一種測定樣品中抗體濃度的方法與流程

免疫熒光是一種用于使用熒光顯微鏡的光學顯微技術的技術，并且主要用于微生物樣品。該技術利用抗體對其抗原的特異性，使熒光染料靶向細胞內的特定生物分子靶標，因此通過樣品使靶標分子的分布可視化。免疫熒光是廣泛使用的免疫染色的實例，并且是利用熒光團使抗體的位置可視的免疫組織化學的具體實例。CN103642261、WO2013153687、JP2012224646、US2012296098、WO2012149180、EP2312317、US20110143387、JP2010037511和US4937198描述了熒光探針及其用途的實例。

Nielsen等(Methods 22，71-76，2000)、WO9613722、WO2009078876、EP0957365、WO2010141249和US2006105397描述了熒光偏振免疫測定法，并且其可用于快速、準確地檢測抗體或抗原。該測定法是基于溶液中小分子的旋轉比大分子更快以及旋轉率可通過熒光偏振確定的原則。當樣品中的抗體與標記有熒光探針的抗體的特異性抗原一起孵育時，可以通過熒光偏振檢測樣品中抗體-抗原復合物的存在。該技術的問題是，為了檢測給定的抗體，需要該抗體的特異性抗原，這使得該測定對許多公司來說是昂貴的。該技術的另一個問題是不適合用于定量檢測樣品中的抗體。

日本專利申請號2005-337805描述了一種使用熒光偏振測定抗體或抗原的方法，在一個實施方案中，使用重組通用(generic)抗體結合蛋白(蛋白A)和短壽命熒光染料(Alexa 647)的綴合物定量測定人IgG。該日本文獻描述了使用濃度為1nM或10nM的熒光標記蛋白A，其分別相當于0.00005或0.0005mg/ml。預期該蛋白A與抗體按1:1的比例結合，并且由于它們的分子量分別為50,000Da和150,000Da，這意味著按1:3的重量比結合。從而1mg的蛋白A將結合3mg的抗體，因此將是“飽和的”，所述“飽和的”意味著抗體濃度的任何增加不應導致偏振值的增加，因為不會發生更多的結合。因此，1nM和10nM的蛋白A將具有在0.000015mg/ml和0.00015mg/ml抗體濃度的IgG濃度下飽和(即不增加任何更多的特異性結合)的FP信號。這顯然不會出現在該日本專利的附圖中。唯一明顯的增加發生在該飽和極限之后，其中偏振的任何變化不是由于蛋白A與抗體的特異性結合，而是由于人為效應，例如隨著抗體濃度增加粘度增加。因此，該文獻中呈現的數據表明，在實踐中該發明不起作用。

本發明的目的是克服上述問題中的至少一個。

技術實現要素：

本發明是基于如下發現：可以使用熒光偏振和示蹤劑來測定樣品中的準確和靈敏的抗體濃度或滴度，所述示蹤劑包括與通用免疫球蛋白結合蛋白(如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L(以下稱為“通用抗體結合蛋白”))綴合的長壽命熒光染料。這些蛋白質結合到所有免疫球蛋白G(IgG)分子的恒定區，并且因此可以用于測定任何IgG分子的濃度。圖6顯示了使用與短壽命染料相比的長壽命染料的影響。此外，本申請人已經出乎意料地發現，除去蛋白質的一部分(例如，除去了一個或多個抗體結合位點或非抗體結合位點)的截短通用抗體結合蛋白的使用提供了靈敏度的進一步提高。圖7顯示了使用與部分截短蛋白質(mw29KD)相比的高度截短IgG結合蛋白(mw7kD)的影響。

在第一方面中，本發明提供了一種測定液體樣品中抗體滴度的方法，包括以下步驟：

將液體樣品與抗體結合探針在反應室中一起孵育以提供反應混合物，所述抗體結合探針包括與熒光染料(通常為長壽命熒光染料)綴合的通用抗體結合蛋白；

測定反應室中的反應混合物的熒光偏振，以檢測激發光和發射光之間的偏振變化；和

使偏振變化與所述樣品的抗體滴度相關聯。

在使用長壽命熒光染料的實施方案中，優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少4ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少5ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少6ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少7ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少8ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少9ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少10ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少15ns。優選地，所述長壽命熒光染料的熒光壽命為至少20ns。

