用于樣品制備和分析的微流體裝置、系統和方法與流程

本申請要求2014年3月13日提交的美國臨時專利申請第61/952,829號的優先權，其全文通過引用結合入本文。

技術背景

解析整個人類基因組的目標使得人們對用于快速脫氧核糖核酸(DNA)測序的技術，無論是小規模還是大規模應用，都產生了興趣。重要的參數是測序速度，可以在單次測序運行過程中讀取的序列長度，以及產生序列信息所需的核酸模板量。大規模基因組項目目前太過于昂貴，實際上無法針對大量對象(例如，患者)進行。此外，隨著人類疾病的基因基礎知識的增加，對于臨床應用可負擔得起的精確、高通量DNA測序的需求會不斷增加。用于確定單一核酸分子的堿基對序列的實際方法，特別是具有高速度和長讀取長度的那些，可以提供所需的檢測能力。

核酸測序是可以用于提供核酸樣品的序列信息的工藝。此類序列信息對于對象的診斷和/或治療可能是有用的。例如，對象的核酸序列可用于對基因疾病進行鑒定、診斷和潛在開發治療。作為另一個例子，對于病原體的研究可產生用于傳染性疾病的治療。

存在可用于對核酸進行測序的方法。但是，此類方法是昂貴的，并且可能無法在一定的時間內并且以一定的精確度來提供序列信息，而這對于對象的診斷和/或治療是必需的。

技術實現要素：

用于核酸測序的樣品制備可采用克隆擴增(clonal amplification)，并且可能涉及兩個或更多個階段，包括核酸純化和之后的文庫制備。用于核酸純化的方法是高度相異的，反應了核酸源的多樣性(例如，血液、新鮮組織、防腐的福爾馬林固定石蠟包埋組織、抽吸物、擦拭物、培養細胞或者環境樣品)。用于從純化的核酸進行文庫制備的方法也是相異的，反應了核酸測序應用的多樣性(例如，全基因組測序、靶向外顯子測序、或者mRNA測序)。這些復雜的過程通常由高度受訓的科學家和技術人員在實驗臺上工作進行。這部分是由于這些過程的自動化需要使用液體處理實驗室機器人，這是巨大、昂貴且難以編程的。隨著測序成本快速下降，樣品制備成本已經成為測序項目整體成本的重要因素。因此，對于成本低廉的自動化樣品制備存在不斷增加的需求。本文提供了可用于采用微流體的樣品制備的方法和裝置。

本文的一個方面提供了微流體裝置。微流體裝置可包括第一通道，其具有一系列(n個)室，每個室具有第一體積(v)。第一通道可在第一通道的相對端部包括閥，其對第一通道進行流體隔離。此外，微流體裝置還可包括與第一通道流體連通的第二通道。第二通道可包括至少一個第二室，其具有總第二體積，其至少等于第一通道的總體積(n*v)。此外，第二通道可在第二通道的相對端部包括閥，其使得第二通道與第一通道流體隔離。

在一些實施方式中，微流體裝置還可包括與第一通道和第二通道流體連通的第三通道。第三通道可包括至少一個第三室，其具有總第三體積，其至少等于第一通道和第二通道的體積之和(2n*v)。在一些實施方式中，第一通道、第二通道和第三通道中的至少兩個可以基本相互平行。在一些實施方式中，第一通道和第二通道可以基本相互平行。

在一些實施方式中，微流體裝置還可至少包括流體層、致動層和夾在流體層與致動層之間的彈性層。在一些實施方式中，彈性層可以由熱塑性彈性體形成。在一些實施方式中，彈性層可以是基本不含聚二甲基硅氧烷的。

在一些實施方式中，至少一個閥可包括：在彈性層中的隔膜；使得所述至少一個閥的入口和出口選擇性隔離的閥座；以及致動層中的室。室可以供給正壓或負壓，使得隔膜朝向閥座或遠離閥座移動。在一些實施方式中，隔膜可以是可變形或者可致動的。在一些實施方式中，所述至少一個閥還可包括銷，其在所述室內可相對于隔膜移動。利用至少部分由銷供給的正壓，可以使得隔膜朝向閥座移動。在一些實施方式中，利用由銷供給的正壓和由致動層供給的流體正壓，可以使得隔膜可朝向閥座移動。

在一些實施方式中，至少一個室可包括：彈性層中的隔膜；流體層中的流體室；以及致動層中的室。室可以供給正壓或負壓，使得隔膜變形，以實現流體流動或者在流體室中混合。在一些實施方式中，所述至少一個室還可包括銷，其在所述室內可相對于隔膜移動。利用至少部分由銷供給的正壓，可以使得隔膜是可移動的。在一些實施方式中，利用銷供給的正壓和致動層供給的流體正壓，可以使得隔膜是可移動的。

在一些實施方式中，第一通道中的n個室中的第一子組可以與第一溫度區熱連通，和/或第一通道中的n個室中的第二子組可以與第二溫度區熱連通。在一些實施方式中，第一溫度區和第二溫度區可以是不同的溫度區。在一些實施方式中，第一溫度區和第二溫度區可以是獨立可控的。在一些實施方式中，第一通道中的n個室中的第三子組可以與第三溫度區熱連通。

在一些實施方式中，n可以至少等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更大。在一些實施方式中，n可以至少等于3。在一些實施方式中，n可以至少等于6。在一些實施方式中，在第一通道和第二通道的相對端部的閥的幫助下，第一通道和第二通道可以是相互可隔離的。在一些實施方式中，微流體裝置還可包括與第一通道和第二通道選擇性流體連通的多個井。至少所述多個井的子組可用于裝納用于生物樣品制備或分析的試劑。在一些實施方式中，總第二體積可以基本等于第一通道的總體積。

本文的另一個方面提供了用于樣品制備或分析的系統。系統可包括微流體裝置，其包括第一通道，其具有一系列(n個)室，每個室具有第一體積(v)。第一通道可在第一通道的相對端部包括閥，其對第一通道進行流體隔離。微流體裝置還可包括與第一通道流體連通的第二通道。第二通道可包括至少一個第二室，其具有總第二體積，其至少等于第一通道的總體積(n*v)。此外，第二通道可在第二通道的相對端部包括閥，其使得第二通道與第一通道流體隔離。此外，系統還可包括控制器，其經編程以致動處于第一通道和第二通道的相對端部的閥，從而調節流動通過第一通道和第二通道的流體。

在一些實施方式中，微流體裝置還可包括與第一通道和第二通道流體連通的第三通道。第三通道可包括至少一個第三室，其具有總第三體積，其至少等于第一通道和第二通道的體積之和(2n*v)。在一些實施方式中，第一通道、第二通道和第三通道中的至少兩個可以基本相互平行。在一些實施方式中，第一通道和第二通道可以基本相互平行。

在一些實施方式中，微流體裝置可以至少包括流體層、致動層和夾在流體層與致動層之間的彈性層。在一些實施方式中，彈性層可以由熱塑性彈性體形成。在一些實施方式中，彈性層可以是基本不含聚二甲基硅氧烷的。在一些實施方式中，至少一個閥可包括：在彈性層中的隔膜；使得所述至少一個閥的入口和出口選擇性隔離的閥座；以及致動層中的室。室可以供給正壓或負壓，使得隔膜朝向閥座或遠離閥座移動。在一些實施方式中，隔膜可以是可變形或者可致動的。在一些實施方式中，至少一個閥還可包括銷，其在所述室內可相對于隔膜移動。利用至少部分由銷供給的正壓，可以使得隔膜可朝向閥座移動。

在一些實施方式中，至少一個室可包括：彈性層中的隔膜；流體層中的流體室；以及致動層中的室。室可以供給正壓或負壓，使得隔膜變形，以實現流體流動或者在流體室中混合。在一些實施方式中，所述至少一個室還可包括銷，其在所述室內可相對于隔膜移動。利用至少部分由銷供給的正壓，可以使得隔膜是可移動的。在一些實施方式中，利用由銷供給的正壓和由致動層供給的流體正壓，可以使得隔膜是可移動的。

在一些實施方式中，第一通道中的n個室中的第一子組與第一溫度區熱連通，和/或第一通道中的n個室中的第二子組與第二溫度區熱連通。在一些實施方式中，第一溫度區和第二溫度區可以是不同的溫度區。在一些實施方式中，第一溫度區和第二溫度區可以是獨立可控的。在一些實施方式中，第一通道中的n個室中的第三子組可以與第三溫度區熱連通。

在一些實施方式中，n可以至少等于1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更大。在一些實施方式中，n可以至少等于3。在一些實施方式中，n可以至少等于6。在一些實施方式中，在第一通道和第二通道的相對端部的閥的幫助下，第一通道和第二通道可以是相互可隔離的。

在一些實施方式中，微流體裝置還可包括與第一通道和第二通道選擇性流體連通的多個井。至少所述多個井的子組可用于裝納用于生物樣品制備或分析的試劑。在一些實施方式中，總第二體積可以基本等于第一通道的總體積。

在一些實施方式中，系統還可包括與微流體裝置流體連通的傳感器陣列。傳感器陣列可包括個體傳感器，其檢測對于樣品或其衍生物相關的反應或反應產物進行指示的信號。在一些實施方式中，每個個體傳感器可分別包括至少兩個電極，其位于珠的德拜層(Debye layer)中，其在傳感期間具有樣品或其衍生物，其中，所述至少兩個電極檢測信號。在一些實施方式中，信號可對應于與樣品或珠相關聯的阻抗。在一些實施方式中，控制器可經編程，從而將來自微流體裝置的樣品或其衍生物的流導向到傳感器陣列，以及促進信號的檢測，所述信號指示反應或反應產物。

本文的另一個方面提供了微流體裝置。微流體裝置可包括：流體層，其具有與流體入口和流體出口流體連通的流體室；致動層，其具有可在致動層中移動的銷；以及流體層和致動層之間的隔膜。隔膜可以由熱塑性彈性體形成，和/或，在向隔膜施加正壓之后，隔膜在流體室中可以是可變形的。可以通過朝向隔膜移動的銷以及致動層中的流體正壓的組合，來供給正壓。

在一些實施方式中，隔膜可以是基本不含聚二甲基硅氧烷的。在一些實施方式中，銷可以是在致動層中可單軸移動的。在一些實施方式中，可以通過接觸隔膜和朝向隔膜移動的銷來供給正壓。在一些實施方式中，微流體裝置還可包括位于流體層中的閥座。在向隔膜施加了正壓之后，隔膜可以是與閥座可致動接觸的。接觸可以使得流體入口與流體出口流體隔離。

