一種弓形蟲檢測試劑盒的制造方法與工藝

本發明屬于生物技術，涉及一種基于弓形蟲表面蛋白3(SAG3)的膠體金免疫層析快速檢測技術的檢測試劑盒，能夠快速檢測人、豬、貓、狗等的弓形蟲感染。

背景技術：
弓形蟲病是一種在世界范圍內廣泛傳播的人獸共患寄生蟲病，它是由機會性胞內寄生蟲剛地弓形蟲所引起的。這種寄生蟲可以入侵所有的溫血動物，包括人類。免疫力正常的機體不會表現出明顯癥狀，在免疫力低下的人群中會導致腦積水、視網膜脈絡膜炎、腦炎，在免疫力系統損傷的人群中甚至會引起死亡。弓形蟲病同時也對畜禽養殖業造成了重大的影響，它可以造成畜禽的流產、死胎以及新生幼畜的死亡，尤其是在綿羊和山羊之中。因此，弓形蟲病在公共衛生學以及畜禽安全生產上的地位十分重要。弓形蟲病的診斷目前主要依靠血清學檢測方法，乳膠凝集試驗(LAT)是在畜禽中檢測弓形蟲的主要方法，但該方法的特異性較低。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是診斷人弓形蟲病的最主要方法。但這些方法都需要較長的時間，而且需要一些設備或者受過專業訓練的技術人員，不適于大規模現場檢測。免疫層析試紙條技術因為其簡單，易操作，而且檢測時間短，結果易于觀察，成本低，易于保存等特點被認為是一種理想的現場檢測的方法，對臨床檢測具有重要意義。弓形蟲表面蛋白SAG3是一種保守蛋白，在弓形蟲速殖子、緩殖子以及子孢子等多個時期均可表達，并且其表達量較高，僅位于SAG1、SAG2之后；在弓形蟲入侵宿主細胞時，大量的SAG3會被釋放出來，與SAG1共同發揮粘附及入侵的作用，因此，SAG3是一個非常理想的診斷靶標。

技術實現要素：
本發明的目的是提供一種能分泌抗弓形蟲SAG3抗體的單克隆雜交瘤細胞株，該細胞株已被中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏號是CCTCCNO：C201624，分類命名：單克隆雜交瘤細胞株4D5號，保藏日期：2016.2.1。本發明的另一個目的是提供一種抗SAG3單克隆抗體，通過以下步驟獲得：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1x106個單克隆雜交瘤細胞株4D5，注射后10天開始收集腹水，離心去除雜質，采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體，將腹水和醋酸鹽緩沖液按1:2的比例混合，攪拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃過夜，去除沉淀，冰浴條件下加入飽和硫酸銨溶液，取沉淀溶解，透析過夜，采用Bradford法測得蛋白濃度為6.9mg/ml，其余腹水采用冷凍干燥機冷凍干燥后保存于-80℃冰箱。本發明的再一個目的是提供一種弓形蟲檢測試劑盒，是一種基于弓形蟲表面蛋白3(SAG3)的膠體金免疫層析快速檢測試紙條的檢測試劑盒，采用雙抗原夾心法快速檢測弓形蟲抗原，為防控弓形蟲病奠定基礎。本發明的試劑盒包由試紙條、標準品、對照品、樣品稀釋液組成；其中試紙條中包被的抗弓形蟲SAG3單克隆單體由單克隆雜交瘤細胞4D5(保藏號：CCTCCNO：C201624)分泌，標準品為豬弓形蟲陽性血清，對照品為豬弓形蟲陰性血清，樣品稀釋液為10mM、pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PB)，由NaH2PO4·H2O1.38g，Na2HPO4·12H2O3.58g，加雙蒸水定容至100ml，調節pH至7.5。本發明試劑盒通過以下步驟制備獲得：(1)膠體金溶液的制備：向圓底燒瓶中加入1ml的HAuCl4，迅速加入檸檬酸鈉溶液，將水浴溫度調至100℃，溶液顏色會在10min內變藍最后變成酒紅色，使溶液自然冷卻到50℃，最后置于4℃封存；(2)制備金標蛋白溶液：將膠體金溶液pH調節至8.2，再逐滴加入單克隆抗體4D5，至其終濃度為12.5μg/ml，加入5％的牛血清蛋白溶液(BSA)使其終濃度為1％，繼續攪拌振蕩30min，之后4℃冰箱靜置2h，通過差速離心，收集金標蛋白，用緩沖液溶解4℃保存；(3)試紙條制備：試紙條由PVC板、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊所組成，上端為手持部分，即吸水墊部分；中端為反應區，即硝酸纖維素膜區域，其中C線為質控線，按照2mg/ml包被羊抗鼠IgG，T線為檢測線，按照2mg/ml包被抗弓形蟲SAG3單克隆抗體，硝酸纖維素膜最佳封閉條件為1h；在硝酸纖維素膜之上放有金標墊，吸附1:5稀釋的金標蛋白溶液；下端為樣品區(檢測孔)，即樣品墊區域；將試紙條各部分組裝完畢后，在切割機上將試紙條切割成4mm寬的條帶，密封保存備用。本發明試劑盒的應用：(1)檢測程序：將待檢血清用樣品稀釋液稀釋，其最佳稀釋倍數為1:200，取100μl加入到試紙條下端的樣品區中，靜置10-15min后觀察；(2)結果判定：樣品檢測的試...