一種基于CID碎裂鑒定脂質組學中脂質成分結構的方法與流程

技術領域：

本發明涉及生命科學，具體涉及代謝組學、脂質組學分析測定方法的建立以及未知脂質成分結構的快速鑒定。

背景技術：

由于生命體的整體性、復雜性等特點，現代生物學的發展從器官、組織、細胞到基因的方式，回歸到整合性研究的新高度，意味著分子生物學時代進入系統生物學時代。因此，基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等系統生物學研究方法成為詮釋生命體科學奧秘和闡明生理病理變化以及藥物干預作用機制的新手段。

脂質組學是近年來發展較快的一種系統生物學分析方法，是繼代謝組學和蛋白質組學之后發展起來的一種研究生物系統的組學新方法。脂質分子在生命科學中發揮著舉足輕重的作用。其中，甘油三酯是儲存能量的重要物質，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等是構成細胞膜的重要組成成分，同時也是組成細胞器膜，包括線粒體、高爾基體、內質網的重要成分，此外磷脂酰肌醇的代謝產物肌醇是許多生理病理過程中重要的信號分子，而炎癥脂質介質，包括花生四烯酸、前列腺素e2、前列腺素d2、血栓烷a2等參與了機體的炎癥反應。脂質代謝異常與多種疾病密切相關，如動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、腫瘤、脂肪肝等。研究發現某些特異性的脂質分子參與了疾病的發生發展或者是發揮著干預治療的作用。如棕櫚酰-油酰-磷脂酰甘油(popg)能夠顯著干擾人體的呼吸道合胞病毒感染，達到治療的作用；老年癡呆癥患者體內發現縮醛磷脂的含量顯著降低。這些例子能夠充分脂質分子在生理病理過程中發揮著重要的作用，因此建立穩定性的、普適性的脂質組學分析平臺對于揭示這些脂質分子的作用顯得十分的舉足輕重。

但是由于脂質分子結構的多樣性、復雜性以及相應分析手段的滯后阻礙了人們對生命體的整體脂質以及復雜的代謝網絡和功能調控進行規模性、整體性的系統研究。近年來，隨著快速、高通量、高精度脂質分析技術的發展，特別是軟電離離子化技術、高分辨質譜技術、各種雜交質譜的發展使得研究者能夠對生物樣品中的脂質分子進行全面的，精確的結構確定。盡管分析技術的發展給脂質類化合物的分析帶來許多益處，然而基于質譜的脂質分析在對脂質分子結構的進一步確定上存在瓶頸。質譜分析帶來了大量的譜圖數據，分析工作者需要花很多時間和精力去解析這些譜圖，而這項工作對于大部分的生命科學家而言，也比較困難。

鑒于此，本發明應用基于cid碎裂建立了一種快速確定脂質組學中脂質分子的方法，對脂質組學的研究具有重要意義和普遍使用性。

技術實現要素：
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本發明所要解決的技術問題是：利用高分辨的質譜建立脂質組學分析測定方法，并對其中的多種脂質成分進行歸屬，并確定最終的結構。

本發明提供如下技術方案，步驟包括：

a：針對不同的生物樣品設計合理的脂質組學提取方法，以確保全面的提取生物樣本的脂質成分，脂質提取過程中的影響因素包括：生物樣本(如血漿、組織、培養貼壁細胞、培養的懸浮細胞、植物藥材、食品、保健品)的含量和提取的方法(固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀、folch提取法、mtbe提取法等)。

b：根據脂質成分的理化性質選擇合適的檢測儀器和檢測方法；檢測儀器指具有能夠測定離子精確質量數的高分辨質譜儀同時具有多級或二級碎裂功能的雜交質譜，如高分辨的ltq-orbitrap質譜儀測定、q-tof質譜儀測定、q-orbitrap質譜儀測定；檢測方法的選擇包括是否選擇色譜柱分離、是否選擇鳥槍法脂質組學(shotgunlipidomics)、正離子還是負離子、cid碎裂的能量、母離子以及子離子選擇的質核比范圍，選擇二級碎裂還是多級碎裂等；

c：確定母離子及對應的碎裂ms2或/和ms3譜圖

d：通過hmdb和metlinescripps搜庫確定該質荷比所對應的脂質成分歸屬，主要的脂質成分歸屬包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、絲氨酸等

e：依據附圖2和3，即各脂質成分所對應的診斷離子的篩選公式確定其脂肪酰部分的組成，最終確定其脂質成分的結構

本發明具有以下優點：

本發明提出各脂質成分所對應的診斷離子的確證公式能夠較快的確定脂質分子的組成，并確定其結構。本發明所涉及的脂質成分包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、絲氨酸等多種類型。