本文的另一個方面提供了包括多個微流體裝置的系統。所述多個微流體裝置中的個體微流體裝置可包括：流體層，其具有與流體入口和流體出口流體連通的流體室；致動層，其具有可在致動層中移動的銷；以及流體層和致動層之間的隔膜。隔膜可以由熱塑性彈性體形成，和/或，在向隔膜施加正壓之后，隔膜在流體室中可以是可變形的。可以通過朝向隔膜移動的銷以及致動層中的流體正壓的組合，來供給正壓。

本文的另一個方面提供了用于生物樣品制備或分析的方法。方法可以包括：提供微流體裝置，其具有第一通道，其具有一系列(n個)室，每個室具有第一體積(v)。第一通道可在第一通道的相對端部包括閥，其對第一通道進行流體隔離。此外，微流體裝置可以具有與第一通道流體連通的第二通道。第二通道可包括至少一個第二室，其具有總第二體積，其至少等于第一通道的總體積(n*v)。第二通道可在第二通道的相對端部包括閥，其使得第二通道與第一通道流體隔離。該方法還可包括：將在第一通道的n個室中的生物樣品或其衍生物的流，從第一通道導向到第二通道，或者從第二通道導向到第一通道。

在一些實施方式中，微流體裝置還可包括與第一通道和第二通道流體連通的第三通道。第三通道可包括至少一個第三室，其具有總第三體積，其至少等于第一通道和第二通道的體積之和(2n*v)。在一些實施方式中，對生物樣品或其衍生物的流進行導向還可包括：將生物樣品或其衍生物的流從第一通道或第二通道導向到第三通道，或者反之亦可。

在一些實施方式中，方法還可包括：將生物樣品或其衍生物的流從微流體裝置導向到與微流體裝置流體連通的傳感器陣列。傳感器陣列可包括個體傳感器，其檢測指示樣品或其衍生物相關聯的反應或反應產物的信號。在一些實施方式中，方法還包括使用個體傳感器，來檢測指示生物樣品或其衍生物相關聯的反應或反應產物的信號。在一些實施方式中，信號可對應于與生物樣品或珠相關聯的阻抗，所述珠在信號檢測期間與生物樣品相聯接。

通過如下詳細描述，本領域技術人員將更容易理解本文的其他方面和優點，其中，僅顯示和描述了本文的示意性實施方式。如即將意識到的，本文可以有其它不同的實施方式，而其若干細節可以在各種顯見的方面發生變化，而不會背離本文。因此，附圖和描述在其本職上應當視作是說明性的而不是限制性的。

通過引用納入

將本說明書中提到的所有發表物、專利和專利申請以其全文形式納入本文作為參考，就好像將各篇單獨的發表物、專利或專利申請具體地和單獨地通過引用納入本文一樣。

附圖說明

所附權利要求書中具體說明了本發明的新特征。通過參見如下(采用了本發明原理的)示意性實施方式中的詳細描述，將更好地理解本發明的特征和優點，其中，在所附的附圖(也稱作“圖”和“附圖”)中：

圖1是本文的多層軟光刻(MSL)數字氣動微流體(DPM)裝置的照片；

圖2示意性顯示DPM系統；

圖3示意性顯示本文的裝置的閥；

圖4示意性顯示本文的裝置的分開的層；

圖5示意性顯示本文的裝置的層；

圖6示意性顯示本文的雙致動閥；

圖7顯示用于熱循環的雙致動閥的俯視圖；

圖8顯示圖7的閥的背側圖；

圖9顯示設計成適用于雙致動閥的芯片；

圖10A示意性顯示本文的微流體裝置；

圖10B顯示流體圖案(第一面)，以及通孔位置；

圖10C顯示氣動圖案(第一面)，以及通孔位置；

圖11示意性顯示本文的微流體裝置的閥和泵送方案；

圖12示意性顯示在外部磁體的幫助下俘獲順磁性珠；

圖13示意性顯示在受控溫度下孵育1至6個體積；

圖14示意性顯示DPM芯片的例子，其中，流體層特征用黑線表示，氣動層特征用灰線表示，孔用雙圈表示；

圖15示意性顯示圖14所示的芯片的中央處理器；

圖16示意性顯示三種數字混合過程；

圖17示意性顯示兩個中央流處理器，它們共享相同的軌道和氣動控制通道；

圖18示意性顯示高度平行的微流體結構，其可適用于在輸入樣品上進行8種不同反應孵育，之后是反應池(例如，并行到串行轉換)和延長的孵育(例如，核酸雜交)；

圖19示意性顯示用于芯片操作的電路試驗板系統；

圖20示意性顯示芯片界面的分解圖；

圖21示意性顯示通過頂歧管的組裝系統；

圖22是通過頂歧管的組裝系統的照片；

圖23示意性顯示整合了傳感器芯片的本文的DPM芯片的俯視圖；

圖24示意性顯示整合了傳感器芯片的本文的DPM芯片的分解圖；

圖25示意性顯示整合了傳感器芯片的本文的DPM芯片的側視圖和底視圖；

圖26示意性顯示以編程方式或者其他方式適用于執行本文方法的計算機系統；

圖27顯示混合在本文的DPM芯片中的樣品的例子；

圖28顯示本文的DPM芯片中的磁性珠捕獲的例子；以及

圖29顯示本文的DPM芯片中的PCR反應的例子。

圖30A至30F示意性顯示示例性傳感器芯片及其使用。

具體實施方式

雖然本文顯示和描述了本發明的實施方式，但本領域技術人員顯然了解這些實施方式僅以舉例方式提供。本領域技術人員在不背離本發明的情況下可以作出多種改變、變化和取代。應理解，可實施本文所述的本發明實施方式的各種替代形式。

如本文所述，微流體裝置可以提供用于樣品制備的實驗室機器人的有用替代，因為微流體裝置減小了反應大小和試劑消耗，同時這些過程還是自動化的。但是，盡管開發了許多微流體技術，微流體系統的成功商業化是稀少的。一些現有的微流體系統需要澆鑄多層液體聚二甲基硅氧烷(PDMS)預聚物，這相比于注塑或熱浮雕是較為昂貴的工藝。PDMS自身相比于替代的熱塑性物質和熱塑性彈性體材料是昂貴的。此外，PDMS對于氣體、水和水溶性小分子是高度可透過的。這意味著用于此類裝置的泵和閥可能需要是(用水或油進行)液壓致動，而不是用空氣致動。在許多情況下，這些裝置與某些化學品是不相容的，或者可能經過表面處理才是可用的。總的來說，這些特性增加了微流體裝置的成本，同時還明顯限制了它們的使用。

其他微流體技術遭遇類似的高制造成本和/或使用限制了它們的使用的阻隔物的問題。因此，仍然需要低成本、通用且便于使用的微流體技術。

本文所用術語“樣品”通常指的是生物樣品。生物樣品的例子包括核酸分子、氨基酸、多肽、蛋白質、碳水化合物、脂肪或病毒。在一個例子中，生物樣品是包含一種或多種核酸分子的核酸樣品。

本文所用術語“核酸”通常指的是包含一個或多個核酸亞基的分子。核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其變化形式。核酸可以包括選自下組的一個或多個亞基：腺苷(A)、胞嘧碇(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，或其變化形式。核苷可以包括A、C、G、T或U，或其變化形式。核苷可以包括可結合到生長的核酸鏈中的任意亞基。此類亞基可以是A、C、G、T或U，或者一種或多種互補A、C、G、T或U，或者嘌呤的互補(即，A或G，或其變化形式)或嘧啶的互補(即，C、T、或U，或其變化形式)。在一些例子中，核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或變化形式。核酸可以是單鏈核酸或者雙鏈核酸。在一些情況中，核酸分子是環狀的。

本文所用術語“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”通常指的是核苷的聚合物形式，其可以具有各種長度，無論是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或者類似物。寡核苷酸通常包括4個核苷酸堿基的特定序列：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)，當多核甙酸是RNA時)。因此，術語“寡核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，術語可用于多核苷酸分子自身。該字母表示可以輸入到具有中央處理單元的計算機的數據庫中，并用于生物信息學應用，例如，功能基因組學和同源性搜索。寡核苷酸可包括一個或多個非標準核苷酸、核苷酸類似物和/或改性核苷酸。

本文所用術語“試劑”通常指的是可被采用用于樣品制備或分析的一種或多種物質。樣品制備可以包括樣品加工。樣品制備的一個例子是核酸擴增反應，例如，聚合酶鏈反應(PCR)。用于核酸擴增反應的試劑的例子包括一種或多種引物和聚合物，以及輔助因子(例如，鎂或錳)。

本文所用術語“聚合酶”通常指的是能夠催化聚合反應的任意酶。聚合酶的例子包括但不限于核酸聚合酶。聚合酶可以是聚合化酶。在一些情況下，使用轉錄酶或連接酶(即，催化鍵的形成的酶)。

數字氣動微流體裝置

本文提供了可用于生物樣品制備和/或分析的微流體裝置。本文的系統可用于生物和/或化學傳感系統的上游，例如本文其他地方所述的傳感器芯片。可以在微流體裝置中整合傳感功能，例如，在相同插件(cartridge)上，或者其可以與微流體裝置是分開的。傳感系統可用于感應各種生物物質或者生物和/或化學反應。例如，傳感系統可感應核酸、蛋白質、抗原和抗體。傳感系統可以包括一個或多個個體傳感器，并且可以位于微流體裝置的下游。傳感系統可以如本文其他地方所述，和/或如PCT專利申請號PCT/US2011/054769，PCT專利申請號PCT/US2012/039880，PCT專利申請號PCT/US2012/067645，PCT專利申請號PCT/US2014/027544，PCT專利申請號PCT/US2014/069624以及美國專利申請號13/481,858所述，其全文分別通過引用結合入本文。

本文相比于常規微流體芯片技術提供了各種優勢，包括但不限于：(i)用于芯片上的氣動膜泵和閥的優異低成本彈性體，(ii)低成本、大容量芯片制造方法，(iii)預配置的板上試劑，以及(iv)靈活加工不連續體積的數字構造。總的來說，這些材料、方法和設計可以生產低成本、低用戶負擔、高度功能化微流體芯片，其能夠單步混合組分，級聯任意數量的連續操作，在約為4～100℃的溫度下進行孵育反應，熱循環和加工用于核酸純化的磁性珠。這些裝置能夠實現在多種生物醫藥應用中，成本低廉且工作流有效地方式利用微流體技術，包括用于測序技術的不同樣品和文庫制備方法。

圖1顯示本文的多層軟光刻(MSL)裝置的例子，其可以進行細胞裂解，核酸(例如，DNA)純化，以及核酸擴增(例如，PCR)。該裝置可用于加工各種類型的樣品，例如，血液樣品。例如，該裝置可用于進行來自血液的核酸擴增。

