本發明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒。
背景技術：
：宮頸癌是在女性中第二常見的癌癥診斷，并且在99.7％的情況下與高危人乳頭瘤病毒感染相關，全世界每年有約400000例宮頸癌，近200000人死亡。HPV有超過100種不同的分離株，已根據它們與宮頸癌或與良性宮頸病變或非典型增生的關聯性被寬泛地再分成高危和低危亞型。低危險型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內低度病變(CINI)，高危險型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亞型，與宮頸癌及宮頸上皮內高度病變(CINII/III)的發生相關，尤其是HPV16和18型，其中HPV16占50％以上。人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，共有3個基因區組成，包括早期區(EarlyRegion，E區)、晚期區(LateRegion，L區)與非編碼區(UncodingRegion，UCR)或上游調控區(URR)。E區按順序為E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7個基因，參與病毒DNA的復制、轉錄、編碼病毒蛋白、維持細胞內病毒的高拷貝數的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，與病毒細胞轉化功能及致癌性有關。E6和E7蛋白使腫瘤阻抑蛋白p53和pRB鈍化，分別解除細胞周期控制和抑制細胞凋亡。因此，用于測定腫瘤中的HPV狀態的最佳方法是測量腫瘤細胞中的E6/E7蛋白。目前人乳頭瘤病毒(HPV)的主要檢測方法包括原位雜交，DNA直接捕捉法和各類PCR方法。上世紀90年代中期在傳統的PCR基礎上發展起來的實時熒光定量PCR(qPCR,Real-timeQuantitativePCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子診斷研究中的重要工具。但是上述方法只是在基因水平上檢測是否感染了人乳頭瘤病毒(HPV)，至于相關致癌蛋白的表達與否，實時熒光定量PCR技術并不能給出準確的判斷，而且該方法需要配套儀器實時熒光定量PCR儀，價格昂貴，檢測成本高。技術實現要素：本發明的目的是克服現有技術的不足，提供了用于檢測高危型人乳頭瘤病毒(HPV)16亞型E7致癌蛋白的化學發光檢測試劑盒。宮頸脫落細胞裂解后直接加樣，直接檢測高危型HPV相關致癌蛋白的表達與否以及表達量，從而對于高危型HPV的感染程度有了明確的判斷，方便了后續的治療。這一點恰恰正是目前檢測方法(包括實時熒光定量PCR技術)不能媲美的。本發明試劑盒采用雙抗體夾心法，使用抗體檢測人體宮頸脫落細胞中的高危型HPV16型E7蛋白。先將宮頸脫落細胞裂解后，直接加入包被了特異性抗體的化學發光板中，經溫育和洗滌后，加入酶標抗體，再經溫育和洗滌后加入底物，用化學發光儀檢測發光值。發光值與E7蛋白含量呈正相關，由此實現對人體宮頸脫落細胞中的HPV16型E7蛋白的定量檢測。本發明采用的技術方案為：本發明提供了一種HPV16型E7蛋白檢測的化學發光板，該化學發光板包被有HPV16型E7抗體。優選地，該化學發光板的每個微孔內抗體的包被量為0.05～0.5μg。優選地，所述化學發光板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。本發明還提供了一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，該試劑盒包括：包被有HPV16型E7抗體的化學發光板：化學發光板的每個微孔內抗體的包被量為0.05～0.5μg；HRP標記的HPV16型E7抗體：濃度為0.05～0.4μg/ml。進一步，所述的試劑盒還包括人體宮頸脫落細胞裂解液。優選地，所述的人體宮頸脫落細胞裂解液包括：0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；10mM～1M緩沖液；1mM～10mM蛋白酶抑制劑。(結合多次凍融可達到更加理想的裂解效果)更優選地，所述的表面活性劑為Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上。所述的緩沖液為phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上。更優選地，所述的人體宮頸脫落細胞裂解液由包括如下步驟的方法制備得到：用10mM～1M緩沖液配置0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；用之前加入終濃度為1mM～10mM蛋白酶抑制劑。