一種預測細胞表型不穩定性的方法與流程

本發明涉及一種預測細胞(通常是哺乳動物生產細胞)表型不穩定性的方法。

發明背景

從調控的角度來看穩定性的主要方面僅指產物，即該產物一致的特性(例如一致的糖型和更普遍的體內活性)。

但是，從生產的角度來看，穩定性的重要方面理所當然的是產物的質量，還有生產克隆細胞系的一致生長和產率。例如，根據Lonza^TM指南，倍增數超過40(大約10次傳代)產物滴定度的變化超過30％則被認為是不穩定的細胞系。

該細胞系的改變可以歸因于基因復制數目、mRNA復制數目的改變，以及整個細胞潛在的改變(即蛋白質組和代謝組的改變)。細胞基因組的改變表明一定程度的表型基因的不穩定或者“突變表型”(Loeb等，1999)。任何已經變成這種表型的克隆細胞系很有可能會出現表型中其它相關改變。

本發明的目的是至少解決一個上文提及的問題。

技術實現要素：

本發明提供了一種預測細胞系表型穩定性的方法，包括以下步驟：

-在測定期培養所述細胞系；

-在測定期的多個不同時間點產生細胞系的環境響應指紋，其中每個環境響應指紋通過在多種化學細胞應激源存在時測定細胞的環境響應產生；以及

-比較多個環境響應指紋以檢測測定期所述環境響應指紋的改變，其中在測定期所述環境響應指紋的改變程度指示所述細胞系中預測的表型不穩定性程度。

典型地，比較多個環境響應指紋以檢測測定期環境響應指紋改變的步驟包括：檢測所述或每種化學細胞應激源特異性環境響應的改變的步驟。

合適地，所述環境響應是生長響應。

優選地，所述多個不同時間點在測定期跨越一代或多代。

典型地，所述環境響應指紋在測定期內產生三個或更多個時間點。

合適地，所述環境響應指紋在測定期內產生四個或更多個時間點。

通常，每個環境響應指紋通過在至少三種不同的化學細胞應激源中的每種存在時測定細胞的環境響應而產生。

優選地，每個環境響應指紋通過在至少五種不同的化學細胞應激源中的每種存在時測定細胞的環境響應而產生。

合適地，該化學細胞應激源選自于氨基酸轉運抑制劑、細胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應激源、氧化應激源、細胞凋亡誘導劑、代謝效應物、pH調節劑、糖酵解抑制劑和毒素。

通常，所述細胞系是哺乳動物的生產細胞系。

典型地，在測定期的環境響應指紋的改變是測定的數學模型方法，適當地是使用一個或多個具有已知的表型穩定性或不穩定性或二者的細胞環境響應指紋產生的數學模型。典型地，所述數學模型使用選自于歐幾里得距離、馬哈拉諾比斯距離、LDA距離、PCA距離的方法。

本發明也提供一種鑒定細胞的系統，該系統包括：

-包括多個反應室的裝置；

-單獨設置在所述反應室中的多種化學細胞應激源；

-在多種化學細胞應激源中的每種存在時測定細胞的環境響應的測定系統；

-存儲多個環境響應指紋的存儲系統，每個環境響應指紋對應細胞的多個環境響應；

-配置用于比較多個環境響應指紋中的至少一些以檢測環境響應指紋改變的比較系統；以及

-顯示比較步驟輸出的顯示系統。

合適地，所述環境響應指紋是生長響應指紋。

典型地，所述裝置是微量滴定板。

合適地，所述比較系統包括計算模型，該計算模型配置用于輸入在測定期的多個不同時間點的細胞環境響應指紋，比較所述生長響應指紋以檢測指紋的改變，并且輸出部分基于指紋部分的改變的內容。

發明詳述

在本說明書中，術語“細胞”是指任何細胞類型，包括原核或真核細胞。合適地，所述細胞是真核細胞，理想情況下是哺乳動物細胞。典型地，所述細胞是生產細胞，優選地是哺乳動物生產細胞。所述細胞可以是克隆得到的或者非克隆得到的。在優選實施例中，所述細胞是來自一組克隆細胞中克隆體，其來源于單親細胞群或來源于不同轉染細胞。所述細胞也可以是來源于不同的細胞系，比如基因修飾細胞(即“基因敲除”或者“基因敲入”突變細胞)。所述細胞系也可以來源于定向演化，通過選定已經適應特定目標環境的細胞。術語“不同的細胞組”應該理解為彼此不相同的一組細胞。比如，該組細胞可以包括一組所有都來源于單親細胞群的克隆細胞。或者，該組細胞可以包括獨立克隆起源(比如攜帶有不同轉基因或不同突變基因)的細胞，該組細胞可以包括非克隆細胞。所述細胞系也可以來源于定向演化，通過選定已經適應特定目標環境的細胞。該組細胞也可以包括不同細胞類型的細胞，比如不同細胞系、不同細菌或真菌的菌株、同樣的細胞類型但是在不同發育階段的細胞，以及遺傳上不同的同樣細胞類型的細胞，比如同樣類型或起源的細胞或者來源于攜帶不同轉基因的同樣親本細胞群的細胞。