本文提供了緊湊、成本低廉且工作流有效的數字氣動微流體(DPM)芯片系統，其能夠進行寬范圍的多步驟分子生物學方案，包括用于下一代測序(NGS)的靶向文庫制備。如圖2所示，DPM芯片可以在制造過程中裝置應用特定試劑，并用可去除的粘合劑膜200密封。在膜去除205之后，終端用戶可以在芯片中裝載樣品(例如，少量血液或純化DNA)和任意其它試劑(例如，帶條形碼的銜接體)，之后將其放入儀器中210。儀器可以致動芯片并保持不被污染，因為所有的樣品、試劑和廢棄物都可能容納在芯片內。

本文的DPM微流體裝置的結構基于整體式膜閥構造。如圖3所示，DPM裝置包括三層結構，其中，兩層圖案化硬層圍繞了中心未圖案化彈性膜。在一些實施方式中，圖案化硬層由注塑環烯烴聚合物(COP)制得。在一些情況下，硬層不是由蝕刻的玻璃制造的。在一些情況下，彈性體膜是由熱塑性彈性(TPE)膜制造的。在一些實施方式中，膜不包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

圖3顯示一般狀態下關閉(normally closed)的閥。致動層可包括：孔、通道和室，用于傳遞使得膜偏折的真空或正壓。致動層可以是氣動層，從而供給：(i)流體正壓和/或流體負壓(真空)；(ii)正壓(例如，在施加了機械銷之后)；或者(iii)正壓與正或負流體壓的組合。頂部流體層可以包括孔、通道和室，用于試劑/樣品儲存和流體流動。在氣動層中施加真空可拉動膜向下遠離流體層中的閥座(如所示)，從而打開閥，而施加正壓可以使得膜偏折向上抵靠住閥座，切斷流動。

圖3顯示本文的裝置的示例性閥。閥可以是隔膜閥，例如芯片上的微型閥。頂部流體層300可以承載輸入和輸出通道305和閥體，所述閥體包括被閥座310(例如，寬約為50-200μm)分隔開的兩個半圓截面(例如，直徑約為500-1000μm)。底部氣動層315可以承載氣動通道，其與圓形室相連，所述圓形室具有與頂部半圓截面相同的直徑。在三層夾層中心的未圖案化彈性體膜320可以通過經由氣動通道施加正壓向上偏折，或者可以通過經由啟動通道施加的真空向下偏折。當向上偏折時，膜可以形成抵靠住閥座的緊密密封，切斷通過閥的流體。當膜向下偏折時，閥打開，因為流體可以流動通過膜與閥座之間產生的空間。本文的實施方式可以與美國專利第8,584,703號所述的特征和構造相結合，其全文通過引用結合入本文，以得到更多實施方式。

可以在相同裝置上制造一般狀態下打開或者一般狀態下關閉的閥。圖3顯示一般狀態下關閉的示例性閥的結構，其包括閥座，所述閥座阻礙了流體層中的流動，除非通過施加到氣動層的真空使得膜主動縮回。(未示出的)一般狀態下打開的閥省略了閥座，并且可以包括圓頂形流體側閥體，以增強閥密封并使關閉(加壓)狀態下的死體積最小化。

圖4顯示用于制造圖1裝置的示例性方法。層1 400(射流)和層3 410(氣動)可以包括在一側上圖案化的硬熱塑性物質(通常是COP)，并且可以具有通孔作為輸入/輸出端口或井。層2 420可以包括夾在層1和3之間的未圖案化的彈性體膜。層1和3可以通過注塑制造，或者可以通過熱壓浮雕之后通過CNC機械加工進行鉆孔制造。層1可以具有兩層子層和/或在單層的每一側上具有不同開口，這里顯示為頂部井430和射流(fluidics)440。類似地，層3可以具有兩層子層和/或在單層的每一側上具有不同開口，這里顯示為底部井450和氣動頂部460。可以通過許多方法完成彈性體膜與熱塑性硬表面的粘附，這取決于膜的組成。在一些實施方式中，膜可以包括苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)或者其他熱塑性彈性體，表面可以通過氧等離子體處理活化，并且可以通過在適中溫度(例如，約100℃)層疊來組裝夾層結構。

如圖5所示是組裝的示例性芯片500的示意圖。芯片500具有流體層510、氣動層520和其間的TPE膜530。圖5是示例性DPM處理器芯片的三維CAD模型，其可以被用于產生用于注塑芯片的流體層和氣動層的CNC-機械加工的鋁模具。在該例子中，特征深度和通道寬度這兩者都是100μm(在兩層中都是這樣)，以及閥和泵直徑分別是750μm和2mm。一般狀態下打開的閥的閥座寬度是150μm。層厚度都是1.2mm，以及整體芯片橫向尺度是60mm x 38mm。

彈性體膜的特性(所述彈性體膜也可具有流體通道的底表面或底板、閥和泵的功能)對于裝置的性能會是重要的。膜可以是與芯片中加工的試劑、酶和核酸化學相容的，并且對于高至100℃的溫度(例如，對于熱循環)是穩定的，同時對于用于致動泵和閥的加壓空氣保持幾乎不可透過。因此，在一些情況下，本文提供的DPM芯片包括TPE膜。TPE是結合了橡膠的彈性與熱塑性物質的熱成形能力的聚合物材料。不同于熱固性聚合物(例如PDMS)，TPE可以被擠出、注塑和熱浮雕，這都有助于低成本批量生產。此外，TPE材料不會如同用于微流體中的其他材料那么昂貴。TPE可以是嵌段共聚物，其中“硬”聚合物和“橡膠狀”聚合物分隔成不同但是連接的微觀域。硬組分在高溫下的軟化可實現熱成形。可獲得具有寬范圍的各種機械和化學性質的TPE組成的多樣性。TPE的非限制性例子包括：熱塑性聚氨酯、苯乙烯熱塑性彈性體、陰離子型三嵌段共聚物、基于聚烯烴的熱塑性彈性體、含鹵素的基于聚烯烴的熱塑性彈性體、動態硫化彈性體熱塑性摻混物、聚醚酯彈性體、基于聚酰胺的彈性體、離聚物熱塑性彈性體、以及基于聚丙烯酸酯的熱塑性彈性體。TPE的其他例子參見《熱塑性彈性體》(第三版，編著：Holden,H.R.Kricheldorf,R.P.Quirk,Hanser，2004)所述，其全文通過引用結合入本文。

TPE組合物可以為微流體提供關鍵優勢，此類優勢包括降低的氣體可透過性和易于粘結。相比于類似厚度和機械模量的PDMS膜，TPE膜可以提供降低的氣體和小分子可透過性。該性質允許使用空氣壓力來致動膜泵和閥，因為透過進入流體層的空氣是可忽略不計的。使用空氣壓力可以顯著地降低終端用戶設定工作(用戶負擔)以及儀器使用成本和復雜度。TPE膜的降低的小分子可透過性(和低可提取性)特性還可以增加它們在分子生物學應用中的化學相容性。

TPE固有的如同粘合劑般的性質可以簡化三層芯片結構的組裝。這是因為僅在施加中等壓力和溫度的情況下，TPE膜可以牢固地粘合以及有效地粘結低表面能熱塑性表面。在一些情況下，穩定的三層芯片能夠在熱循環溫度(例如，100℃)耐受超過30psi的氣動壓力，并且可以使得裝置夾層結構通過廉價的商業層疊機進行簡單組裝。此外，可以通過UV-臭氧(UVO)處理容易地對熱塑性和TPE層的表面和粘結性質進行改性。

雙致動和銷閥

本文還提供了具有雙致動和/或銷閥的裝置。雙動閥可以增加氣動致動和機械致動(例如，用銷推動膜)。可以采用正壓(例如，加壓氣體，如空氣)或負壓(例如，真空)來幫助氣動致動。氣動致動和(例如，用銷的)機械致動可以是同時的，或者可以以交替和依次的方式進行(例如，氣動致動之后機械致動，或者反之亦可)。在一些情況下，雙動閥沒有替代氣動致動。參見顯示示例性銷閥的圖6，流體層600和氣動層605可以具有布置在其間的撓性膜610。可以靠著流體層615和/或氣動層620放置歧管，通過其對銷625或者其他機械元件進行致動。歧管可以具有O型環630，其可以保持氣動壓力(例如，真空)，并且銷可以滑動通過O型環。在圖6中沒有顯示流體通道和氣動通道。

例如，一般狀態下關閉的閥635具有銷625，其滑動通過O型環630。銷可以向膜施加額外壓力，使得膜密封抵靠住閥座。這種閥構造可用于在例如熱循環過程中對閥進行密封。

也可用機械銷來增強(不具有閥座的)泵640。這里，銷可以使得膜脫離與氣動室的底部的任意不合乎希望的附著。銷的這種使用還可有助于防止膜與熱循環相關的粘著，因為在暴露于超過約75℃的溫度之后，膜會與室底部粘著。當發生這種粘著時，泵明顯鈍化(故障)，因為膜不再能夠通過氣動壓力向上偏折。

也可用機械銷來增強一般狀態下打開的645(圓頂)閥。這里，銷可以使得膜從流體(圓頂)室的頂部脫離。這種實踐方式可以利用TPE膜的附著的優勢，并且實現液體試劑在芯片中的儲存。這種策略可以允許(例如，連接到儲存儲器的)閥在芯片使用之前保持關閉(例如，持續數個月)。可以通過在合適溫度(例如，90℃)下施加氣動壓力，實現制造過程中的穩定關閉。從而可以使得閥保持關閉，直到通過銷使得膜機械偏折。

圖7顯示用于熱循環的示例性雙致動閥的俯視圖。在一些情況下，氣動致動閥可能在熱循環過程中提供不足的密封能力。可以以機械方式向閥膜施加更高的關閉作用力。通過壓力和/或真空與機械作用力來致動兩個指示的閥700，通過可移動的銷705來傳遞機械作用力。可以通過小的氣動圓柱體來致動銷，所述小的氣動圓柱體可以向閥膜供給大且精確的作用力。銷可以通過氣動側孔達到膜。可以通過O型襯墊710保持壓力和/或真空，所述O型襯墊710接觸芯片底部并提供銷周圍的氣密密封。

圖8顯示圖7的閥的背側圖。歧管的背側上的額外襯墊800可以為銷805提供氣密密封。銷可以滑動通過襯墊到達芯片中的致動閥。硅酮真空脂可用于減小摩擦。

圖9顯示設計成適用于雙致動閥的芯片。主處理器具有：(i)芯片的加壓區段外的vSO和vS1閥，(ii)在閥vL和vR處適用的機械致動以及(iii)孤立的熱循環泵P0-P4。

