本發明涉及蛋白芯片及試劑盒，特別是涉及一種能夠檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的蛋白芯片以及包含該蛋白芯片的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
隨著在上世紀60年代phillips、allfrey等科學家對組蛋白乙酰化的首次發現，在過去的50年中，人類對蛋白質乙酰化的了解有了長足的進步。蛋白質乙酰化修飾分為兩種，一種為蛋白翻譯時n端的乙酰化修飾，對蛋白的合成、定位以及穩定性都有影響。另一種為蛋白翻譯后在賴氨酸殘基ε-氨基上的乙酰化修飾，在乙酰基轉移酶(hat)催化下，乙酰輔酶a的乙酰基團被轉移到目的蛋白的賴氨酸，這一過程同時也受到組蛋白去乙酰化酶(hdac)的可逆調節。乙酰化是蛋白質翻譯后修飾的重要組成部分，組蛋白乙酰化可以促使染色體打開超螺旋結構，促進基因轉錄。通過蛋白質組學的研究發現，除了組蛋白外，在細胞質和線粒體中均存在大量的蛋白質乙酰化，參與到了rna剪切、細胞周期、dna復制、轉錄、細胞核轉運等多種生物過程中。另外大量中間代謝酶都能夠被乙酰化修飾，其動態調節過程對控制細胞代謝具有重要作用。乙酰化水平的調節失控能夠導致多種疾病，多種轉錄因子的乙酰化水平(包括p53、stat3、hif-1α等)都影響著癌癥的發生和發展，目前已有多種以hdac為靶點的臨床藥物如saha(伏立諾他)被用于癌癥相關疾病的治療。因此，如何高效的檢測出樣本中蛋白質的乙酰化水平在科研、醫療診斷和醫藥開發領域都有重要意義。
盡管賴氨酸乙酰化作為一種常見的翻譯后修飾具有重要作用，但是由于相對較低的豐度水平，乙酰化水平的檢測需要在總蛋白中對乙酰化蛋白進行富集。然而乙酰化抗體對乙酰化蛋白的親和性較低，不能滿足直接對乙酰化蛋白進行富集，而是需要將蛋白消化成肽段后，再使用抗體富集乙酰化肽段，經過質譜分析的手段來檢測。眾所周知的是，質譜分析需要對樣本進行片段化處理，這個預處理過程非常復雜，需要耗費大量的時間和人力，成本高昂，同時質譜分析對樣本的需求量也較高，而臨床上的少量樣本也限制了質譜技術的運用。
蛋白芯片是一種高通量的蛋白功能分析技術，是近年發展起來的一項生物檢測技術。利用這項技術，通過將大量抗體或抗原密集地點制在固相載體上，具有可同時檢測多種蛋白質且樣本需求量小的特點，對于高通量基因表達的研究具有非常重要的意義。但是，目前尚沒有關于用于檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的蛋白芯片及試劑盒等相關技術的公開。
本案發明人依據在蛋白芯片領域的多年研究經驗，開發出了一種蛋白芯片，能夠用于檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平，同時還公開了該蛋白芯片的制備方法、應用、試劑盒及檢測方法等相關技術，發明人開發的上述技術填補了用于檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的蛋白芯片領域的技術空白。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題之一在于，提供一種蛋白芯片，能夠同時檢測樣品中多個蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平。
本發明所要解決的技術問題之二在于，提供所述蛋白芯片的應用。
本發明所要解決的技術問題之三在于，提供一種試劑盒，包含所述蛋白芯片，能夠檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平。
本發明所要解決的技術問題之四在于，提供所述試劑盒用于檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的檢測方法。