在本說明中，術語“克隆細胞組”應該理解為一組克隆細胞群，該克隆細胞群來源于單細胞群并且包括2到500或更多的克隆細胞群。產生克隆細胞組的方法是本領域技術人員熟知的，該方法描述在“Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(在培養哺乳動物細胞中生產重組蛋白治療劑)”(2004)(Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398)。典型地，該組克隆細胞群包含10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500個克隆細胞群。典型地，該組克隆細胞群包含100-500、100-400、150-400、150-350個克隆細胞群。

本發明涉及用多種細胞應激分子孵育細胞。這意味著將所述細胞與每種細胞應激分子單獨培養，以在每種細胞應激分子存在時獲得所述細胞的生長響應。用所述細胞應激分子孵育細胞可以在任何合適的反應釜中完成，比如在微量滴定板的孔中。典型地，該試驗涉及將化學細胞應激源和細胞樣品混合起來，并孵育該混合物1到4天，以及測定該細胞生長程度。合適地，該細胞樣品的濃度為每毫升混合物有0.1至1.0×10⁶個細胞。典型地，該細胞應激源的濃度為0.5至2×IC50，理想情況下約為1×IC50。合適地，在少于5天的孵育期后測定每種克隆細胞的生長情況。理想情況下，在1-4天之間的培養期后(理想情況下是在2到3天之后)測定每種克隆細胞的生長情況。優選地，同時測定每種克隆細胞的生長。

術語“細胞應激分子”或“細胞應激源”應該理解為能通過多種細胞途徑中的一種或多種引起細胞生長下降的分子或化合物。典型地，多種化學細胞應激源選自于由氨基酸轉運抑制劑、細胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應激源、氧化應激源、細胞凋亡引發劑、代謝效應物、pH調節劑、糖酵解抑制劑以及毒素組成的組。典型地，多種化學細胞應激源包含的應激源選自于包含該組至少4、5、6或者7組：氨基酸轉運抑制劑、細胞周期抑制劑、碳源、滲透壓應激源、氧化應激源、細胞凋亡引發劑、代謝效應物、pH調節劑、糖酵解抑制劑以及毒素。

在本說明書中，應用在細胞應激分子中的術語“多種”應該被理解為表示至少有三種不同的細胞應激分子。典型地，該術語是指至少有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20種不同的細胞應激分子。因此，可以通過使用少至三種不同的細胞應激分子實施本發明所述方法以產生該細胞特異性生長響應指紋，比如：CoCl₂、NAV和MSB；Cadm、MSB和2DG；Cadm、dphe、MeiAB；dphe、MeIAB、Cadm；Dphe、Cadm、2dg；Dphe、乳酸鈉、2dg；Dphe、NaOx、檸檬酸；MeIAB、Cad、2dg。

術語“環境響應”是指當暴露在細胞應激分子中時細胞可測量的響應，比如生長響應、產量響應(比如單克隆抗體滴定度)，或者糖基化響應。典型地，該環境響應是歸一化環境響應，通過在存在和不存在細胞應激分子時測量細胞的環境響應以及確定由于存在細胞應激分子時環境響應的差異。

術語“生長響應”是指存在細胞應激分子時細胞的生長。典型地，該生長響應是歸一化生長響應，通過在存在和不存在細胞應激分子時測量生長以及確定由于存在細胞應激分子時生長響應的差異。可以使用任何該領域熟知的技術測定細胞生長。在一個實施例中，將染料加入到孵育混合物中并隨時間監控染料發射的信號并將其與生長關聯起來。例如，可以使用熒光或者磷光染料。合適的染料例子是氧化還原染料，例如Presto(Invitrogen,Paisley,UK)。

術語“表型不穩定”應該理解為表示一種或多種細胞表型特征的不穩定，比如生長、生產能力以及重組蛋白產物特征。

術語“環境響應指紋”是指應通過將細胞與多種細胞應激分子單獨反應獲得針對特定細胞的多個環境響應。該指紋具體表現為多個環境響應值，或者可以具體表現為圖表或任何其它類型的可視圖像(比如圖案)的形式。指紋隨著時間的改變可以通過監測所述或每個化學微環境中的環境改變來測定。