DPM芯片構造和運行

本文通過描述兩種芯片構造以及芯片的運行例子，來闡述本發明的原理。但是這些僅僅是詳細實施方式，而不限制本發明的范圍。在本文的DPM芯片的第一個例子中，圖10A顯示示例性微流體裝置的復合示意圖，該微流體裝置包括三層：流體層、彈性層(膜)和氣動層。流體層和氣動層可以由硬的熱塑性材料(例如，環烯烴聚合物(COP))制造。膜層可以由彈性體層制得，其厚度是例如約為50微米(μm)至500μm。膜層可以夾在兩層硬層之間，其厚度可以是例如約為0.5-5毫米(mm)。可以由其他硬材料制造流體層和/或氣動層，包括：玻璃、熔融二氧化硅和硅，或者裝置可以完全由彈性體材料制造。裝置可以具有不止三層(例如，4、5、6、7、8、9或10層，或者更多層)。流體層和氣動層都可具有第一圖案化表面(其包括通道、閥或泵室)以及第二未圖案化表面。在一些情況下，第一表面和第二表面都是圖案化的。特征深度可以約為10-500μm，以及通道寬度可以約為10-500μm。此外，流體層和氣動層可以承載通孔，所述通道使得第一面上的通道與第二面連接。圖10B和10C顯示流體和氣動(第一面)圖案，以及通孔位置的例子。可以使得流體與氣動的圖案化第一表面朝向膜，來組裝裝置。

分別地，可以通過流體層和氣動層的第二(朝外)面上的通孔終端來制造流體和氣動與芯片的連接件。流體層通孔可以起到含流體井或者儲器的作用，并且為裝置提供輸入和/或輸出端口。可以通過應用氣動歧管(未示出)來對它們進行減壓或加壓。加壓可用于進行聚合酶鏈反應(PCR)或者其他類型的核酸擴增反應。氣動層通孔可以起到氣動端口的作用，將裝置的泵和閥連接到外部壓力源和真空源(未示出)。

參見圖10A-10C，裝置的中心區段(包括泵P1-P8、閥V1-V9和井W1-W3)起到通用目的流體處理器的作用，其能夠進行：高至6個反應組分的混合，升高溫度下的孵育反應、熱循環反應和采用磁性顆粒(例如，珠)的核酸(DNA和RNA)純化。中央處理器可以與兩個輸入/輸出系統流體連接，其供給反應組分、試劑、珠和清洗溶液等，以及提供通向廢物儲器的路徑。這兩個系統(稱作試劑軌道或簡稱為軌道)，共同地包括閥V10-V25和井W4-W19。

圖11顯示微流體裝置的示例性閥和泵送方案。通過閥1100控制流動，如上文所述，該閥能夠允許流動或者切斷流動。此外，圖11顯示具有所謂的流通閥1105的閥結構的裝置。流通閥在沒有X的箭頭所示的方向保持打開。在該構造中，閥座僅調節垂直方向(到達井或者離開經)的流動，如所示。圖11還顯示裝置泵1110，其可以是沒有閥座的大的閥。還顯示了井1115和通道1120。

參見圖10A-C，泵P1-P8負責裝置中的泵送和混合功能。在該示例性設計中，泵P1-P6具有相同結構并且當它們各自的膜經由通過它們各自的氣動控制線施加的真空下拉時，保持相同的流體體積。當施加正壓時，泵可以將其流體體積排出進入流體連接的相鄰通道中。在這種排空的狀態下，泵可以提供流體切斷功能，類似于本文所述的(具有閥座的)閥。

在一個例子中，圖10A-C的裝置可用于對兩個體積進行數字式混合。假定裝置的初始(和默認)狀態下，所有的泵和閥都是關閉的。參見圖10B，可以通過如下方式，用泵P1-P6來混合高至5個相同的、小的、離散(數字式)體積。例如，可以通過打開閥V3和V13，然后打開P1，將第一離散體積(V)從W7吸入P1。然后可以通過關閉V3，然后同時關閉P1并打開P2，將P1中的體積轉移到P2。接著，可以通過打開閥V1和V3，然后打開P1，將第二離散體積(V)從W7吸入P1。此時，可以通過首先關閉V1和V3，以及然后同時關閉P1和打開P3，使得相鄰閥(P1和P2)中的兩個離散體積混合。該動作可迫使P1的內含物流動通過P2，在P2中產生對流。結果是，如今停留在P2和P2中的兩個體積非常好地混合(例如，最大濃度梯度不超過10％、5％、3％、1％、0.5％或0.1％)。該過程可以重復1次或多次循環，通過如下方式使得兩個體積進一步簡單混合：使得圖案傳送到右邊(通過余下的閥，直到且含P6)并回到左邊(直到且含P1)。

在另一個例子中，圖10A-C的裝置可用于對3-5個體積進行數字式混合。參見上文所述工藝的簡單改進，可以以類似的方式對3-5個離散體積進行混合。例如，可以分別將3、4或5個離散體積首先裝載到P1-P3、P1-P4或P1-P5中。在所有這些情況下，至少一個泵會保持空置，以允許使用相似的混合模式。例如，在3個體積的情況下，P4、P5和P6保持空置，可以通過(a)關閉P1和打開P4，(b)關閉P2和打開P5，(c)關閉P3和打開P6來混合(初始在P1-P3)中的3個體積。然后可以顛倒該模式，以相反方向繼續混合。

在另一個例子中，圖10A-C的裝置可用于對6個體積進行數字式混合。在該情況下，首先填充P1-P6，以及采用P7進行混合，P7設計成具有等于P1-P6總和的內部體積(6V)。可以通過打開V6-V9，以及然后(近乎)同時關閉P1-P6和打開P7，來實現將P1-P6中的6個體積轉移到P7。可以通過(近乎)同時打開P1-P6和關閉P7，來實現將P7中的6V體積轉移回到P1-P6。

圖10A-C的裝置可用于純化磁性珠，其可以包括如下操作：混合、清洗、干燥和洗脫，其中，洗脫可以包括如下操作：重懸、再俘獲、分離、珠去除和轉移。

可以通過如下方式完成基于磁性珠的核酸純化：在含有鹽以及低分子量聚乙二醇(PEG)或醇(乙醇或異丙醇)的漿料中，混合等體積的磁性珠(例如，羧酸化聚合物順磁性珠)。在上文相對于圖10A-C所述的示例性裝置中，可以采用上文所述過程的簡單改進，來混合1、2、3或6體積的含核酸溶液與等體積的珠溶液。例如，可以通過如下方式在P1-P6中完全處理1體積或2體積：使得它們分別與1體積或2體積的珠溶液混合。這是因為，4個或2個泵分別保持初始空置，從而允許進行上文所述的混合方案。在另一個例子中，可以在P7的幫助下，對3體積的核酸混合物進行混合：首先用額外3體積的珠溶液完全填充P1-P6，然后在P1-P6和P7之間混合，如上文所述。在另一個例子中，可以在P7和P8的幫助下對6體積的核酸混合物進行混合：首先用(相對于占據P1-P6的核酸溶液等體積的)珠溶液填充P7，以及通過將P1-P6(6V)和P7(6V)轉移到P8(12V)中，再回過去，從而在(P1-P6)與P7和P8之間進行混合。可以采用閥V3、V4和V6-V9，來完成這些轉移。

在完成混合之后，可以對磁性珠進行清洗和干燥。如圖12所示，可以在外磁體的幫助下，在P6中俘獲磁性珠。可以通過如下方式完成磁性俘獲：將(初始停留在P1-P6、P7或P8中的)混合的磁性珠溶液泵送通過P1-P6，穿過磁體1200，到達右軌道中的目標廢物井(井W12-19)。一旦珠集中在P6中，可以將珠清洗溶液(例如，70％的EtOH)從一個軌道泵送到例如P7，轉移到P1-P6，然后通過P1-P5泵送到右側廢物井。類似地，可以以相同方式，通過泵送來源于另一軌道井的空氣，對珠進行干燥。

在清洗和/或干燥之后，可以從珠洗脫結合的核酸。洗脫可以涉及如下步驟序列：(a)重懸，(b)再俘獲，(c)分離，(d)珠去除，和(e)轉移。

對于重懸，在去除了磁體的情況下，P6中經干燥的珠可以與1體積的洗脫緩沖液(例如，Tris-EDTA(TE)緩沖液)混合，從珠釋放核酸，例如從P5泵送進入P6。在合適的情況下，可以通過P5和P6之間的額外相互轉移，來實現額外的重懸。

對于再俘獲，可以通過與P6相鄰重新布置磁體，來再俘獲P6中的珠。

對于分離，將P6中含有釋放的核酸的洗脫物溶液轉移到P5，將珠留在P6中。這樣就完成了洗脫。

對于珠去除，可以通過如下方式從P6洗出余留在P6中的珠：首先去除磁體，然后將珠去除溶液(例如，TE或稀NaOH)泵送進入P6，然后到廢物。

對于轉移，可以將P5中的洗出液轉移到產物輸出井，例如，井W3。或者，可以將其留在一個處理泵(P1-P6)中，從而可以使其與其它試劑混合用于進一步加工。

圖10A-C的裝置可用于溫度受控的孵育。泵P1-P6可以在受控溫度下孵育1至6個體積。如圖13所示，這可以通過對芯片的頂表面和/或底表面進行加熱和/或冷卻(例如，電阻加熱器或熱電偶珀耳帖加熱泵)來完成。分成2個或更多個熱控制區提供了對于核酸擴增(例如，PCR)的額外靈活性(如下文所述)。

圖10A-C的裝置可用于核酸擴增，例如PCR。參見圖13，對于多步驟核酸擴增(例如，2步驟PCR)占據1個或2個泵體積的反應可以通過如下方式在兩個溫度之間快速熱循環：例如，將溫度區一(“溫度區1”)保持在退火溫度(例如，約為65℃)；將溫度區三(“溫度區3”)保持在變性溫度(例如，約為95℃)；以及在P1或P2(或者這兩者)與P5和P6(或者這兩者)之間轉移反應。在該情況下，溫度區二(“溫度區2”)可以作為溫度區一和溫度區三之間的熱隔離區域。或者，可以通過如下方式將三溫度區用于三步驟核酸擴增(例如，三步驟PCR)：將溫度區二保持在中間延伸溫度(例如，約為72℃)，以及將反應合適地置于泵P1-P6之間。或者，可以將三個溫度區維持在相同溫度，并且這三者一起在退火溫度和變性溫度(或者退火溫度、延伸溫度和變性溫度)之間循環。在該情況下，反應可以是保持固定的或者在泵P1-P6間循環。