為解決上述技術問題之一，本發明提供的蛋白芯片，包括基片和陣列式分布的捕獲抗體，所述捕獲抗體包括但不限于以下68種特異性抗體：aml1,ampk,ape,ar,α-tubulin,β-catenin,bcl-6,beclin,braf,myb,c-myc,creb,ctbp2,dek,e2f1,e2f2,e2f3,egfr,her2,her4,er,eklf,fen1,foxo1,foxo3,foxo4,gata1,gata2,gata3,gata4,gr,hif-1α,hmga1,hmgb1,hsp90,irf2,irs1,kras,ku70,mdm2,mef2a,neil2,nfκb,notch1,p21,p53,p65,pgc1,pten,rb1,kpna2,runx2,smad2,smad4,smad7,sox4,sox9,srebp1,sry,stat1,stat2,stat3,tdg,vegf,wrn,β-actin,gapdh,bsa。
所述捕獲抗體為以下68種特異性抗體：aml1,ampk,ape,ar,α-tubulin,β-catenin,bcl-6,beclin,braf,myb,c-myc,creb,ctbp2,dek,e2f1,e2f2,e2f3,egfr,her2,her4,er,eklf,fen1,foxo1,foxo3,foxo4,gata1,gata2,gata3,gata4,gr,hif-1α,hmga1,hmgb1,hsp90,irf2,irs1,kras,ku70,mdm2,mef2a,neil2,nfκb,notch1,p21,p53,p65,pgc1,pten,rb1,kpna2,runx2,smad2,smad4,smad7,sox4,sox9,srebp1,sry,stat1,stat2,stat3,tdg,vegf,wrn,β-actin,gapdh,bsa。
所述基片包括經修飾、或者改性后的玻璃載片、塑料載片、膜片等可以用于蛋白點制的材質。
所述蛋白芯片，還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為生物素標記的bsa(bsa-生物素)和乙酰化bsa(ac-bsa)，所述陰性對照為bsa(牛血清白蛋白)、mouseigg和rabbit normaligg。
所述蛋白芯片，是分別將所述捕獲抗體、陽性對照和陰性對照點制于所述基片上制成的。
所述陽性對照、陰性對照和每一種捕獲抗體在芯片上均點制3個重復點。
上述68種特異性抗體是經過精心挑選的。為實現高效率的同時檢測多種蛋白質的乙酰化水平，發明人對大量的可能發生蛋白質乙酰化的抗體進行了深入研究，篩選出了上述68種可發生明顯乙酰化修飾、反應特異性好、檢測信號明顯且信號與抗原濃度呈較好的線性關系的特異性抗體，本發明公開的68種特異性抗體可以很好的用于蛋白質乙酰化修飾水平的檢測，其檢測結果可以從整體上反應檢測樣品的蛋白質乙酰化修飾水平。同時依托上述68種特異性抗體，可以針對不同實驗的需要，增加并點制潛在的能夠發生蛋白質乙酰化或需要檢驗蛋白質乙酰化修飾水平是否發生變化的其他不同的抗體，能夠滿足個性化定制的要求。
為解決上述技術問題之二，本發明還公開所述蛋白芯片用于制備檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的裝置的應用。本發明的蛋白芯片可用于制備檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的裝置，例如試劑盒等，滿足在科研、醫療診斷和醫藥開發等領域的使用需求。
為解決上述技術問題之三，本發明提供的試劑盒，包括所述的蛋白芯片。
所述試劑盒，還包括抗乙酰化賴氨酸抗體、hrp(辣根過氧化物酶)標記的檢測二抗、生物素標記的酪胺、信號擴增緩沖液、30％h2o2、熒光偶聯鏈霉親和素、蛋白裂解液、nhs-生物素、蛋白標記緩沖液、標記終止緩沖液和超濾管。
為解決上述技術問題之四，本發明提供的所述試劑盒用于檢測蛋白質翻譯后乙酰化修飾水平的檢測方法如下(其檢測流程如圖1所示)：
1、樣品的準備