優選地，所述熒光染料是FITC。優選地，所述熒光染料選自FITC和壽命為至少5ns的長壽命熒光探針。

優選地，所述通用抗體結合蛋白是蛋白A或蛋白。

優選地，所述通用抗體結合蛋白是截短通用抗體結合蛋白。

優選地，所述樣品是細胞培養液。

優選地，所述細胞是真核的或原核的生產細胞。

優選地，所述反應室是多孔板的孔。

優選地，所述通用抗體結合蛋白(即通用IgG結合蛋白)的分子量不大于15kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。更優選地，所述通用抗體結合蛋白(即通用IgG結合蛋白)的分子量不大于10kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。理想地，所述通用抗體結合蛋白(即通用IgG結合蛋白)的分子量不大于5kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。

在第二方面中，本發明涉及測定多個細胞培養樣本中抗體滴度的快速、高通量的方法，所述細胞培養樣品包括抗體生產細胞(通常是IgG生產細胞，理想地是單克隆IgG生產細胞)，所述方法包括以下步驟：

將微量滴定板的單個孔中的每個細胞培養樣品與抗體結合探針一起孵育以提供多個反應混合物，所述抗體結合探針包括與長壽命熒光染料綴合的通用抗體結合蛋白(即通用IgG結合蛋白)；

測定孔中的反應混合物的熒光偏振，以檢測激發光和發射光之間的偏振變化；和

使偏振變化與所述細胞培養樣品的抗體滴度相關聯。

在一個實施方案中，所述多個細胞培養樣品包括一組克隆生產細胞。因此，本發明還涉及測定一組克隆生產細胞中的抗體滴度的快速、高通量的方法。

通常，該方法使用能夠同時在微量滴定板的多個孔上進行熒光偏振測定的熒光偏振分析儀。

本發明還提供了適于實施本發明方法的試劑盒，以及其包含(a)包含與熒光染料(優選長壽命熒光染料)綴合的通用抗體結合蛋白的抗體結合探針，和(b)熒光偏振分析儀。

優選地，所述通用抗體結合蛋白是截短的。

優選地，所述通用抗體結合蛋白是IgG結合蛋白。

優選地，所述IgG結合蛋白是蛋白G。

優選地，所述通用抗體結合蛋白包括分子量小于15kD或10kD的截短蛋白G。

優選地，所述熒光染料是FITC或其熒光壽命為至少5ns。

本發明還涉及一種熒光染料與通用抗體結合蛋白的綴合物。

在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白是截短的。

在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于30kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于25kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于20kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于15kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于10kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于8kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于5kD。

在一個實施方案中，所述熒光染料是長壽命熒光染料。在一個實施方案中，所述熒光染料的壽命為至少4ns。在一個實施方案中，所述熒光染料的壽命為至少5ns。在一個實施方案中，所述熒光染料是FITC或其壽命為至少4ns。

通常，該方法能夠準確地測定抗體濃度的濃度范圍為1-30mg/L，優選為1-40mg/L，并理想地為1-50mg/L。

附圖說明

圖1：在存在IgG的情況下，丹磺酰標記的蛋白A的熒光偏振影響。

圖2：在存在IgG的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖3：在存在稀釋在CD-CHO培養基中的IgG的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖4：在存在稀釋在水中的IgG的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖5：在存在稀釋在水中的未標記的蛋白A的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響，。圖6：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，三種不同的示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是蛋白質G與(1)BIODOPY(壽命為5ns)、(2)FITC(壽命為4ns)和(3)Alexa647(壽命為1ns)偶聯的綴合物。所述短壽命染料(Alexa 647)提供一個可以忽略不計的信號，而較長壽命染料提供很好的信號。

圖7：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，兩種不同的示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是FITC(壽命為4ns)與(1)蛋白G(完整的G)和(2)截去兩個IgG結合位點的截短蛋白G(gb1)偶聯的綴合物。顯然，使用包含高度截短的蛋白G的綴合物產生最大的信號。

圖8：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，不同示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是蛋白G與方酸菁輪烷染料偶聯的綴合物，所述方酸菁輪烷染料在405nm下吸收并且壽命為約9ns。顯然，使用更長壽命的染料提供了很好的信號。

具體實施方式

本發明涉及一種測定(優選定量測定)在液體樣品(通常是細胞培養樣品，以及理想地為包括單克隆抗體生產細胞的細胞培養樣品)中抗體(通常是IgG抗體)的存在的方法。該方法使用熒光偏振分析來檢測抗體(通常是IgG抗體)和通用抗體結合探針之間的結合。所述抗體結合探針包括通用抗體結合蛋白，例如與熒光探針(染料)(通常是長壽命熒光探針(染料)，如丹磺酰)綴合的通用IgG結合蛋白(如蛋白A、G、L、A/G)。由于所述探針包括通用IgG結合示蹤劑，其能夠用于任何IgG抗體的測定中，并且不針對任何特定的IgG抗體。在使用中，將所述樣品與抗體結合探針一起孵育，分析通過所述樣品或每個樣品中的探針發射的光以檢測熒光偏振，并且使檢測的熒光偏振的水平與所述樣品或每個樣品中的抗體滴度相關聯。