分子生物學方案可以是多步驟過程，包括如下一種或多種：(i)混合和/或孵育，(ii)純化，以及(iii)熱循環操作。圖14示意性顯示能夠提供這些功能的示例性通用DPM芯片構造，DPM芯片的中央處理器區域如圖15所示。裝置包括三個模塊化子部分：左側I/O軌道、中央處理器和右側I/O軌道。左側和右側I/O軌道分別包括8個流體輸入/輸出端口(分別是儲器L1-L8和R1-R8)，以及與它們相關的一般狀態下關閉的控制閥(未標出)。一起地，左側軌道和右側軌道為中央處理器提供了對用于試劑輸入和/或廢物輸出的16個流體端口的可及性。中央處理器可以包括一個或多個分支，如圖14和15所示的示例性裝置具有3個分支：(i)主處理器分支，其包括6個相同的一般狀態下打開的“單體積”泵(P0-P5)和3個I/O端口，2個用于樣品輸入(儲器S1、S2)和1個用于產物輸出(儲器P)以及它們相關的一般狀態下關閉的控制閥(未標出)；(ii)P6泵陣列分支，其包括6個一般狀態下打開的泵的陣列；以及(iii)P7泵陣列分支，其包括12個一般狀態下打開的泵的陣列。三個分支中的每一個裝在左側和右側，通過一般狀態下關閉的閥(vTL、vTR、vP6L、vP6R、vP7L、vP7R)允許每個分支選擇性地連接到另一個分支、左側I/O軌道或右側I/O軌道或者使得它們是隔離的。注意到，不同于可單獨致動的P0-P5，泵陣列P6和P7中的泵并行操作，因為它們的致動控制線是連結的。泵陣列P6可以設計成裝納P0-P5的內含物，以及泵陣列P7可以設計成裝納P0-P5加上泵陣列P6的內含物。如本文所述，該構造可同時促進多組分(例如，6組分)混合和基于磁性珠的DNA純化。

本文提供的DPM芯片構造的模塊化特性可促進多處理器芯片(其中，多個中央處理器共享共用的I/O軌道)。該裝置可以實現例如單一芯片上的多樣品(例如，4、8或16個樣品)的并行處理。

可以在圖14和圖15所示的芯片上進行涂底。涂底(priming)是可用于不同作用的、通常同時進行的制備過程，例如(i)去除空氣，以及(ii)對芯片通道、閥和泵進行清洗。當試劑和樣品首先從它們各自的儲器泵送進入芯片時，第一個動作(去除空氣)會是重要的，因為芯片初始充滿了空氣，可以將其轉移。第二個動作(清洗)使得反應組分和(在完成給定步驟之后可能留在芯片通道、閥和泵中的)產品的交叉污染最小化。可以通過從儲器到另一芯片位置中的廢物儲器的反復泵送，來對試劑或樣品進行涂底。例如，參見圖14，L1中的試劑可以通過將其泵送進入P0，使其從P0轉移到P5，然后離開到R1，來對其進行涂底。或者，如果主處理器運載了不能被丟棄的反應產物的話，仍然可以通過將P0的內含物泵送回到左側軌道中的不同儲器，來對L1中的試劑進行涂底。

可以在圖14和圖15所示的芯片上進行流體轉移和混合。DPM裝置可以對由每個相同的“單體積”泵P0-P5限定的離散(數字式)流體體積進行加工。圖16顯示三種示例性數字式混合過程，包括：1:1單體積混合1600，6體積混合1605，以及12體積混合1610。虛線框表示泵關閉，以及實線框表示泵打開(填充)。箭頭表示流體流動方向。試劑顯示為泵的暗灰色填充，以及樣品顯示為泵的亮灰色填充。參見圖14、圖15和圖16(1600處)，描述了示例性混合過程。例如，如果試劑停留在L1中以及樣品(例如核酸樣品)停留在S 1中，則可以混合試劑和樣品。在此類情況下，所有的泵和閥可以是初始關閉的，以及可以使用如下程序來混合試劑和樣品的體積(例如，等量單個體積)：其中，在程序的每個步驟之后，一般狀態下關閉的閥(但不是泵)可以被重新設定為關閉狀態：(i)可以通過打開L1的控制閥(vTL)和P0來裝載試劑，得到由P0將試劑從L1拉入P0所產生的抽吸；(ii)可以通過關閉P0和打開P1來移動試劑，得到P0中的試劑同時從P0排出并轉移進入P1；(iii)通過打開S 1的控制閥(vTL)和P0來裝載樣品，得到P0將樣品拉入P0所產生的抽吸(現在樣品和試劑停留在相鄰泵P0和P1中)；以及(iv)可以通過如下方式進行混合：關閉P0和打開P2，然后關閉P1和打開P3，然后關閉P2和打開P4，然后關閉P3和打開P5，使得P0中的樣品被推動通過P1進入P2，產生樣品和試劑的混合。混合可以重復任意次數(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)。應理解的是，上述示例性程序可用于混合任意兩種流體，包括兩種試劑流體和兩種樣品流體。除此之外，上文所述的混合過程可以被擴展至高達5種單獨組分和/或泵體積。

如圖16所示(1605)，可以采用泵陣列P6來完成6種組分/泵體積的混合。泵陣列P6和P7可以分別作為統一的6X和12X體積泵。P6可以通過P0-P5與P6之間的相互轉移來實現P0-P5內含物的混合。類似地，在另一個例子中，泵陣列P7可用于進行(初始分別位于P0-P5和泵陣列P6中的)兩個6體積組分的1:1混合。例如，該形態可用于例如使用PEG和/或NaCl緩沖液來從位于P0-P5中的6體積反應混合物純化物質。對于圖16所示的方案(1610)，可以通過如下方式對核酸進行純化：(i)將等體積的磁性珠漿料(例如，2X珠結合緩沖液中的6泵體積的磁性珠)裝載到P6中；以及(ii)通過P0-P5、泵陣列P6和泵陣列P7之間的相互泵送，混合P6中的磁性珠與P0-P5中的核酸。一旦完成混合，可以通過如下方式在P5中俘獲磁性珠：將混合物泵送通過P5到達右手試劑軌道中的廢物端口，同時在P5下方放置高強度磁體。

在上文所述的示例性芯片構造中，單體積混合模式可以在主處理器中采用多達5個(單)泵體積，通過用給定組分填充合適數量的泵，以1:1的比例混合5種不同組分，或者以不同比例(1:1，1:2，1:3等)混合較少組分。單體積混合模式足夠靈活，以向大多數核酸處理反應，例如用于末端修復、連接或A加尾的那些提供混合。這還足以進行鏈式組合連續反應(例如，多達4個連續反應)的方案，每個步驟均增加體積。在另一個例子中，6體積混合模式可以通過采用泵陣列P6將該靈活性擴展至5個連續反應和第六個混合體積。最后，如本文中另一個例子所述，采用泵陣列P7的12體積混合模式可用于從6體積反應開始用磁性珠來促進核酸純化。

圖17顯示示例性DPM芯片，其具有平行中央流體處理器，并且顯示兩個(或者更多個，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)中央流體處理器是如何能夠共享相同的軌道和氣動控制通道。在該情況下，對于多個輸入樣品的相同平行加工，多個流體處理器可以以鎖步(lock-step)方式進行操作。對于圖17所示的示例性DPM芯片的適當操作，需要兩個水平(無相互作用)的氣動控制通道(未示出)。

圖18顯示并行-串行反應轉換的例子以及示例性高度平行的微流體構造的示意圖，其可適用于在輸入樣品上進行8種不同反應孵育，之后是反應池(例如，并行到串行轉換)和延長的孵育(例如，核酸雜交)。8種反應可分別包括：反應緩沖液、核酸、第一酶和第二酶。圖18所示的示例性構造可用于例如進行16種不同限制酶(第一組8種酶和第二組8種酶)的斷裂步驟。

微流體系統

如本文所述，DPM芯片可以通過正壓致動(來關閉泵和閥)以及通過真空致動(打開泵和閥)。作為圖14所示的示例性裝置的補充并且對其進行參照：(i)可以對主處理器泵P0-P4進行溫度控制用于熱循環(和其他溫度相關反應)；以及(ii)高強度磁體可以與芯片的底側接觸或不接觸，從而有助于P5中磁性珠的收集。圖19和圖20示意性顯示能夠接收本文所述的DPM芯片及其組件的示例性系統，其中，相同附圖標記表示相同元件。可以將系統構建在鋁基底歧管1900上，其與芯片1905的底表面匹配。如圖20所示，基底歧管載有通孔2000和用于襯墊2005的口袋，這產生了與芯片底側氣動端口的氣密密封。

基底歧管1900還可包括容納加熱器2010的口袋和用于可移動磁體2015的通孔，通過致動器垂直定位。可以通過鋁斜面1915經由閂和翼形螺釘(未示出)，將芯片1905壓到襯墊2005上。最后，可以放置可去除的透明聚碳酸酯頂歧管1920(其承載了氣密密封襯墊和透明的氧化銦錫(ITO)加熱器)與芯片的頂側1905接觸。如下文所述，頂歧管可用于熱循環。壓力和真空可以經由安裝在基底歧管任一側上的計算機控制的電磁閥1925通向芯片泵和閥。電磁閥1925可以經由(未示出的)撓性管連接到歧管的底側。除了在正壓和真空之間進行選擇之外，電磁閥1925可以連接到例如P4和P5(如圖14所示)，并且可以在(未示出的)兩個不同限流器之間切換，以控制這些泵在打開和關閉狀態之間轉換的速率。可以由(未示出的)分開的泵箱來提供正壓和真空。可以在適當的正壓(例如，30psi正壓)和適當的負壓(例如，-13.5psi真空)水平下操作芯片。

圖21和圖22顯示當在示例性系統中的芯片的俯視圖，相同附圖標記表示相同元件。在圖21中，芯片的流體通道表示為黑線2100。芯片可以包括頂部和底部加熱器2105，它們可以分別放置在泵P0-P4上方和下方，并用襯墊2110密封。此外，可以放置屏蔽的磁體2115，使其左邊緣位于P5的中心，用于收集磁性珠。底側加熱器組件2105可以在一個或多個泵(例如，如圖14所示的泵P0-P4，去除了頂歧管)下方是視覺可見的。頂側和底側加熱器可以是任意合適的加熱器。例如，底側加熱器可以是如下堆疊，其(從上到下)包括：銅加熱分布塊(具有熱電偶)、螺旋狀加熱其PC板、聚碳酸酯間隔塊和閉孔泡沫層，以提供垂直柔順性。熱電偶和PC板加熱器線圈可以通過基底歧管中的小孔垂直向下進入。在另一個例子中，頂側加熱器可以是氧化銦錫(ITO)加熱器。該頂側ITO加熱器可以包括玻璃或藍寶石基材，其背側涂覆有薄的透明ITO傳導膜和金屬電極。可以將小的熱電偶(未示出)膠合到其背側，以及熱電偶和加熱器線圈(未示出)可以通過氣密通過孔離開頂歧管。為芯片提供兩側加熱的兩個加熱器(例如用于快速熱循環)可以通過連接到計算機的兩個可編程比例-積分-微分(PID)控制器和H-橋進行控制。控制器可以用載有內部熱電偶(其測量內部芯片溫度)的芯片進行校準。

