一種檢測(cè)結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種檢測(cè)結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是全球三大傳染性疾病之一，中國(guó)結(jié)核患者數(shù)量居全球第二位，全國(guó)結(jié)核感染率為44.5％，平均每年新發(fā)病例91.2萬(wàn)，死亡4.7萬(wàn)人。結(jié)核病給人們帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。隨著研究的不斷深入，結(jié)核病的臨床診斷方法取得了較大的發(fā)展，免疫學(xué)檢測(cè)方法是現(xiàn)階段檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的重要輔助方法之一，其中以抗原特異性刺激后的γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)(igra)為主。igra方法通常采用結(jié)核分枝桿菌特異性的rd(regionofdifference)區(qū)基因編碼抗原，因而較好的避免已接種bcg(卡介苗)的干擾。然而，現(xiàn)有報(bào)道表明人群存在較嚴(yán)重的非結(jié)核分枝桿菌感染情況，現(xiàn)有商用試劑盒t-spot.tb和quantiferon(qft)-it在結(jié)核病診斷應(yīng)用中的效果不甚理想，表現(xiàn)為其檢測(cè)的敏感性均為80％左右。其中主要原因是檢測(cè)方法分別是elispot和elisa法，方法的靈敏度均有限，在診斷的特異性和敏感性方面還存在一些不足，需要加以改進(jìn)?，F(xiàn)有研究表明，酶促化學(xué)發(fā)光法通過(guò)酶和發(fā)光底物的放大途徑，可達(dá)到數(shù)十倍至數(shù)百 倍于elisa法的靈敏度。目前尚未見(jiàn)有磁珠化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)核感染試劑盒的報(bào)道，宜進(jìn)一步研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)利用化學(xué)發(fā)光與酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合，具有更高靈敏度的檢測(cè)結(jié)核感染試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒本發(fā)明提供了一種檢測(cè)結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒，所述試劑盒包括：鏈霉親合素磁珠混懸液、γ干擾素校準(zhǔn)品、植物凝集素(pha)、結(jié)核桿菌特異性抗原多肽、無(wú)血清培養(yǎng)液(aim-v)、生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗、發(fā)光底物液(aps5)、校準(zhǔn)品稀釋液、抗體稀釋液和洗滌液。具體的，本發(fā)明所述試劑盒由下列組分各一份組成：(1)鏈霉親合素磁珠混懸液，10ml/支；(2)γ干擾素校準(zhǔn)品，1μg/瓶；(3)pha植物凝集素，10ml/瓶；(4)結(jié)核桿菌特異性抗原多肽,10ml/瓶；(5)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(aim-v),10ml/瓶；(6)生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管；(7)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管；(8)發(fā)光底物液(aps5)，25ml/瓶；(9)校準(zhǔn)品稀釋液,10ml/瓶；(10)抗體稀釋液，10ml/瓶；(11)洗滌液，20ml/瓶。本發(fā)明試劑盒所述的鏈霉親合素磁珠混懸液作為酶聯(lián)免疫和固相分離載體，用于捕獲抗原-抗體復(fù)合物；濃度為0.1mg/ml。所述的γ干擾素校準(zhǔn)品為白色凍干粉，濃度為1μg/ml。所述的pha植物凝集素作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度為100-200μg/ml。所述的結(jié)核桿菌特異性抗原多肽，特異性刺激樣本分泌γ干擾素，濃度為5-20μg/ml。所述多肽是一種氨基酸聚合物所述的無(wú)血清培養(yǎng)液(aim-v)作為空白對(duì)照。所述的二種抗人γ干擾素單抗分別為生物素標(biāo)記單抗和堿性磷酸酶標(biāo)記單抗，這兩種單抗與抗原反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物。本發(fā)明試劑盒所述生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，稀釋比為1:2000；堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗,稀釋比為1:200。所述抗原可以天然分離得到，也可以通過(guò)克隆技術(shù)和基因工程的方法獲得融合蛋白，此為行業(yè)內(nèi)所熟悉的公知技術(shù)。本發(fā)明試劑盒所述的發(fā)光底物液aps5為堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物。所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液含1％牛血清白蛋白，0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液及0.02％procline-300。所述抗體稀釋液含1％牛血清白蛋白，0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液,1mnacl及0.02％procline-300。所述洗滌液為三羥甲基氨基甲烷洗滌液ph值為7.4,含0.8gnacl,0.02gkcl,0.3gtris堿及0.05％吐溫-20。本發(fā)明試劑盒使用不透明白色酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)。