①檢測樣品：取細胞或組織樣本，加入蛋白裂解液，充分反應后離心，收集上清液并進行定量，即得到檢測樣品(用于檢測乙酰化信號)；
②本底樣品：取部分檢測樣品，加入蛋白標記緩沖液混勻，加入nhs-生物素進行標記，再加入標記終止緩沖液終止標記，然后加入1xpbs(磷酸緩沖鹽溶液)，放入超濾管，經離心后取超濾液保存，即得到本底樣品(用于檢測蛋白本底信號)。
2、蛋白芯片雜交
①先將蛋白芯片用bsa封閉，然后取用等量的檢測樣品和本底樣品，在蛋白芯片的兩個反應室中分別加入所取用的檢測樣品和本底樣品，將其與蛋白芯片進行雜交孵育，清洗；
②檢測組：在反應室中繼續加入抗乙酰化賴氨酸抗體，孵育，清洗，加入hrp標記的檢測二抗，孵育，清洗，加入信號擴增緩沖液和生物素標記的酪胺反應，最后再加入熒光偶聯 鏈霉親和素，放置，清洗，甩干；
③本底組：在反應室中加入熒光偶聯鏈霉親和素，放置，清洗，甩干。
3、數據采集分析
使用芯片掃描儀讀取檢測組和本底組的熒光信號，用genepixpro6.0軟件對獲得的熒光信號進行分析，采集每個捕獲抗體點上的熒光信號中位值并以此計算出重復點的平均值和cv值。反應室中加入未標記的蛋白樣品及抗乙酰化賴氨酸抗體的，其掃描得到的信號即為乙酰化信號，而反應室中加入生物素標記的蛋白樣品的，其掃描得到的信號即為蛋白本底信號。樣品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信號/本底信號的比值來表示，該比值越大則說明樣品蛋白的乙酰化水平越高。
樣本間乙酰化水平的差異根據乙酰化信號/本底信號的比值來加以分析。
本發明首次提供了一種能夠同時檢測樣品中多個蛋白質乙酰化修飾水平的蛋白芯片及試劑盒，相較于現有技術中采用質譜分析檢測蛋白質乙酰化水平的方法，本發明無需對蛋白質進行復雜的酶切純化等預處理過程，可以解決目前檢測蛋白質乙酰化修飾費時費力的問題，而且可同時檢測樣品中的多種蛋白質，檢測更加全面，檢測效率高，且樣品需求量小，對于高通量基因表達的研究具有非常重要的意義，同時依托此平臺，可以針對不同實驗的需要點制不同的抗體，能夠滿足個性化定制的要求。
附圖說明
圖1是乙酰化蛋白芯片操作流程圖。
圖2蛋白芯片檢測tsa誘導細胞的乙酰化變化。
圖3蛋白芯片檢測p300過表達細胞的乙酰化變化。
具體實施方式
下面將結合實驗數據及附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發明的一部分實施方式，而不是全部的實施方式。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施方式，都屬于本發明保護的范圍。
實施例一
蛋白芯片的制備方法如下：
將68種特異性抗體用pbs-15％甘油稀釋至0.5μg/μl，使用芯片點制平臺將抗體逐一點制 到芯片上。每個點直徑200μm，點與點間距500μm；使用生物素標記的bsa(bsa-生物素)、乙酰化bsa(ac-bsa)作為陽性對照，使用bsa、mouseigg、rabbitnormaligg作為陰性對照；按照一定順序放入384孔板中，使用芯片點樣儀進行芯片點制，陽參、陰參和捕獲抗體均點制3個重復點，制備成蛋白質芯片。所述68種特異性抗體為：aml1,ampk,ape,ar,α-tubulin,β-catenin,bcl-6,beclin,braf,myb,c-myc,creb,ctbp2,dek,e2f1,e2f2,e2f3,egfr,her2,her4,er,eklf,fen1,foxo1,foxo3,foxo4,gata1,gata2,gata3,gata4,gr,hif-1α,hmga1,hmgb1,hsp90,irf2,irs1,kras,ku70,mdm2,mef2a,neil2,nfκb,notch1,p21,p53,p65,pgc1,pten,rb1,kpna2,runx2,smad2,smad4,smad7,sox4,sox9,srebp1,sry,stat1,stat2,stat3,tdg,vegf,wrn,β-actin,gapdh,bsa。