在本說明書中，術語“抗體”應理解為是指人源化或非人源化的免疫球蛋白，例如單克隆或多克隆形式的IgG，IgA，IgE或IgM免疫球蛋白或它們的片段。在一個實施方案中，所述抗體是IgG分子，優選單克隆IgG分子。在一個實施方案中，所述抗體是人抗體。

在本說明書中，術語“測定反應室中樣品的熒光偏振”應理解為是指用與熒光染料的激發波長相對應波長的平面偏振光激發樣品，并且在兩個平面中檢測由熒光染料以適當的發射波長發射的光強度，其中一個平面是平行于激發平面的平面，以及其中一個平面是垂直于激發光的平面。在一個實施方案中，所述激發平面是垂直或水平的，并且在垂直和水平平面中檢測發射光。發射強度從激發平面(即垂直的)移動到垂直平面(即水平的)的程度(即激發光和發射光之間的偏振的變化)是熒光染料的旋轉度的函數。當探針標記的抗體結合蛋白與抗體結合時，該復合物將比探針標記的抗體結合蛋白旋轉得慢，導致發射光的偏振增加。

術語“使偏振的變化與抗體濃度相關聯”應理解為是指基于由熒光探針發射的光的偏振的變化計算樣品的抗體濃度。計算抗體濃度的方法包括從抗體的已知濃度的標準曲線推算抗體濃度，或通過計算解離常數和必要參數，并從第一性原理推算濃度。也可以使用競爭結合測定法來計算抗體濃度。

在本說明書中，術語“快速，高通量”應理解為是指該方法可以在1小時或更短時間內進行，優選小于30分鐘。

本文所用的術語“抗體滴度”或“抗體濃度”是指在給定時間點存在于樣品中的抗體的量，通常是重組抗體，理想地是重組單克隆抗體。通常，所述樣品是細胞培養樣品。優選地，所述樣品是來自細胞培養樣品的上清液。所述滴度或濃度可以以絕對術語或相對術語進行定量。通常，滴度或濃度是指單位體積培養物中產物的重量-克/升(g/L)是常用的度量。

本文所用的術語“樣品”應理解為是指液體樣品，例如細胞培養樣品或源自細胞培養樣品的上清液。優選地，所述細胞是生產細胞(即經基因改良以產生重組蛋白的細胞)，例如原核生產細胞(即大腸桿菌)或真核生產細胞(即CHO細胞)。原核生產細胞和真核生產細胞的實例都是本領域技術人員公知的。所述樣品也可以是血液或血液衍生物，例如血漿或血清。優選地，在確定抗體濃度之前，從樣品中除去細胞。

術語“通用抗體結合蛋白”應理解為是指結合到抗體(例如IgG、IgA、IgE或IgM抗體)恒定區的蛋白質、肽、多肽或非蛋白配體(如適配體)。在優選的實施方案中，所述通用抗體結合蛋白是通常對IgG抗體具有特異性的通用IgG結合蛋白，或IgG結合變體或其片段。通用IgG結合蛋白的實例包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G，和蛋白質L，或抗體結合變體或它們的片段(http://www.piercenet.com/method/antibody-igg-binding-proteins)。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白是截短通用抗體結合蛋白，優選是通常包含多個同源抗體結合結構域的蛋白，并且其被修飾以除去一個或多個抗體結合結構域。優選地，所述抗體結合蛋白是蛋白G。優選地，所述抗體結合蛋白是截短蛋白G。在一個實施方案中，所述蛋白質是從Sigma Aldrich(Paisley，UK)獲得的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于30kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于25kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于20kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于15kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于10kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于8kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白的分子量小于5kD。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白是適配體(即DNA適配體)。在一個實施方案中，所述通用抗體結合蛋白是抗體的片段，例如單鏈可變片段。

