指波形圖里面波峰與X軸所包圍的面積。

樣品預處理方法研究：

比較加速溶劑萃取方法與傳統方法的預處理效果，優化試驗方案，建立合適的目標物提取方法，并保證方法的簡單、快捷及通用性。并對自動頂空的參數進行考察與優化，考察壓力，萃取時間，溫度，樣品量與解析時間對四溴雙酚A、十溴聯苯醚和六溴環十二烷萃取效率的影響，確認最佳萃取條件。

根據三類溴系阻燃劑的性質，比較不同的凈化方式，確定最佳的樣品凈化條件，進而建立起分辨率好、靈敏度高的分析方法，以保障測試結果的準確性和穩定性以及降低對儀器和色譜柱的損害和污染。

檢測方法優化：通過重現性、線性、加標回收等試驗，確定方法回收率，方法最小檢出限、方法穩定性、靈敏度、校準曲線線性范圍等方法技術指標，滿足分析要求。

采用液相色譜串聯質譜法測定三類溴系阻燃劑，通過優化液相及質譜各種參數和條件，實現三類溴系阻燃劑的快速分離和準確定量，形成高通量檢測方法。

集成共性技術，建立高效提取和凈化、高通量、分離度好、定量準確的三類溴系阻燃劑的快速檢測方法。

建立水產品中三類溴系阻燃劑污染狀況數據庫。

選取浙江沿海水產加工企業生產的典型海產加工制品，按已建立的方法進行水產品中三類溴系阻燃劑的檢測與分析，建立污染狀況數據庫，研究影響水產品中三類溴系阻燃劑形成的主要因素，為水產品的加工、貯藏、運輸及貿易過程中三類溴系阻燃劑的監控提技術支撐。

本發明實施應用成功后，可為水產品加工生產企業有效應對國際貿易技術壁壘做好技術支持和服務，極大地方便水產品加工和出口，增加企業的經濟效益，每年可以增加經濟收入50萬元以上，年增稅金10萬元以上。同時，本發明還能增加檢測機構的業務收入，按照每年檢測200批次，每批次收費500元計算，每年該項收入為10萬元。

流動相的優化

選擇不同流動相進行色譜峰的分離度和靈敏度的比較和研究。因為電噴霧質譜的電離是在溶液狀態電離，流動相的組成和其中的添加劑除了影響目標化合物的保留時間和峰形外，還影響離子化效率，從而影響檢測靈敏度。實驗在滿足較好的色譜分離的同時，比較了甲醇-水和乙腈-水這兩種流動相對目標化合物離子化程度的影響。結果表明，當流動相為甲醇-水時，響應值明顯高于以乙腈-水為流動相時的響應值(約為2～4倍)。因此，選用甲醇-水為流動相。

除了考察流動相組成外，還比較了流動相為甲醇-水和分別在此流動相中加入一定量的醋酸銨和氨水等添加劑對目標化合物離子化效率的影響。結果表明：當加入一定量的醋酸銨或氨水后，目標化合物的響應值反而有所降低，因此，實驗最終確定用甲醇-水作為流動相。

萃取條件的優化

根據目標物的物理性質，通過加標回收實驗(樣品中加標濃度為100μg/kg)對比萃取劑甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、正己烷以及相關混合溶液的萃取效率。結果發現，甲醇和二氯甲烷提取時，雜質含量比較高，基質干擾相對較大；乙腈的提取效率相比甲醇、二氯甲烷稍高，但與丙酮和正己烷相比，溶解性較差。最終選擇丙酮和正己烷作為提取溶劑。并經過反復實驗發現，丙酮∶正己烷＝1∶1(V/V)溶液的萃取率較高可達92％。

質譜條件的優化

采用多反應監測(MRM)模式，利用流動注射泵連續進樣，在負離子模式下進行全掃描，以選擇適當的分子離子峰和電離方式。結果表明，電噴霧負離子電離模式下，目標化合物全掃描的準分子離子[M-H]^-和[M-Br+O]^-比較穩定，[M-H]^-的離子強度比[M-Br+O]^-的離子強度大。因此實驗選用目標化合物的[M-H]^-為碰撞誘導解離的母離子，對待測化合物的碰撞能量和各種電壓參數進行了優化，各化合物的離子對和優化后的質譜分析參數見表2，各目標化合物的MRM譜圖見圖1～6。

所述Psi是一種壓力單位，即1mpa＝145psi。表格中的BDE209是十溴聯苯醚。

所述ΔEMV是表示：電子倍增管的電壓。

所述鞘氣是指：質譜中用來霧化、去溶劑氣體叫鞘氣，鞘氣一般為氮氣，起幫助流動相氣化的作用。所述5種目標物是指：TBBPA、α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD、BDE209的回收率。TBBPA表示：四溴雙酚A，BDE209表示：十溴聯苯醚，HBCD六溴環十二烷三類溴。其中α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD是表示六溴環十二烷的三種異構體。