上述68中特異性抗體是經過精心挑選的，可以針對不同實驗的需要，依托實施例一的蛋白芯片，點制具有針對性的不同的抗體，并用于檢測樣品的蛋白質乙酰化水平，能夠滿足個性化定制的要求。
實施例二：
基于實施例一的蛋白芯片的試劑盒的檢測方法：
1、樣品的準備
①檢測樣品：取106–5x106細胞或10–40mg組織樣本，加入100–200μl蛋白裂解液，在4℃下放置30分鐘并不時振蕩，然后在4℃下10000g離心15分鐘，收集上清液并進行定量，即得到檢測樣品(用于檢測乙酰化信號)；
②本底樣品：取100μg檢測樣品，加入蛋白標記緩沖液混勻至50μl，加入2μlnhs-生物素在室溫下反應2小時進行標記，再加入1.6μl標記終止緩沖液于室溫反應30分鐘終止標記，然后加入450μl1xpbs，放入超濾管，經4℃10000g離心30分鐘后取超濾液于-20℃保存，即得到空白樣品(用于檢測蛋白本底信號)。
2、蛋白芯片雜交
①先將蛋白芯片用1％bsa室溫封閉1h，然后取用等量的檢測樣品和空白樣品，在蛋白芯片的兩個反應室中分別加入所取用的檢測樣品和空白樣品，將其與蛋白芯片在37℃進行雜交孵育1.5小時后清洗；
②檢測組：在反應室中繼續加入抗乙酰化賴氨酸抗體，37℃孵育1小時，pbst清洗，加入hrp標記的檢測二抗，室溫孵育1小時，pbst清洗后，加入含有0.0015％h2o2信號擴增緩沖液和生物素標記的酪胺室溫反應10分鐘，最后再加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素， 室溫放置30min，清洗，甩干；
③本底組：在反應室中加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素，室溫放置30min，清洗，甩干；
所有清洗過程都使用pbst清洗3次，每次5分鐘。
3、數據采集分析
使用芯片掃描儀讀取檢測組和空白組的熒光信號，用genepixpro6.0軟件對獲得的熒光信號進行分析，采集每個捕獲抗體點上的中位值并以此計算出重復點的平均值和cv值。反應室中加入未標記的蛋白樣品及抗乙酰化賴氨酸抗體的，其掃描得到的信號即為乙酰化信號，而反應室中加入生物素標記的蛋白樣品的，其掃描得到的信號即為蛋白本底信號。檢測樣品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信號/本底信號的比值來表示，該比值越大則說明樣品蛋白的乙酰化水平越高，不同樣本之間乙酰化水平的差異可以通過比較不同樣本的乙酰化信號/本底信號的比值來加以分析。
實施例三
tsa(trichostatina)處理細胞模型
1、實驗原理
tsa(trichostatina)是一種可逆的hdac(histonedeacetylase，組蛋白去乙酰化酶)抑制劑，通過抑制蛋白去乙酰基團的過程，提高細胞中的乙酰化水平。用dmso和tsa分別處理樣本，dmso處理為對照樣本，用本發明的蛋白芯片及試劑盒檢測經tsa處理后對比經dmso處理后的細胞中乙酰化水平的變化，以說明本發明的檢測效果。
2、樣本制備
胃癌細胞mkn45在含10％fbs(fetalcalfserum，胎牛血清)的rapi1640培養基中培養至70％的密度，分別用dmso和3μmtsa處理18小時后收集細胞蛋白。
3、試驗方法
a、取106經dmso和tsa處理的mkn45細胞，加入100μl蛋白裂解液4℃裂解30min，10000g離心15min后收集上清，測定濃度，分別取其中100μg蛋白進行生物素標記，用于檢測蛋白本底信號，其余用于檢測乙酰化信號；
b、取出蛋白芯片用1％bsa室溫封閉1h，分別取等量的dmso處理組和tsa處理組的檢測樣品和本底樣品加入到芯片的不同兩個反應室中，在37℃進行雜交孵育1.5小時后清洗；