更優選地，所述的人體宮頸脫落細胞裂解液由包括如下步驟的方法制備得到：用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入終濃度為5mM蛋白酶抑制劑PMSF。進一步，所述的包被有HPV16型E7抗體的化學發光板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。具體地，該試劑盒的主要組成成分如下：①上述包被有HPV16型E7抗體的化學發光板：每個微孔內抗體的包被量為0.05～0.5μg，條形微孔板(12條×8孔)，置于框架中；②HPV16型E7蛋白校準品0、1、2、3、4、5：校準品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白質控品1、2：質控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；④HRP標記的HPV16型E7抗體：直接使用，濃度為0.05～0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤上述人體宮頸脫落細胞裂解液；⑥底物溶液：如可以選擇湖州英創生物科技有限公司的化學發光底物液(包括底物A液和B液)⑦濃縮洗滌液(20×)：含有去污劑和防腐劑的濃縮洗滌液，用ddH2O稀釋20倍；⑧封口膜：孵育時密封微孔板的粘性薄膜。本發明還提供了上述試劑盒的制備方法，包括如下步驟：①制備包被HPV16型E7抗體的化學發光板取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。②標準品、質控品HPV16型E7蛋白校準品0、1、2、3、4、5：校準品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；HPV16型E7蛋白質控品1、2：質控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；③HRP標記的HPV16型E7抗體采用過碘酸鈉法進行標記，之后加入HRP穩定劑，混勻，濃度為0.05～0.4μg/ml，2-8℃保存。④人體宮頸脫落細胞裂解液用10mM～1M緩沖液配置0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；用之前加入終濃度為1mM～10mM蛋白酶抑制劑。所述的表面活性劑為Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上。所述的緩沖液為phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上。⑤濃縮洗滌液(20×)28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混勻，室溫保存。⑥底物溶液、封口膜，均為市售產品，直接購買得到。該試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：獲取足量的人體宮頸脫落細胞，加入裂解液中，渦旋震蕩2～10min，放入-20℃冰箱凍融1～3次，再次震蕩2～10min，離心10～30min(13000rpm)，收集上清，直接進行檢測；①從4℃冰箱取出所需化學發光包被板，室溫放置15min；②每孔加入100ul校準品/質控品/樣本，混勻置于37℃孵育30～60min；③甩干孔內液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內液體，在吸水紙上拍干，如此重復3～5次；④每孔加入100μl酶標抗體溶液，置于37℃孵育30～60min；⑤甩干孔內液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內液體，在吸水紙上拍干，如此重復3～5次；⑥每孔加入50ul化學發光底物A液和50ul化學發光底物B液(湖州英創生物科技有限公司)，置于化學發光檢測儀讀取發光值；以校準品濃度為橫坐標，發光值為縱坐標，采用四參數邏輯擬合法得到標準曲線方程，根據標準曲線方程計算待檢樣本中HPV16型E7蛋白含量。試劑盒的結果判讀本發明所具有的有益效果:某些臨床病人雖然基因水平上感染了人乳頭瘤病毒(HPV)，但是相關致癌蛋白表達量很低甚至不表達，這種情況可通過病人自身的免疫系統消除人乳頭瘤病毒(HPV)，無需引起恐慌以及不必要的治療，減輕患者精神壓力以及經濟壓力。基于此，本發明直接檢測高危型HPV相關致癌蛋白的表達與否以及表達量，從而對于高危型HPV的感染程度有了明確的判斷，方便了后續的治療。該發明與目前基因水平檢測方法形成互補，使得檢測結果愈加精確，治療方案愈加明確，患者早日康復。同時該方法只需要常規的化學發光儀，檢測成本低，可作為宮頸癌篩查的首選方法。