所述的不透明白色酶標(biāo)板為96孔可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒可用于臨床檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染人群，包括有臨床癥狀的活動(dòng)性結(jié)核病人和無(wú)癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于發(fā)熱，咳嗽，胸痛，咳血，胸片異常等。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)比較，通過(guò)檢測(cè)校準(zhǔn)品中γ干擾素的含量確定本試劑盒檢測(cè)靈敏度為0.55pg/ml，市場(chǎng)上已有試劑盒的靈敏度為2-8pg/ml，結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明試劑盒的靈敏度高。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒可用于臨床檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染人群，包括有臨床癥狀的活動(dòng)性結(jié)核病人和無(wú)癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于發(fā)熱，咳嗽，胸痛，咳血， 胸片異常等。本發(fā)明試劑盒利用磁珠的技術(shù)特點(diǎn)，結(jié)合生物素-親和素酶聯(lián)免疫放大作用及堿性磷酸酶標(biāo)記的酶促化學(xué)發(fā)光體系檢測(cè)結(jié)核抗原特異性t細(xì)胞分泌的γ干擾素水平，具有非常高的靈敏度。本發(fā)明能有效地檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病人和潛伏感染者，與現(xiàn)有技術(shù)比較較更具技術(shù)和價(jià)格優(yōu)勢(shì)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)，易于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化操作；無(wú)需昂貴的特殊儀器，對(duì)操作人員技術(shù)水平及實(shí)驗(yàn)室條件要求相對(duì)較低，適于基層醫(yī)院推廣使用，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1：實(shí)施例1以γ干擾素校準(zhǔn)品系列濃度值為橫坐標(biāo)(x軸)，發(fā)光值為縱坐標(biāo)(y軸)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2：實(shí)施例2受試者工作特性曲線(roc)分析，橫坐標(biāo)為100％-特異性，縱坐標(biāo)為敏感性(％)，得到曲線下面積(auc)為91.3％，結(jié)核病人陽(yáng)性檢出率為91.5％，健康人群陰性檢出率為89.8％，總符合率為90.6％。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述實(shí)施方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，所用試劑市售得到。不透明96孔白色酶標(biāo)板，購(gòu)自康寧公司鏈霉親合素磁珠混懸液，10ml/瓶,濃度為0.1mg/ml,購(gòu)自羅氏γ干擾素校準(zhǔn)品，1μg/瓶，購(gòu)自mabtech公司pha植物凝集素，10ml/瓶,濃度為20μg/ml,購(gòu)自sigma公司結(jié)核桿菌特異性抗原多肽,10ml/瓶,濃度為10ug/ml,由吉爾生化合成無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(aim-v),10ml/瓶,購(gòu)自gibco公司生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管，稀釋比為1:2000,購(gòu)自生命科學(xué)公司堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管,稀釋比為1:200，購(gòu)自mabtech公司發(fā)光底物液(aps5)，25ml/瓶，購(gòu)自美凱特科技有限公司抗體稀釋液：10ml/瓶，含1％牛血清白蛋白，ph7.4的磷酸鹽緩沖液,1mnacl及0.02％procline-300。自配制：取ph7.4的磷酸鹽緩沖液10ml(購(gòu)自上海百賽生物公司),與90ml去離子水充分混勻，得到100ml磷酸鹽緩沖液，后加入牛血清白蛋白1g,攪拌器充分混勻后加nacl5.8g，procline-30020μl充分?jǐn)嚢杌靹虻玫娇贵w稀釋液100ml,分裝為10ml×10瓶。校準(zhǔn)品稀釋液：10ml/瓶，含1％牛血清白蛋白，ph7.4的磷酸鹽緩沖液及0.02％procline-300。自配制：取ph7.4的磷酸鹽緩沖液10ml(購(gòu)自上海百賽生物公司),與90ml去離子水室溫充分混勻，得到100ml磷酸鹽緩沖液，后加入牛血清白蛋白1g，procline-30020μl攪拌器充分混勻得到校準(zhǔn)品稀釋液100ml,分裝為10ml×10瓶。洗滌液為三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tbst)：自配制：80ml去離子水溶解8gnacl,0.2gkcl,3gtris堿(三羥甲基氨基甲烷)，用鹽酸調(diào)整ph值至7.4，去離子水定容至100ml,再加入吐溫-200.5ml,室溫充分混勻，得到三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液100ml,分裝為20ml×5瓶。每瓶與180ml去離子水室溫混勻后得到200ml洗滌液。檢測(cè)樣本來(lái)源：臨床結(jié)核感染陽(yáng)性樣本47例，陰性樣本49例，由上海市肺科醫(yī)院提供。實(shí)施例1：酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法用于γ干擾素檢測(cè)的靈敏度測(cè)定。1.生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗為一抗，用抗體稀釋液(含1％牛血清白蛋白，0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖液,1mnacl及0.02％procline-300)1/2000倍稀釋。2.堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗為二抗，抗體稀釋液(含1％牛血清白蛋白，0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖液,1mnacl及0.02％procline-300)1/200倍稀釋。3.將γ干擾素校準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,10ml/支，含1％牛血清白蛋白，0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖液及0.02％ procline-300)作系列稀釋?zhuān)瑵舛纫来螢?00、100、25、6.25、1.56、0pg/ml(皮克/毫升)。4.96孔白色酶標(biāo)板中分別加入50μl一抗，50μl二抗和100μlγ干擾素校準(zhǔn)品。5.振蕩混勻后，37℃恒溫箱溫育60min。6.每孔分別加入100ul磁珠，濃度為0.1mg/ml。7.振蕩混勻后，37℃恒溫箱溫育30min。8.取出酶標(biāo)板，于磁力板上靜置3-5分鐘以分離磁珠與上清液，棄上清液。9.用三羥甲基氨基甲烷洗滌液(tbst)洗3次，每次300μl。10.每孔加入200μl發(fā)光底物液(aps5)，于thermo發(fā)光儀(thermo公司)中讀取發(fā)光值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，利用本發(fā)明的試劑盒得到線性方程為y＝1.5899x-0.28821,相關(guān)系數(shù)r＝0.999,表明本試劑盒線性關(guān)系良好。結(jié)果如下：表1標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋后檢測(cè)結(jié)果校準(zhǔn)品(pg/ml)均值400252.0510061.702516.826.254.291.561.0100.35平行測(cè)定十個(gè)空白孔，計(jì)算其平均值與2倍標(biāo)準(zhǔn)差(sd)之和為0.5518， 代入線性方程計(jì)算本試劑盒檢測(cè)靈敏度為0.53pg/ml。表2檢測(cè)次數(shù)空白檢測(cè)值10.435620.315230.529640.345550.471260.300670.302380.436890.2804100.4451均值0.3862標(biāo)準(zhǔn)差(sd)0.0828靈敏度(均值+2sd)0.5518實(shí)施例2：酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法用于結(jié)核感染檢測(cè)的靈敏度和特異性。樣本處理：按每個(gè)測(cè)定樣本需細(xì)胞培養(yǎng)板3孔，每孔所需樣本量1ml，即空白對(duì)照孔、測(cè)試孔、植物凝集素pha陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔依次加入無(wú)血清培養(yǎng)液(aim-v)0.1ml、在測(cè)試孔內(nèi)加入結(jié)核桿菌特異性多肽抗原0.1ml、在pha對(duì)照孔內(nèi)加入植物凝集素pha0.1ml，各孔混勻后，置于37℃培養(yǎng)箱孵育20小時(shí)后，取上清液各0.1ml，待測(cè)。1.取生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗為一抗，抗體稀釋液1/2000倍稀釋。2.取堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗為二抗，抗體稀釋液1/200倍稀釋。3.96孔白色板中分別加入50ul一抗、50ul二抗和100ulγ干擾素校準(zhǔn)品或樣本。4.振蕩混勻后，37℃溫育60min。5.每孔分別加入100μl磁珠,濃度為0.1mg/ml。6.振蕩混勻后，37℃溫育30min。7.取出酶標(biāo)板，于磁力板上靜置3-5分鐘以分離磁珠與上清液，棄上清液。8.用三羥甲基氨基甲烷洗滌液(tbst)洗3次，每次300ul。9.每孔加入200ul發(fā)光底物液(aps5)，于thermo發(fā)光儀中讀取發(fā)光值。10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算樣本中γ干擾素含量中ifn-γ含量。結(jié)果判定：測(cè)試孔值-空白孔值≥10(pg/ml)并且≥測(cè)試孔/4，此時(shí)判定為陽(yáng)性，否則為陰性。檢測(cè)結(jié)果如下：表3磁珠化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)正常人γ干擾素含量結(jié)果(pg/ml)表4磁珠化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)核病人γ干擾素含量結(jié)果(pg/ml)使用graphpadprism5軟件(醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)網(wǎng)下載)對(duì)這兩個(gè)人群檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行受試者工作特性曲線(roc)分析，如圖2，得到曲線下面積(auc)為91.3％，判定值為10pg/ml，此時(shí)結(jié)核病人陽(yáng)性檢出率為91.5％(43/47)，健康人群陰性檢出率為89.8％(44/49)，總符合率為90.6％。因此表明本發(fā)明試劑盒敏感性91.5％，特異性為89.8％。實(shí)施例3用t-spot試劑盒檢測(cè)相同樣本進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)核病人樣本47例和健康人群樣本49例，結(jié)果如下表5t-spot試劑盒檢測(cè)正常人結(jié)果表6t-spot試劑盒檢測(cè)結(jié)核病人結(jié)果根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，t-spot試劑盒檢測(cè)敏感性為85.1％(40/47)，特異性為87.7％(43/49),而本發(fā)明試劑盒檢測(cè)敏感性為91.5％，因此具有更高的檢測(cè)敏感性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則內(nèi)所做的任何修改，等同替換，改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12