在本說明書中，術語“截短通用抗體結合蛋白”應理解為是指被修飾以除去部分蛋白質的通用抗體結合蛋白。在熒光偏振測定中已經發現，減少通用抗體結合蛋白的MW會增加綴合物的信號。在一個實施方案中，除去至少一個抗體結合區。在一個實施方案中，除去不參與抗體結合的蛋白部分。該術語通常包括截短蛋白質和通用抗體結合蛋白的片段。在一個實施方案中，所述片段包括至少一個抗體結合結構域(例如實施例7中的gb1)。以截短蛋白G為例，可以除去三個抗體結合區中的一個或兩個。以截短蛋白A為例，可以除去四個抗體結合區中的一個、兩個或三個。截短蛋白質的實例是來自Sigma、Abcam和Molecular Probes的重組蛋白G，其分子量為約20kD的并且被修飾為除去了至少一個IgG結合結構域。另一個實例是肽gb1(參見以下的實施例7)，其是蛋白G的片段和分子量為7kD的組氨酸標簽(his-tag)。Wilton等描述了截短蛋白G的片段(Proteins:Structure,Function and Bioinformatics,Vol.71,Issue 3,P1432-1440)。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于25kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于8kD的截短蛋白G。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于55kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于50kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于40kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白A。在一個實施方案中，所述截短通用抗體結合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白A。

術語“變體”還意欲包括通用抗體結合蛋白的模擬物(即肽模擬物)和化學衍生物，即其中通用抗體結合蛋白的一個或多個殘基是通過功能側基的反應而化學衍生的。術語變體中還包括通用抗體結合蛋白，其中天然存在的氨基酸殘基被氨基酸類似物替代。Dinon等描述了通用抗體結合蛋白變體的實例(J.Mol.Recognit.2011Nov-Dec；24(6))。

本發明中的和用于本發明的蛋白質和多肽(包括它們的變體和片段)可以全部或部分通過化學合成或通過核酸表達而產生。本發明中的和用于本發明的蛋白質和肽可以很容易地根據本領域公知的現有的標準液體或優選固相肽合成方法來制備(例如，參見J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky and A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984)。

在本說明書中，術語“熒光探針”或“熒光染料”或“熒光團”應理解為是指可在光激發下重新發光的熒光化學物質。熒光探針的實例是本領域技術人員公知的，包括熒光蛋白質如GFP、YFP和RFP，以及非蛋白質有機熒光團，其包括四吡咯衍生物、芘衍生物、呫噸衍生物和花青衍生物。

在本說明書中，術語“長壽命熒光染料”應理解為是指熒光壽命為至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20納秒的熒光染料。優選地，所述熒光染料的熒光壽命為至少4ns。優選地，所述熒光染料的熒光壽命為至少5ns。優選地，所述熒光染料的熒光壽命為5-100ns、5-50ns、5-40ns、5-30ns或5-25ns，通常為10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地為15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。優選地，所述熒光染料的熒光壽命為4-100ns、4-50ns、4-40ns、4-30ns或4-25ns，通常為10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地為15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。在下表中提供了熒光染料的實例，包括長壽命熒光染料。

術語“生產細胞”是指用于產生特定的所需蛋白質的細胞。通常，基因修飾所述細胞以包括編碼所需蛋白質的轉基因的一個或多個副本，其通常在特定啟動子的控制下。因此，所述特定蛋白質通常是重組蛋白質。生產細胞是本領域公知的，并且包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或幼倉鼠腎(BHK)細胞。理想地，所述生產細胞是CHO細胞。通常，所述生產細胞是單克隆抗體生產細胞。

在本說明書中，術語“高通量”應理解為是指可以同時測定大量樣品(例如至少20、50、90、120，即20-500)的方法。

在本說明書中，術語“多孔板”是指具有多個孔(例如至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或384個孔)的板。在一個實施方案中，所述板可以是實心的非柔性板，或者可以作為柔性材料卷提供。

在本說明書中，術語“克隆生產細胞的組”應理解為是指來源于單細胞系并包含2至500或更多個克隆生產細胞群的克隆生產細胞群的組。產生克隆生產細胞的組的方法是本領域技術人員公知的，并被描述于Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(2004),Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398。通常，所述克隆生產細胞群的組包括10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500個克隆細胞群。通常，所述克隆生產細胞群的組包括100-500、100-400、150-400、150-350個克隆細胞群。

在本說明書中，術語“熒光偏振分析儀”應理解為是指一儀器，其能夠接收樣品并用波長對應于熒光染料的激發波長的平面偏振光激發樣品，在兩個平面中檢測熒光染料以適當的發射波長發射的光強度，其中一個平面平行于發射平面并且另一個平面垂直于發射平面，以及通常確定激發光和發射光之間的偏振的變化。通常，該儀器能夠接收和讀取包含在多孔板中的多個樣品，通常以高通量方式。熒光偏振分析儀的例子包括BMG PheraStar、BMG ClarioStar、Tecan Infinite F500。