c、在檢測組反應室中，繼續加入抗乙酰化賴氨酸抗體，37℃孵育1小時，pbst清洗，加入hrp標記的檢測二抗，室溫孵育1小時，pbst清洗后，加入含有0.0015％h2o2信號擴 增緩沖液和生物素標記的酪胺室溫反應10分鐘，最后再加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素，室溫放置30min，清洗，甩干；在本底組反應室中加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素，室溫放置30min，清洗，甩干；
d、使用芯片掃描儀讀取dmso處理組和tsa處理組樣本熒光信號，用genepixpro6.0軟件對其進行分析，比較dmso處理和tsa處理組兩組樣本之間乙酰化信號/本底信號比值的差異。
4、實驗結果
mkn45細胞經過tsa處理，通過wb可以發現乙酰化水平明顯提高(圖2a)。我們以此tsa誘導的細胞為模型，用本發明來檢測對照樣本(control組)和tsa處理樣本間的乙酰化差異，通過比對發現gata1和histone(組蛋白)蛋白的乙酰化水平有相對明顯的上升，分別上調了1.6倍和3.1倍(圖2b、2c)。實驗結果與預期相符，說明本發明的蛋白芯片及試劑盒可以很好的用于檢測蛋白質乙酰化修飾水平。
實施例4
p300過表達細胞模型檢測
1、實驗原理
p300是一種乙酰基轉移酶(hat)，其底物包括幾乎所有組蛋白以及大量的非組蛋白，通過過表達p300可以從另一個方面檢測細胞乙酰化水平的變化，從而對蛋白芯片加以驗證。
2、樣本制備
胃癌細胞ags在含10％fbs的rapi1640培養基中培養至70％的密度，使用lipofectamine2000分別轉染gfp(greenfluorescentprotein，綠色熒光蛋白)和p300質粒，轉染48小時后分別收集細胞rna和蛋白質。rna經反轉錄后用以檢測細胞過表達p300水平，蛋白用以和本發明雜交檢測乙酰化水平。
3、試驗方法
a、rna提取、反轉錄與定量：
分別取105空白和過表達p300的mkn45細胞，加入1mltrizol裂解液，rna提取過程按照trizol說明書進行操作，反轉錄與熒光定量按照takara反轉錄試劑盒和sybr熒光定量試劑盒說明書進行操作。
b、蛋白質收集、芯片雜交檢測：
b1.取105空白和過表達p300的mkn45細胞，加入裂解液4℃裂解30min，10000g離心15min后收集上清，進行生物素標記，用于檢測蛋白本底信號，其余用于檢測乙酰化信號；
b2.取出蛋白芯片，分別取等量檢測樣品和本底樣品加入到芯片的反應室中，在37℃進行雜交孵育1.5小時后清洗；
b3.在檢測組反應室中，繼續加入抗乙酰化賴氨酸抗體，37℃孵育1小時，pbst清洗，加入hrp標記的檢測二抗，室溫孵育1小時，pbst清洗后，加入含有0.0015％h2o2信號擴增緩沖液和生物素標記的酪胺，室溫反應10分鐘，最后再加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素，室溫放置30min，清洗，甩干；在本底組反應室中加入0.1μg/ml熒光偶聯鏈霉親和素，室溫放置30min，清洗，甩干；
b4.使用芯片掃描儀讀取空白細胞和過表達p300細胞樣本的熒光信號，用genepixpro6.0軟件對其進行分析，比較空白細胞和過表達p300細胞之間乙酰化信號/本底信號比值的差異。
4、實驗結果
細胞轉染p300質粒48小時后p300mrna顯著上升(圖3a)，用蛋白芯片檢測后，發現與對照樣本(control組)相比，p300過表達細胞模型的包括histone、gata1、eklf、tubulin(微管蛋白)等多個蛋白都發生了乙酰化水平上調(圖3b、3c),其中gata1和tubulin均上調了1.6倍，histone和eklf上調了1.3倍。實驗結果與預期相符，說明本發明的蛋白芯片及試劑盒可以很好的用于檢測蛋白質乙酰化修飾水平。
綜上所述，上述各實施例及附圖僅為本發明的部分較佳實施例而已，并不用以限定本發明的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應包含在本發明的保護范圍內。