可以在加熱(例如，熱循環)過程中加熱頂歧管，以使得溫度引發的氣泡生長最小化。可以通過頂歧管的右側上的裝配(fitting)來完成加壓，以及矩形密封襯墊2120可以維持與芯片頂表面的氣密密封。系統組件，例如電磁閥、磁體致動器和加熱器全都可以通過計算機進行控制。在一些情況下，計算機可以運行LabView軟件，其包括能夠讀取含有電磁閥和芯片子系統的命令的文件的腳本注釋器。

本文的方法、閥、芯片和/或系統的其他特征包括：(i)使得閥泄漏和泵/閥死體積最小化；(ii)使得TPE膜蠕變和/或粘著(例如，熱循環過程中的情況)最小化；(iii)使得氣泡產生(例如，熱循環過程中的情況)最小化；(iv)芯片上的試劑儲存；以及(v)可靠的NGS文庫制備，其涉及多重酶反應、基于磁性珠的核酸擴增和熱循環。

膜閥和泵功能會取決于彈性體膜的特征幾何形貌與粘彈性性質的復雜相互作用，這進而會取決于其化學組成、制造條件(在該情況下，擠出)、厚度和工作溫度。具體來說，閥或泵的密封或關閉的程度(分別)會取決于彈性體膜與閥或泵流體側主體(例如，在一般狀態下打開的閥的情況下的圓頂，或者在一般狀態下關閉的閥的情況下的閥座)的順應程度。對于任意給定的膜的膜模量，這會取決于垂直變形距離(特征深度)、閥體直徑(較大的直徑產生較小的應力)和/或膜厚度(較薄的膜變形所需的作用力較小)。可以通過有限元建模(FEM)來指導膜閥和泵的涉及，但是精確的模擬會取決于現有的精確材料參數(例如，儲存模量、損耗模量、和損耗角正切(tan delta，δ)，這對于每種新的彈性體組成，可以通過例如動態機械熱分析(DMΤA)來確定)。

DPM芯片閥和泵的設計可以出于下列目的進行優化：(i)功能產出；(ii)使得泄漏和死體積最小化；或者(iii)高溫膜操作。因素(ii)和(iii)都會影響熱循環過程中的性能。例如，泄漏會阻礙熱循環泵(例如，圖14所示的P0-P4)的最大化加壓，以及高溫下的膜故障使得泵失靈。對于(iii)，明顯的溫度誘發的蠕變(永久變形)可能導致熱循環過程中(和之后的)泵故障。類似地，熱循環過程中增加的COP-TPE粘著會使得泵不能運行，這是由于打開或關閉狀態下的與泵體結構的明顯不可逆粘著導致的。具體來說，(例如，在95℃)SEBS TPE的硬苯乙烯組分的軟化會起到同時促進該溫度范圍內的蠕變和粘著的作用。

如本文所述，簡易的芯片組件是本文所述的裝置的一個關鍵優勢。在一些情況下，可以通過增加的層疊溫度、壓力和時間(它們全都可以促進更緊密的分子結合，并且在一些情況下，可以促進兩個表面的相互擴散)來促進TPE膜與低表面能熱塑性物質(例如COP)的粘附。此外，經由UV-臭氧(UVO)處理的表面制備對于COP表面和TPE膜的粘附具有相反作用，增加的COP表面的UVO暴露增加了COP-TPE粘附，而增加的TPE膜表面的UVO暴露降低了COP-TPE粘附。為了優化產率，COP-TPE粘附可以表征為如下的函數：(a)UVO處理時間(例如，約為0-10分鐘)，以及(b)層疊溫度(例如，約為25-250℃)、壓力(約為1-50PSI)和進料速率(約為10-100mm/分鐘)。整體芯片粘結質量可以通過如下方式進行定性評估：(i)層疊之后的粘結夾層結構中的任意空穴或空氣袋的數量和尺寸，(ii)將組裝的芯片手動撬開所需的作用力，(iii)將TPE膜從COP表面剝開所需的作用力(剝離測試)，以及(iv)卡住的(故障)閥和/或泵的數量。

可以對泵和閥的幾何形貌進行優化。流體和氣動層可以設計和制造成具有各種閥和泵體形狀(平坦、圓頂)、深度(例如，約為100-250μm)、直徑(例如，約為0.5-2mm)、閥座寬度(例如，約為100-300μm)和閥座表面凹陷距離(例如，約為0-50μm)。這些可以與具有不同組成和厚度的TPE膜組裝成芯片，如本文所述。在組裝之前，可以使用例如顯微鏡(例如，3D光學輪廓顯微鏡(Zeta-20光學輪廓儀))來檢查注塑泵、閥和通道特征，這可以確保通過模具制造(CNC機械加工)和注塑過程，將3D CAD模型幾何形貌精確地轉換成實際特征幾何形貌。

可以通過室溫和熱循環溫度(例如，約為60-95℃)下的泄漏和死體積來表征組裝的裝置中的閥和泵。通過低功率放大倍數下的食物染色可以容易地觀察定性性能(泄漏和未掃過的死體積)。泄漏可以通過測量通過封閉泵和閥的流量與施加的流體壓力之間的關系來進行定量表征。例如，可以通過測量1:1混合狀態下的DNA溶液與TE的混合比，來定量表征有效的未掃過的死體積。這可以通過采用雙鏈DNA特異性熒光(Qubit)化驗來測量初始和最終DNA濃度來完成。

在一些實施方式中，TPE膜合適高溫下的操作。例如，SEBS TPE的最高工作溫度會由苯乙烯(硬)組分的熔化溫度確定，這接近95℃(玻璃轉化溫度，Tg)。在一些情況下，這對于熱循環應用是不夠的，所述熱循環應用通常是約為95-99℃的溫度下使得核酸變性。例如，可以通過如下方式來改性SEBS TPE的性質：(i)與其他聚合物，例如無規共聚物聚丙烯(rcPP，Tg＝134℃)摻混；以及(ii)通過電子束誘導的交聯。為了完成(i)，可以產生具有不同厚度(例如，約為100μm或250μm)的含不同量的rcPP(例如，約為0重量％、5重量％、10重量％和15重量％)的TPE膜。為了完成(ii)，可以將膜暴露于電子束輻射，劑量約為60-240千戈瑞(kGy)。此外，可以使用非SEBS TPE材料，例如，熱塑性氨基甲酸酯(TPU)。

可以通過視覺檢查泵活動的方式定性監測熱循環過程中芯片泵的性能，以及通過確定熱循環之后留在泵中的流體體積的方式定量監測熱循環過程中芯片泵的性能。可以通過例如用顯微鏡(例如，Zeta-20光學輪廓顯微鏡)通過拆開經熱循環的芯片并檢查膜表面的任何明顯變形(例如，特征高度>10μm)，來評估溫度誘發的蠕變。泵和閥中的過度粘著可通過熱循環過程中觀察閥和泵功能之后拆開芯片來確定蠕變量來進行表征。此外，可以使用遮光UVO(或者其他等離子體)處理和/或向TPE膜和/或泵體選擇性施加特氟龍AF(液體特氟龍Teflon)，來選擇性降低熱循環條件下的COP-TPE粘附。此外，DMTA儀器(例如，Q800DMTA儀器)可用于表征膜的溫度依賴性機械性質，以及采用所附的軟件(例如，SolidWorks FEM軟件)來表征模型閥和泵功能。

在一個例子中，泵可在如下(芯片-內部)溫度曲線下進行至多40個循環之后正常運行：在95℃持續2分鐘，之后，以95℃持續10秒、60℃持續1-10分鐘的循環模式進行40次循環。

在一些實施方式中，在本文的微流體芯片中，在熱循環過程中沒有形成氣泡。可以使得溫度誘發的氣泡成核最小化。氣泡引發溫度(例如，泡核沸騰的起始)會與環境壓力、溶質組成、溶解的空氣、是否存在不溶性(碎屑)顆粒、以及容器壁的物理性質相關。可以優化這些因素來使得氣泡形成最小化。

在一些情況下，在高于約75℃的溫度，氣泡會快速生長。使得反應在75-95℃之間的耗時最小化可以使得氣泡的形成最小化。圖29所示的例子顯示，在一些情況下，頂部和底部加熱器需要約30秒將它們從退火溫度轉變為變性溫度。該時間會受到加熱器消散的最大功率的限制。此外，加熱器可就最大功率消散進行設計。相反地，可以通過從經加熱的芯片區域的熱質量的被動熱傳輸來確定冷卻所需的時間。

約為1-10微米的表面粗糙度可以促進來自微觀未潤濕顆粒/容器表面的俘獲空氣的膨脹以及水蒸氣氣泡成核。與明顯疏水性的TPE膜(例如COP流體閥體)結合，這些不規則性可以俘獲空氣微氣泡，該微氣泡同時會發生膨脹和促進熱循環溫度下的水蒸汽氣泡的成核。因此，本文的裝置表面可設計成是光滑的，粗糙度小于約10微米、小于約5微米、小于約1微米、小于約0.5微米、小于約0.1微米、小于約0.05微米、或者小于約0.01微米。

此外，可以通過如下方式減少或消除熱循環溫度下的氣泡形成：(a)調節溫度過渡時間，(b)調節潤濕和溶質，(c)調節特征光滑性，或者(d)使用主動除泡器。

為了使得加熱時間最小化，可以確定頂部和底部加熱器的最大功率消散限值，并分別在它們的限值或接近它們的限值下運行。如果由于現有的密度限制無法明顯降低過渡時間，可以將加熱器設計成具有增加的橫截面傳導路徑(例如，對于底部PCB加熱器的銅軌跡厚度和寬度，以及對于頂部加熱器的更厚的ITO膜)。為了同時優化加熱和冷卻時間，可以通過如下方式減小芯片的有效熱質量(熱容量)：減小COP流體和氣動層的厚度(例如，減小約50％)和/或在兩個層中研磨掉外部表面上與一個或多個泵(例如，如圖14所示的泵P0-P4)一致的矩形截面。此外，可以評估結合了厚度降低的(例如，100μm而不是250μm)的TPE膜的芯片的熱性能。例如，熱系統的SolidWorks FEM建模可以指導此類優化。