實驗

使用熒光標記的通用IgG結合蛋白評估IgG含量的實驗方法。

丹磺酰蛋白A是由丹磺酰氯(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯)(Sigma，UK)與來自金黃色葡萄球菌(staphylococcus aerueus)(Sigma，UK)的重組蛋白A的共價連接產生。

FITC標記的截短蛋白G是從Sigma,UK獲得的。

免疫球蛋白G(人，活性)是從Abcam(Cambridge,UK)獲得的。

使用BMG ClarioStar(Bucks，UK)進行熒光偏振測量。在黑色半區96‘非結合表面’的孔板(Corning,UK,產品3686)中進行讀數。作為陰性對照的目標mP值為70mP。從熒光減去空白計算mP值。

評估丹磺酰標記的截短蛋白A綴合物。

這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的丹磺酰蛋白A與25ul的稀釋在水中的全長人活性IgG1混合。樣品混合后立即讀數。圖1顯示了存在IgG的情況下，丹磺酰標記的蛋白A的熒光偏振影響。顯然，使用該技術可以在該范圍內精確定量IgG。隨著IgG濃度的變化，mP有明顯的劑量響應變化。

評估FITC截短蛋白G綴合物

使用市售FITC綴合的截短蛋白G(Sigma等)重復此技術。這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的FITC蛋白G與25μl的稀釋在水中至各種濃度的全長人活性IgG1(Abcam等)混合。圖2和4顯示了存在IgG的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內給出IgG的精確定量。分辨率顯然很高，并且可以容易觀察到0.01g/L的差異。這表明該方法可以使用較短壽命的熒光團如FITC(異硫氰酸熒光素)。

比較短壽命熒光團與長壽命熒光團。

使用三種探針重復該技術，即(1)FITC-截短蛋白G，(2)BIODOPY-截短蛋白G和(3)Alexa647-截短蛋白G。這里，將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結合緩沖液(sigma，UK)中的綴合物與30ul的稀釋在CD-CHO中至各種濃度的全長人活性IgG1(Abcam等)混合。圖6顯示了在存在IgG的情況下，三種綴合物的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內給出IgG的精確定量。同樣明顯的是，使用具有較長壽命探針(FITC＝4ns，BIODOPY＝5ns)的綴合物獲得的信號明顯優于使用短壽命探針(Alexa647＝1ns)的綴合物獲得的信號。

比較截短蛋白G與蛋白G片段

使用兩種探針(即(1)與截短蛋白G綴合的FITC和(2)與含有單個IgG結合結構域的蛋白G的片段(gb1)綴合的FITC)重復該技術。這里，將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結合緩沖液(sigma，UK)中的每種綴合物與25ul的稀釋在CD-CHO中至各種濃度的全長人活性IgG1(Abcam等)混合。圖7顯示了在存在IgG的情況下，兩種綴合物的熒光偏振影響。顯然，使用蛋白G片段(<10kD)獲得的信號明顯優于使用截短蛋白G(20kD)獲得的信號。

評估方酸菁輪烷染料(squarene rotoxane dye)-截短蛋白G綴合物。

使用方酸菁輪烷綴合的截短蛋白質G重復該技術。這里將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結合緩沖液(sigma，UK)中的方酸菁輪烷蛋白G與30ul的稀釋在CD-CHO培養基中至各種濃度的全長人活性IgG1(Abcam等)混合。圖7顯示了在存在IgG的情況下，綴合物的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內給出IgG的精確含量。方酸菁輪烷染料描述于http://chem.isc.kharkov.com/dep9/research-achievements。

評估熒光偏振法定量哺乳動物細胞培養基中的IgG。

評價稀釋在培養基中的IgG樣品的影響。這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的FITC蛋白G與25ul的稀釋在CD-CHO(Life Technologies,Paisley,UK)中的全長人活性IgG1(Abcam等)的各種稀釋液混合。圖3顯示了在存在稀釋在CD-CHO培養基中的IgG的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。

在存在非靶蛋白的情況下，評估mP的陰性對照。

作為陰性對照，將FITC蛋白G加入到與IgG濃度相當的濃度的各種濃度的未標記的蛋白A中。圖5顯示了在存在稀釋在水中的未標記蛋白A的情況下，FITC標記的蛋白G的熒光偏振影響。在這里，顯然，當使用非靶蛋白時，偏振沒有系統性變化。

上述結果清楚地表明，本發明的方法可用于快速、經濟和高通量的IgG抗體的定量。

本發明不限于上述實施例，在不脫離本發明的精神的情況下，可以在結構和細節上進行改變。