附圖說明圖1是實施例4以校準品濃度為橫坐標，發光值為縱坐標，采用四參數邏輯擬合法得到標準曲線。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但不限定本發明的保護范圍。實施例1、包被HPV16型E7抗體的化學發光板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液為：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置2h進行封閉；在干燥房(26℃)抽干后，真空密封(4℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。實施例2、配置人體宮頸脫落細胞裂解液以及裂解宮頸樣本用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入終濃度為5mM蛋白酶抑制劑PMSF。將500ul裂解液加入宮頸脫落細胞收集管中，渦旋震蕩2min，置于-20℃冰箱10min，之后置于37℃烘箱2min，再次震蕩，離心(20min，13000rpm，4℃)，收集上清進行檢測。實施例3一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒的制備方法，①包被有HPV16型E7抗體的化學發光板：每個微孔內抗體的包被量為0.5μg，條形微孔板(12條×8孔)，置于框架中；制備方法同實施例1。②HPV16型E7蛋白校準品0、1、2、3、4、5：校準品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白質控品1、2：質控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；④HRP標記的HPV16型E7抗體：采用過碘酸鈉法進行標記，之后加入HRP穩定劑，混勻，2-8℃保存，濃度為0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤人體宮頸脫落細胞裂解液；制備方法同實施例2。⑥底物溶液：化學發光底物A液和B液；(湖州英創生物科技有限公司)⑦濃縮洗滌液(20×)：28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混勻，室溫保存。⑧封口膜：孵育時密封微孔板的粘性薄膜。實施例4、檢測某一宮頸樣本化學發光板的包被以及宮頸樣本的裂解同實施例1～2。①從4℃冰箱取出所需化學發光包被板，室溫放置15min；②每孔加入100ul校準品/質控品/樣本，混勻置于37℃孵育60min；③甩干孔內液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內液體，在吸水紙上拍干，如此重復5次；④每孔加入100μl酶標抗體溶液，置于37℃孵育60min；⑤甩干孔內液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內液體，在吸水紙上拍干，如此重復5次；⑥每孔加入50ul化學發光底物A液和50ul化學發光底物B液，置于化學發光檢測儀讀取發光值；以校準品濃度為橫坐標，發光值為縱坐標，采用四參數邏輯擬合法得到標準曲線如圖1所示。根據標準曲線計算待檢樣本中HPV16型E7蛋白含量為109.42ng/ml，按照結果判讀，該樣本為陽性，患者需要積極治療。用本發明試劑盒(如實施例3的檢測試劑盒)檢測一部分健康人宮頸脫落細胞，檢測數據結果如下；表一：檢測正常人宮頸脫落細胞數據結果表二：檢測病人宮頸脫落細胞數據結果數據分析1、根據正常人檢測值，計算出平均值，標準方差，Cutoff值。分別將83例正常人宮頸脫落細胞檢測結果取平均數，并計算標準方差SD，本試劑盒在確定Cutoff值時選擇正常人平均值加上兩倍的標準方差作為HPV16E7蛋白表達陰陽性的判斷標準，結果如下：Cutoff計算公式為：cutoff＝平均值+2*SD標準方差表三：檢測數據表一統計平均值4.06SD標準方差5.48Cutoff15.02ng/ml2、通過Cutoff值，判斷待檢樣本HPV16E7蛋白表達的陰陽性，超過這個Cutoff值的即認為是陽性，即認為表達了HPV16E7蛋白，同時與病理資料對比。3、表三：根據Cutoff值判斷表二病人宮頸脫落細胞診斷結果(“+”表示檢測結果陽性；“-”表示檢測結果陰性)表四：根據表三病人宮頸脫落細胞診斷結果陰陽性制定準確率比例表在表二實驗中所檢測的病人宮頸脫落細胞共計19例，試劑盒HPV16E7蛋白檢測結果為陽性的為14例，診斷靈敏度高達78.9％；其中針對CINII以上病例樣本，診斷靈敏度高達80％。當前第1頁1 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