術語“生長響應指紋”是指通過將該細胞與多種細胞應激分子單獨反應獲得針對特定細胞的多個生長響應。該指紋具體表現為多個生長響應值，或者可以具體表現為圖表或任何其它類型的可視圖像(比如圖案)的形式。

術語“測定期”是指待測細胞被培養的時間段。典型地，該測定期跨越至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20代細胞。

術語“多個不同時間點”是指至少2、3、4、5、6、7、8、9或者10個不同的時間點。通常每個時間點間隔至少1、2或者3次傳代。

本發明的一個方面涉及在測定期比較細胞的環境響應指紋(即生長響應指紋)，以檢測環境響應指紋的改變，然后將其與所述細胞的穩定性或不穩定性關聯起來。應用到環境響應指紋的術語“改變”是指在測定期中發生環境響應指紋的的至少一種差異。可以采用各種方法來檢測環境響應指紋隨著時間的改變，包括：數學建模、圖案識別或者通過肉眼觀察。比如，細胞在時間點A、B和C的環境響應可以通過對細胞應激源作圖來代表細胞在時間點A、B和C的環境響應指紋。環境響應指紋可以通過肉眼比較去鑒定指紋隨著時間的改變。通常，在測定期指紋的變化越大，細胞就越不穩定。例如，根據Lonza^TM指南，倍增數超過40(大約10次傳代)產物滴定度的變化超過30％被認為是不穩定的細胞系。使用本發明的方法可以定量確定生長響應指紋的改變程度，根據Lonza定義將其與不穩定的細胞系關聯起來，從而使用本發明的方法鑒定不穩定的細胞系。在優選實施例中，所述比較步驟可以通過數學建模實現，通常使用的數學模型是利用從具有已知的表型穩定性和/或不穩定性的細胞(例如，具有預先測定的穩定性和預先測定的不穩定性的細胞系)的環境響應指紋(或者化學特異性環境響應)產生。該建模方法可以使用“線性判別分析”和“最相鄰歐幾里得距離最小化”，使用化學生長響應的子集。因此，在一個實施例中，該方法涉及將測試細胞系的環境響應指紋輸入到計算模型的步驟，其中該計算模型利用從具有已知的表型穩定性的細胞系校準組獲得的環境響應指紋產生，其中該計算模型配置用于輸出該細胞系預測的穩定性。該環境響應指紋可以是在環境響應(ΔCE)中的一個或者多個化學特異性變化。

本發明也提供一種鑒定細胞的系統或者試劑盒。該系統或者試劑盒通常包括帶有多個反應室的裝置。優選地，該裝置是微量滴定板，通常是至少具有12、24、48或者96個孔的微量滴定板。

該系統或者試劑盒通常包括多種細胞應激分子。優選地，該細胞應激分子單獨放置在微量滴定板的孔內，并且優選地粘附在微量滴定板的孔內。

該系統或者試劑盒包括在多種化學細胞應激源中的每個存在時測定細胞環境(即生長)響應的測定系統。通常，該測定系統包括配置用于檢測細胞在微量滴定板孔內生長的微量滴定板讀數器。合適的微量滴定板讀數器可以在市場上買到，并且由BMG公司出售。該測定系統通常具有計算機可執行指令，以提供例如計算機可讀形式的生長響應數據。

該系統或者試劑盒也包括存儲系統以及比較系統(用于比較細胞在不同時間點的生長響應指紋)。這些功能模塊可以在一個或者多個計算機上執行，或者通過利用一個或者多個計算機網絡執行。該測定系統具有計算機執行指令，以提供例如計算機可讀形式的序列信息。

在測定系統中測定的信息能被存儲系統讀取。這里使用的“存儲系統”意在包括配置用于或者適用于存儲數據或信息的任何合適的計算或者處理設備或者其它的裝置。本發明適合使用的電子設備的例子包括獨立的計算機設備、數據電信網絡(包括局域網(LAN)、廣域網(WAN)、因特網、內聯網和外聯網)，以及本地和分布式計算機處理系統。存儲裝置還包括，但不限于：磁存儲介質(比如軟盤、硬盤存儲介質、磁帶)、光存儲介質(比如CD-ROM、DVD)、電子存儲介質(比如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等)、普通硬盤和這些類型的混合體(比如磁/光存儲介質)。該存儲系統適于或配置用于攜帶在其上記錄的生長響應信息和生長響應指紋信息。這些信息以數字形式提供，能被電子傳輸和讀取，比如通過因特網、軟盤、通過USB(通用串行總線)或者通過任何其它合適的通信模式。