附圖說明：

圖1該法的技術路線

圖2各脂質成分所對應的篩選診斷離子的公式

圖3各脂質成分的診斷離子所對應的脂肪酰的結構

圖4甘油三酯的ms²碎裂圖

圖5磷脂酰膽堿的ms²碎裂圖

具體實施方式：

實施例1：

人血漿樣品中甘油三酯的成分確定

a：血漿樣品脂質成分的提取

選擇folch提取法提取血漿樣品中的甘油三酯，具體如下：20μl血漿樣品加入180μl甲醇充分渦旋，后加入400μl氯仿，樣品渦旋，最后引入150μl水分層。充分提取后4℃8000g離心10min。取下層富含脂質的氯仿層。將氯仿溶劑揮干。用異丙醇/甲醇溶劑復溶。離心，取上層清液進樣。

b：選擇合適的檢測方法和檢測條件

色譜分離條件：色譜柱：hypersilgoldaq柱(2.1×150mm，3μmi.d.)。流動相：a為含0.1％甲酸和5mm甲酸銨的乙腈/水溶液(40∶60，v/v)，b為含0.1％甲酸和5mm甲酸銨的異丙醇/乙腈溶液(9∶1，v/v)。梯度洗脫流速為0.35ml/min；柱溫55℃。

質譜檢測條件：電噴霧離子源，正離子模式檢測，噴霧電壓4.5kv，離子源溫度300℃，源電壓3.5v，毛細管電壓100v，套管鏡頭100v，鞘氣45arb，輔助氣10arb。鞘氣為高純氮氣，輔氣為高純氮氣，碰撞氣為高純氦氣。ms1譜圖通過ftms模式獲取，掃描范圍血漿上層樣本為m/z150～1500，其余均為m/z80～1000，分辨率設為30000fwhm；ms2譜圖通過itms模式獲取，分辨率為7500fwhm，碰撞能量為35ev。

c：在ms1譜圖中確定母離子，并通過精確質量數搜索metlinescripps數據庫確定其相應的甘油三酯的歸屬。如m/z894.75629，通過metlinescripps數據庫搜索確定其為甘油三酯。基于精確質量數預測的分子式為c57h100o6n。根據附圖2可以確定該甘油三酯中脂肪酰中的總含碳量及總不飽和度，表示為(54∶7)。

d：根據附圖2中甘油三酯的公式，在ms2譜圖中確定其診斷離子分別為m/z575.5，597.6，621.5(見附圖4)，查附圖3確定其所對應的脂肪酰的歸屬分別為(34∶2)、(36∶5)和(38∶7)，最終確定其主要結構tg(16∶0/18∶2/20∶5)。

實施例2：

sd大鼠肺組織樣品中磷脂酰膽堿的成分確定

a：肝組織樣品脂質成分的提取

選擇甲基叔丁基醚-甲醇提取法(mtbe提取法)提取肝組織樣品中的磷脂酰膽堿的成分，具體如下：50mg肝臟樣品勻漿后，加入400μl預冷75％甲醇溶液，振蕩渦旋10min后加入1ml甲基叔丁基醚，渦旋20min，再加入60μlmilli-q超純水，渦旋10min，靜置10min，17000rpm離心10min后，樣本分層，取上層清液900μl置離心濃縮儀揮干。上層濃縮物予100μl(異丙醇∶甲醇＝8∶2)混合液復溶，水浴超聲10min，17000rpm離心10min，取上清液40μl待測。

b：選擇合適的檢測方法和檢測條件

色譜分離條件：色譜柱：hypersilgoldaq柱(2.1×150mm，3μmi.d.)。流動相：a為含0.1％甲酸和5mm甲酸銨的乙腈/水溶液(40∶60，v/v)，b為含0.1％甲酸和5mm甲酸銨的異丙醇/乙腈溶液(9∶1，v/v)。梯度洗脫流速為0.35ml/min；柱溫55℃。

質譜檢測條件：電噴霧離子源，正離子模式檢測，噴霧電壓4.5kv，離子源溫度300℃，源電壓3.5v，毛細管電壓100v，套管鏡頭100v，鞘氣45arb，輔助氣10arb。鞘氣為高純氮氣，輔氣為高純氮氣，碰撞氣為高純氦氣。ms1譜圖通過ftms模式獲取，掃描范圍血漿上層樣本為m/z150～1500，其余均為m/z80～1000，分辨率設為30000fwhm；ms2譜圖通過itms模式獲取，分辨率為7500fwhm，碰撞能量為35ev。

c：ms1譜圖中確定母離子，并通過精確質量數搜索metlinescripps數據庫確定其相應的磷脂酰膽堿的歸屬。如m/z786.60388，通過metlinescripps數據庫搜索確定其為磷脂酰膽堿。基于精確質量數預測的分子式為c44h85o8np。根據附圖2可以確定該磷脂酰膽堿中脂肪酰中的總含碳量及總不飽和度，表示為(36∶2)。

d：根據附圖2中磷脂酰膽堿的公式，在ms2譜圖中確定其診斷離子分別為m/z502.4和506.5(見附圖5)，查附圖3確定其所對應的脂肪酰的歸屬分別為(18∶2)和(18∶0)，最終確定其主要結構pc(18∶0/18∶2)。