具有6-10范圍的親水性-親脂性平衡(HLB)的表面活性劑可以作為潤濕劑，其可以使得親水性芯片表面上的空氣保持性最小化。可以用表面活性劑例如Span20(HLB＝8.6)、Span40(HLB＝6.7)、Brij52(HLB＝5.3)和BrijL4(HLB＝9.0)評估熱循環性能，它們的熱循環相容性在靜態和動態涂覆條件下表征。對于靜態涂覆，例如，可以將80％的EtOH中1％的表面活性劑泵送到主處理器中，在接近TPE Tg(95-134℃)退火數小時，之后進行熱循環測試。對于動態涂覆，可以直接將表面活性劑添加到緩沖液(例如，最終濃度范圍為0.01-1％)。此外，高沸點熱循環相容性試劑例如丙三醇和PEG可以添加到熱循環緩沖液中，以提升它們的沸點并防止形成氣泡。

在一些情況下，增加的模具特征光滑度可以通過如下方式增加最大(不含氣泡)芯片運行溫度：產生具有增加的特征光滑度水平的芯片模具，這是通過如下方式實現的：(i)對交替的圖案/光柵極進行機械加工以及減小的步階尺寸，(iii)拋光，以及(iv)鎳涂覆(例如，膜厚度為10-25μm)。

在一些情況下，通過裝配具有疏水性膜的泵(例如，圖14所示的泵P0-P4)，芯片可以具有主動脫氣/去除氣泡能力。例如，混合的特氟龍AF-PDMS膜可以在熱循環條件下提供有效的氣體去除，具有最少水分損失。

主動除泡器的采用可能會涉及頂歧管的改性，以提供：(i)頂側加熱器和膜之間的間隙，以及(ii)與膜的頂表面的真空緊密密封界面(O型環)，而不是對于整個芯片表面的正壓。膜可以同時提供熱循環之前的脫氣能力以及熱循環過程中的氣泡去除。

在一些實施方式中，本文的系統具有如下特點：(i)在高至40次擴增循環(芯片內溫度曲線為95℃持續2分鐘，之后是40次循環的95℃持續10秒、60℃持續1-10分鐘循環)下視覺可忽略的核酸擴增(例如PCR)反應體積的位移，以及(ii)相同反應下，常規熱循環產率的2X擴增內(一次理想核酸擴增(例如PCR)循環)的擴增(例如PCR)產物產率。

裝配預裝載試劑的芯片可提供明顯的用戶負擔減輕。在一些實施方式中，可以裝納酶和/或緩沖液、磁性珠(例如，漿料)和含乙醇清洗溶液。這可以通過COP-PTE粘附現象的開發產生“半永久性封閉”(SPC)閥來實現。在本文的DPM芯片中結合半永久性封閉的閥可以防止(在制造過程中沉積在芯片儲器中的)液體試劑在儲存過程中永久地泄漏到芯片通道中。

可以用過施加交替的溫度和/或壓力曲線，來操縱閥中的COP-TPE粘附。因此，可以穩定化關閉狀態，從而在各種環境條件下，在沒有施加控制(正)壓力的情況下，使其保持穩定和不發生泄漏一段延長的時間段(例如，長達一年)。可以通過在制造過程中施加第一壓力和/或溫度曲線來激活所謂的“半關閉”狀態，并且當芯片待用時通過施加第二溫度和/或壓力曲線來得以反轉。可以通過如下方式完成儀器中運行時的反轉：例如，放置小的局部化加熱器(例如，封裝在基底歧管中)與在左邊和右邊的試劑軌道中合適的閥接觸，向泵控制線施加真空，和/或相儲器施加正壓。還可以通過使用本文所述的銷閥來完成反轉。

可以用本文所述的TPE組合物和閥設計來實現半永久性關閉(SPC)狀態。這可以通過如下方式完成：使得閥經受關閉和打開溫度和/或壓力曲線跨度：約為25-100℃，和對于關閉約為5-30PSI(對于打開為真空)，以及施加時間約為1-24小時(關閉)和約為30秒至5分鐘(打開)。SPC閥結構可以提供：(i)較大的膜-閥體接觸面積和/或(ii)微圖案化(粗糙化)接觸表面，其增加了接觸面積并從而強化粘附(例如通過模具上的CNC機械加工標記容易地提供粗糙化)。此外，可以通過如下方式穩定化SPC閥的關閉狀態：(i)COP閥結構的局部增加的UVO處理，和/或(ii)TPE膜局部減少的UVO處理。這可以是在UVO處理過程中，在遮光板的幫助下完成的。最后，在SPC閥中可以使用各種TPE組合物，具有或者不具有增粘劑(例如，C5脂族和/或C9芳族烴樹脂)。但是，使用任意此類粘附強化的TPE膜會需要芯片與兩種不同PTE膜片組裝，一種用于正常閥操作，以及具有增加粘附的一種用于SPC閥。

作為半永久性關閉閥的改進或替代，可以在酶溶液在試劑儲器中凍干/冷凍干燥的情況下使用干燥試劑。這樣的話，終端用戶通過添加水(或者TE或乙醇清洗溶液)使得酶再水合。可以通過經由高體積泵陣列(例如，圖15所示的P7陣列)將添加的水往復泵送進入和離開儲器，來促進再水合。

在一些情況下，本文所述的裝置在芯片上儲存了磁性珠溶液。在一些情況下，可以在小于1小時內沉淀1μm(或更大)直徑的珠，成為堆積狀態并且在約為24小時之后難以重懸。在一些情況下，可以通過如下方式反轉長期和短期沉淀：(i)在致動之前對芯片進行渦旋或攪動，和/或(ii)采用高體積泵陣列(例如，圖15所示的P7陣列)進行高流量往復芯片上的泵送進入/離開珠溶液儲器。在一些情況下，(iii)對珠儲器下面的膜進行(氣動或機械)致動，使得封裝的珠可以重復地從其表面彈導發射進入溶液。

測序文庫制備

靶向富集是數種NGS文庫制備方法中的一種，并且可用于PCT專利申請號PCT/US2011/054769、PCT專利申請號PCT/US2012/039880、PCT專利申請號PCT/US2012/067645、PCT專利申請號PCT/US2014/027544、PCT專利申請號PCT/US2014/069624和美國專利申請號13/481,858所述的測序裝置和方法，其全文分別通過引用結合入本文。在一些情況下，DPM芯片可用于Ion AmpliSeq^TM靶向富集文庫制備，下文將其描述為示意性實施例。示例性Ion AmpliSeq^TM方案從11-21次循環的高度復合PCR反應開始(這取決于引物池復雜性)，之后是部分消化(末端修復)和銜接子連接反應，沒有任何中間純化和/或濃縮步驟。向生長的反應體積中可以依次添加總計7種酶和DNA組分。連接反應之后可以跟有基于AMPure(AM純)磁性珠的清潔步驟。然后可以將經過清洗和干燥的珠直接混合到第二PCR反應中，這同時擴增了靶向序列和添加了額外的“平衡”序列，這可用于最終標準化步驟。標準化可依賴于抗生蛋白鏈菌素涂覆的磁性珠，并且限制生物素化DNA探針的數量，所述生物素化DNA探針特異性地雜交至擴增子的平衡序列，從而在珠上固定確定量的擴增子池。在清洗之后，可以從TE-糖原緩沖液中的珠去雜交(洗脫)最終的、標準化的擴增子。

將Ion AmpliSeq^TM方案(或者任意其他方案)適用于DPM加工會涉及反應體積的減少和將混合比調節為量化(數字)值，例如1:1、1:2等。例如，起始PCR反應可包括三種組分體積：V(1)4μL 5X Ion AmpliSeq HiFi Mix(離子AmpliSeq HiFi混合)，V(2)4μL 5X Ion AmpliSeq Primer Pool(離子AmpliSeq引物池)，以及V(3)12μL DNA模板。HiFi混合和引物池的最終濃度會是20μL反應體積中的1X。在DPM加工的情況下，加工可以描述為數字單元或泵體積(V、2V、3V等)；V是單個(打開/填充)泵中所含的流體體積，可以是例如約為0.3μL。V(1)和V(2)的一比一混合會產生2V(1.2)(2體積的組分1和2)，都是一半(2.5X)濃度。在一些情況下，可以排出這些體積中的一個(泵送到廢物儲器)，留下1V(1.2)。然后添加單體積的第三組分(模板DNA)會產生2體積的完全反應(2V(1.2.3))，其中，試劑濃度(1和2)再次減半為1.25X。因此，在該例子中，HiFi混合和引物的最終濃度比小試規模方案(bench protocol)中高25％。可以通過用合適的緩沖液對兩種試劑進行預稀釋(從5X到4X)，將這些最終濃度向下調節至1X，使得在上述例子中DPM加工的反應與三種例外情況的小試規模反應在化學上一致。

在第一種例外情況下，最終DNA目標濃度從1X降低至0.83X。第二種情況，反應體積從20μL減少到0.6μL。第三種情況，引物(池)質量、聚合酶質量和dNTP質量都減少約25倍的因子(4/0.15＝26.7)。因此，擴增產物(擴增子)的最大可能量(質量)也減少類似因子。

在一些情況下，DPM芯片的右邊和坐標I/O軌道可裝納多種Ion AmpliSeq^TM試劑(例如，高至13種)，并且提供廢物儲器(左邊軌道)以及廢物和空氣儲器(右邊軌道)。對于每種樣品的特定DNA試劑(例如，樣品DNA和帶條形碼的銜接體)可分別輸入到處理器特定儲器(例如，圖14所示的S0和S1)，以及可以從輸出儲器(例如，圖14所示的P)去除產物。

整合傳感器芯片的DPM芯片

本文的微流體閥和裝置可整合一個或多個傳感器芯片。本文的微流體閥和裝置可以為傳感器芯片提供一種或多種流體物質和/或從傳感器芯片去除一種或多種流體物質。此外，本文提供的微流體閥和裝置可以制備用于反應的樣品和/或試劑，和/或在傳感器芯片中感應此類反應。因此，傳感器芯片可以包括一個或多個流體通道，其能夠從本文所述的微流體閥和裝置接收/輸出一種或多種流體物質。此類流體通道可以與本文所述的微流體閥和裝置流體連接。此外，本文所述的DPM芯片可以包括一個或多個傳感器芯片。該傳感器芯片可以是DPM芯片的固定、永久性特征(例如，不可從DPM芯片去除)或者可以是可添加/可去除特征。

傳感器芯片的例子參見PCT專利申請號PCT/US2011/054769、PCT專利申請號PCT/US2012/039880、PCT專利申請號PCT/US2012/067645、PCT專利申請號PCT/US2014/027544、PCT專利申請號PCT/US2014/069624和美國專利申請號13/481,858所述，其全文分別通過引用結合入本文。