該存儲系統可以具有存儲在其中的參考環境(即生長)響應指紋信息。正如這里使用的，“存儲”是指在存儲裝置上編碼信息的過程。在一個實施例中，比較模塊通過讀取存儲在存儲裝置中的該參考數據進行比較，比如將查詢的細胞特異性生長響應指紋和一套或一組參考生長響應指紋進行比較。

所述“比較系統”能使用各種各樣可用的軟件程序和格式作為比較手段去比較細胞在測定期不同時間點的環境響應指紋，以檢測環境(即生長)響應指紋的改變。在一個實施例中，該比較模塊配置用于利用圖案識別技術將一個或多個輸入信息和一個或多個參考數據圖案進行比較。該比較模塊配置用于使用現有的商業可得的或免費可得的軟件用于比較圖案，以及可以對特殊數據比較進行優化。該比較模塊提供關于樣品基因型的計算機可讀信息。優選地，該比較系統使用計算機模型用于比較目的。

該比較模塊，或任何其它本發明的模塊，可以包括在其上運行相關的數據管理系統的操作系統(如UNIX)、萬維網應用程序和萬維網服務器。萬維網應用程序包括產生數據庫語言語句(比如結構化查詢語言(SQL)語句)所必需的可執行代碼。通常可執行文件包括嵌入式SQL語句。另外，所述萬維網應用程序包括配置文件，該配置文件包括各種軟件實體的指示器和地址，該軟件實體包括服務器以及各種外部和內部的能讀取服務器用戶請求的數據庫。該配置文件還能使服務器資源請求定向到合適的硬件—若服務器分布到超過兩個或更多的獨立式計算機上是必需的。在一個實施例中，所述萬維網服務器支持TCP/IP協議。類似這樣的本地網絡有時稱為“內聯網”。這種內聯網的一個優勢是它們能容易地與駐留在萬維網(比如GenBank或Swiss Pro萬維網址)中的公共領域數據庫通信。因此，在本發明的特別優選實施例中，用戶可以使用網絡瀏覽器和網絡服務器提供的HTML接口直接訪問駐留在因特網數據庫上的數據(比如通過超鏈接)。

所述比較模塊通常提供計算機可讀的比較結果，該比較結果能夠利用預定義標準或者用戶定義的標準被處理成計算機可讀形式，以提供部分基于比較結果的內容，該內容可以存儲并在使用顯示系統的用戶要求時輸出。

在本發明的一個實施例中，基于比較結果的內容顯示在計算機的顯示器上。在本發明的一個實施例中，基于比較結果的內容通過可印刷介質顯示。所述顯示模塊可以是任何合適的配置于從計算機接收并將計算機可讀信息顯示給用戶的裝置。例如，不受限制的例子包括：通用型計算機，比如基于Intel PENTIUM型處理器、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC處理器、可從Sunnyvale(加利福尼亞)的Advanced Micro Devices(AMD)公司獲得的各種處理器中的任意種或任何其它類型的處理器的那些計算機；視覺顯示裝置，比如平板顯示器、陰極射線管等，以及各種類型的計算機打印機。

在一個實施例中，萬維網瀏覽器用于提供用戶界面，用來顯示基于比較結果的內容。應該理解本發明的其它模塊能適于具有網絡瀏覽器界面。用戶可以通過所述網絡瀏覽器構建從比較模塊中檢索數據的請求。因此，用戶通常指向并點擊用戶界面元素，比如在圖形的用戶界面常規使用的按鈕、下拉式菜單、滾動條等。

附圖說明

圖1：來自一克隆的化學生長指紋的實例。細胞在96孔板中在目標化學物存在或者不存時細胞生長72小時。細胞生長的相對水平使用上文描述的“Presto-Blue”法檢測。

圖2：早期世代和后期世代培養物之間生長響應顯著改變的比例。誤差條形圖表示比例的標準偏差。

圖3：早期世代和中期世代培養物之間生長響應顯著改變的比例。誤差條形圖表示比例的標準偏差。

具體實施例

實驗

小規模測定細胞生長：

在96孔板中檢測細胞生長：“Presto Blue”(Invitrogen,Paisley,UK)和CD-CHO培養基以1:1混合，將20ul該混合物加入到每個孔中。該板機械搖動后接著在靜態加濕孵育箱中在37℃孵育30分鐘。孵育之后，使用fluoroskan ascent(Thermo-Fisher，Loughborough，UK)的孔板讀取器測定(激發535nm，發射620nm)各孔的熒光。先前已經證實熒光和孔中的活細胞的密度是線性相關的。

化學測試板的制備：

方法：使用的多種細胞應激分子是：

2-氨基雙環-(2,2,1)庚烷-羧酸(BCH)

D-苯丙氨酸(D-Phe)

α-(甲氨基)異丁酸(MeAIB)

正丁酸鈉(NaBu)

環己酰亞胺

氯化銨

醋酸鎘六水合物

氯化鈷(CoCl₂)

氯化鈉(NaCl)

乳酸鈉(Na Lac)

氨基三唑(AMT)

甲萘醌亞硫酸氫鈉(MSB)

丁硫氨酸亞砜胺(BSO)

巰基丁二酸(MS)

2,4-二硝基苯酚(24DNP)

草氨酸鈉

2-脫氧葡萄糖(2dg)

3-溴丙酮酸(3-BrPA)

二氯乙酸鹽(DCA)

6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸(l-don)

丙戊酸(Val)

原釩酸鈉Sodium Orthovandate(NaV)

檸檬酸

FK866

乳酸

使用“自身”親本細胞系，上述化學物質的抑制劑量50(IC50)濃度經過生長研究進行鑒定。這里討論到的IC50值定義為該化學物質在3天期間內抑制正常細胞生長達到50％的濃度。一旦IC50值被確定，96孔板設置為包含在IC50濃度的以上選擇的化學物質以及包含只含有細胞生長培養基的對照孔。

一種預測穩定性的方法：

從早期傳代開始，在任何不穩定變得明顯之前，采集若干代的指紋。采集的第一個指紋以下稱為“參考指紋”。這里目標度量指標不是在微環境中的生長響應而是相對于參考指紋在生長響應上的改變。

因此，對于在參考指紋之后采集的每個指紋，計算每個微環境的“化學特異性生長響應改變”(ΔCE)。這很有可能是關于穩定性最詳實的指標。每個微環境的ΔCE被用作預測模型的參數來得出穩定或不穩定的二次輸出。

用來預測穩定性的這種模型選自各種模型。一個合適的例子是“線性判別模型”(LDA)，ΔCE的線性組合被用來從不穩定細胞系中最大程度地分離穩定細胞系。或者，該模型是邏輯回歸模型或者是基于簡單的歐幾里得距離或另一種“空間”(比如PCA或者LDA空間)距離。能夠使用另外的技術，比如“支持向量機”。

為了評估感興趣的新細胞系，參考指紋和若干后續指紋被用來產生ΔCE指紋。這些ΔCE后續指紋被用在建模方法中預測“穩定或不穩定”或可以一些其它穩定性的連續指標，比如“不穩定度”。在一個實施例中，在“參考指紋”之后的第一代立即預測了穩定性。

在一個實施例中，細胞系“校準組”不是必需的并且穩定性是通過觀察參考指紋隨著時間的改變(例如通過與參考指紋的簡單距離或任何建模、圖案識別或者“用肉眼”的方法)的一致性預測。

實施例

獲取五種穩定的和四種不穩定的產品中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。這些獲得的細胞冷凍在早期、中期和后期培養階段。這里不穩定定義為到后期世代期下降大于30％最大產品滴定度。

在上文提及的多種化學物質存在時測量生長和滴定度前，通過在化學篩選板生長3天獲得在每個不同時間點的每種細胞系的化學指紋。這里測試的目標參數是化學響應隨著時間(即早期、中期和后期)的改變。

觀察到化學生長響應“顯著”改變的頻次在早期和后期階段培養中的不穩定克隆明顯高于穩定克隆(圖2)。因此穩定的可能性可以通過測試化學響應隨著合適的時間進程顯著改變的頻次獲得。這里生長響應的顯著改變定義為對于特異性化學生長響應改變超過兩倍估算板對板標準偏差的標準偏差。圖2示出了不穩定克隆的化學改變比例是0.41，然而穩定克隆改變的比例是0.26。

盡管程度較輕，但這種影響在早期世代和中期世代培養物中也被觀察到(圖3)。再次，這證實了化學生長響應隨著時間如何改變可以用來作為不穩定的標志物以及幫助篩選克隆用于長期生長研究，即從該研究克隆可能認為具有不穩定的可能性。比如，給定許多具有等同屬性的克隆，本發明能夠篩選這些克隆以確定采用哪些進行下一階段穩定性的研究，節省時間和資源。

相反地，本發明也能在早期階段鑒定克隆，早期階段的標準屬性很少讓人滿意，比如滴定度，但是從觀察到的化學指紋較低的改變可以被鑒定為很有可能是穩定的。這些能被選用并可能用于克隆，其在早期階段表現良好但是在長期研究中滴定度出現下降。

本發明并不限于以上描述的實施例，在結構和細節上可以進行變化而并不偏離本發明的精神。