傳感器芯片可包括一個或多個傳感器，其可以布置成陣列，例如傳感器陣列。傳感器陣列可包括包含了多個傳感器的基本平坦基材。在一些情況下，傳感器可包括一個或多個相同電極和/或不同電極。在一些情況下，傳感器可以包括一對電極。可以使用傳感器(例如經由電極)來檢測一種或多種物質(例如，核酸、蛋白質、抗體、縮氨酸、小分子等)和/或感興趣的反應，例如與核酸測序反應相關的引物延伸反應過程中的核苷酸引入。感興趣的反應的其他例子包括：受體-配體結合反應、抗體-抗原結合反應、核酸雜交反應，蛋白質-蛋白質相互作用、酶反應等。傳感器可以是任意合適類型的電傳感器或光傳感器，其能夠感應物質和/或感興趣的反應。在一些情況下，傳感器(例如，納米橋傳感器)可以作為pH或電荷傳感器，此類傳感器的例子參見題為“BIOSENSOR DEVICES,SYSTEMS AND METHODS THEREFOR(生物傳感器裝置、系統及其方法)”的美國專利公開申請號US 2012/0138460所述，其全文通過引用結合入本文。該傳感器可檢測與物質和/或感興趣的反應相關的pH變化(例如，局部pH變化)或者電荷變化(例如，局部電荷變化)。

在一些情況下，傳感器(例如，納米針傳感器)可作為電荷、導電率和/或電阻傳感器。該傳感器可檢測與物質和/或感興趣的反應相關的電荷變化(例如，局部電荷變化)、導電率變化(例如，局部導電率變化)、電阻變化(例如，局部電阻變化)。此類傳感系統如PCT專利申請號PCT/US2011/054769，PCT專利申請號PCT/US2012/039880，PCT專利申請號PCT/US2012/067645，PCT專利申請號PCT/US2014/027544以及美國專利申請號13/481,858所述，其全文分別通過引用結合入本文。在一些情況下，傳感器可作為熱傳感器或者電容傳感器。該傳感器可檢測與物質和/或感興趣的反應相關的熱變化(例如，局部熱變化)或者電容變化(例如，局部電容變化)。應理解的是，傳感器可經由一種或多種特性感應物質和/或感興趣的反應，例如，電荷和電阻、導電率和電荷、導電率和電阻、傳導率、電荷和電阻等。

感應物質和/或感興趣的反應可基于以下至少一種：局部pH變化、局部電阻變化、局部熱檢測、局部電容變化、局部電荷濃度(或其變化)以及局部導電率變化。在一些實施方式中，傳感器可以通過如下方式感應物質和/或感興趣的反應：感應物質和/或感興趣的反應的一種或多種試劑或產物的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些實施方式中，物質和/或感興趣的反應的一種或多種試劑或產物可以與載體(珠、顆粒或者其他類型的表面)相聯接。在此類情況下，傳感器可以通過如下方式感應物質和/或感興趣的反應：感應載體或與載體相連的物質的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些實施方式中，載體可以是磁性載體(例如，磁性珠或顆粒)，在感應過程中，其可以與傳感器磁性固定相鄰或者處于其附近。在一些實施方式中，載體可以是在感應過程中與傳感器靜電固定相鄰或者處于其附近的載體。在一些實施方式中，物質和/或感興趣的反應的一種或多種試劑或產物可以與傳感器表面相聯接。在此類情況下，傳感器可以通過如下方式感應物質和/或感興趣的反應：感應載體的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些情況下，傳感器可以在(i)物質或者感興趣的反應的一種或多種試劑和/或產物；(ii)與傳感器相關的載體；(iii)與載體或傳感器相關的物質或者感興趣的反應的一種或多種試劑和/或產物；和/或(iv)傳感器的德拜長度(例如，德拜層)內感應物質和/或感興趣的反應。

例如，感興趣的反應可以是核酸測序反應，例如合成測序反應。在該合成測序反應中，模板核酸可以通過如下方式進行測序：將引物與模板核酸雜交，并以模板導向方式經由聚合酶的作用，用核苷酸延伸引物(例如，使核苷酸納入至模板核酸)。傳感器芯片的傳感器可以在其發生時和/或發生之后感應核苷酸納入事件，其中，從傳感器獲得的信號可用于產生模板核酸的序列。不同的核苷酸(例如，具有包含腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的堿基的核苷酸)可以與模板核酸以依次方式接觸(例如，流入芯片中)，從而每個感應到的核酸納入事件可被鑒定為特定核苷酸的納入。

感應核苷酸納入事件可基于以下至少一種：局部pH變化、局部電阻變化、局部熱檢測、局部電容變化、局部電荷濃度(或其變化)以及局部導電率變化。在一些實施方式中，傳感器可以通過如下方式感應核苷酸納入事件：感應納入了核苷酸的模板核酸的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些情況下，模板核酸可以與載體(例如，珠、顆粒或者其他類型的表面)聯接。在該情況下，傳感器可以通過如下方式感應核苷酸納入事件：感應模板核酸分子和/或載體的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些情況下，模板核酸可與傳感器的表面連接。在該情況下，傳感器可以通過如下方式感應核苷酸納入事件：感應模板核酸分子和/或傳感器的局部電導率變化(例如，檢測指示局部電導率變化的信號)、局部電阻變化、局部電容變化和/或局部電荷濃度(或其變化)。在一些情況下，傳感器可以在(i)模板核酸；(ii)與核酸模板相連且靠近傳感器的載體；(iii)與載體或傳感器相連的模板核酸；和/或(iv)傳感器的德拜長度(例如，德拜層)內感應核苷酸納入事件。

傳感器芯片可具有組合核酸擴增和核酸測序的能力。在一些實施方式中，該傳感器芯片可包括傳感器陣列，其中，陣列的每個位置包括可在陣列的給定位置俘獲具有目標核酸的載體的一個或多個特征。例如，傳感器芯片可包括磁性陣列，其可以通過磁作用力在多個陣列位置俘獲具有模板核酸的磁性珠和顆粒。在另一個例子中，傳感器芯片可包括電極陣列，其可以在多個陣列位置靜電俘獲具有模板核酸的載體。在另一個例子中，模板核酸可以在陣列位置固定至傳感器的表面或者陣列表面。每個陣列位置還可包括一個或多個電極，其能夠產生電場和/或具有本文其他地方所述的傳感器的功能。與載體相關或者在陣列位置與傳感器/陣列表面固定的模板核酸分子可以在測序之前克隆擴增，例如，在由陣列位置的一個或多個電極所產生的電場的幫助下進行。電場可以使得擴增試劑(例如，引物、核苷酸、聚合酶等)集中/隔離到陣列位置。在擴增之后，克隆擴增的模板核酸可以進行核酸測序反應并如本文其他地方所述進行測序。陣列位置處的電極還可產生電場，其可以使得核酸測序反應試劑(例如，測序引物、核苷酸、聚合酶等)集中/隔離到陣列位置。

在完成擴增/測序反應之后，載體/核酸可以從陣列脫離，任選地對載體和陣列進行分離和清洗，以及載體和/或陣列之后再次用于另一輪擴增和/或測序。可以通過例如去除/反轉用于保持載體固定的磁場和/或電場來完成載體從陣列的脫離。作為補充或替代，也可以使用能夠傳遞足夠的作用力來克服用于保持載體固定的磁作用力和/或靜電作用力的流體流動和/或其他類型的場(例如，外部磁場、外部電能)來使得載體與陣列脫離。當核酸與陣列或傳感器直接相關聯時，在不存在載體的情況下，可以用合適的試劑或能量(例如，酶試劑、化學試劑、熱能等)，來處理陣列或傳感器，以去除結合的核酸。

示例性傳感器芯片如圖30A-30F示意性所示。如圖30A所示，傳感器芯片3000可包括基材3001上的傳感器陣列，所述基材3001可包括傳感器的陣列(例如納米傳感器)的位置3002，其可以與傳感器芯片3000內所限定的微流體通道流體連通。如圖30A所示，基材3001可以構造成基本平坦的基材。陣列的每個傳感器位置3002可以包括磁性元件3010以及電極元件3005和3007。磁性珠的位置可以通過磁性元件3010和/或電極元件3005和3007布置在每個傳感器位置3002。磁性元件3010可以形成局部磁場，以及電極元件3005和3007可以形成局部電場，從而將磁性珠布置在陣列的每個傳感器位置3002。此外，磁場和/或電場可以產生限制區域，其可用于將試劑隔離和/或幾種到陣列的傳感器位置3002。

如圖30B所示，可以將包含模板核酸3040(例如，DNA、DNA片段、RNA、RNA片段)的樣品傳遞到系統3000中。在一些情況下，可以經由與陣列相關的微流體通道來引入模板核酸3040，這可能在本文其他地方所述的微流體裝置和閥的幫助下進行。如圖30B所示，陣列可包括磁性珠3020，其經由磁性元件3010和/或電極元件3005和3007固定到陣列。磁性珠3020可以與能夠與模板核酸3040雜交的引物相關聯，從而使得模板核酸3040被珠3020俘獲并聯接。可以使用其他方法來聯接模板核酸3040，例如，共價鍵、離子相互作用、雙極相互作用、范德華力、疏水性相互作用等。

作為替代，模板核酸3040與磁性珠3020的結合可以獨立于傳感器芯片3000和磁性珠3020進行，然后經由流動提供到傳感器芯片3000。通過磁性元件3010提供的磁場和/或通過點擊3005和/或3007提供的靜電相互作用可以在將磁性珠3020提供到傳感器芯片3000時俘獲它們，從而它們分別固定到傳感器芯片3000的傳感器位置3002。可以通過流動將磁性珠3020提供到傳感器芯片，這可能是在本文其他地方所述的微流體閥和裝置的幫助下進行的。作為替代或補充，引物可以與陣列結合和/或與陣列相關，并用于在陣列表面上或者附近俘獲核酸3040。

如圖30C所示，可以同時、在之前或者在之后，將試劑3060(例如，聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)和額外引物)引入到傳感器芯片3000。在一些情況下，可以經由流動通過與傳感器芯片相關的微流體通道來引入試劑3060，經由流動使得試劑3060與磁性珠3020接觸。可以經由本文其他地方所述的微流體閥和裝置，向傳感器芯片3000提供流動的試劑和/或從傳感器芯片3000去除流動的試劑。經由來自合適陣列元件的磁作用力和/或靜電作用力，當經由流動使得試劑3060與磁性珠3020接觸時，使得磁性珠3020固定在傳感器位置3002。

如圖30D所示，可以用試劑3060和在合適的溫度條件下，對與磁性珠3020相關的模板核酸3040進行克隆擴增，從而在磁性珠3020的表面上產生擴增的核酸3045。可以使用任意合適的擴增方法(包括聚合酶鏈反應(PCR)、引物延伸反應、等溫擴增或者其他技術)來完成克隆擴增。

如圖30E所示，可以在模板核酸3040的擴增之后，對磁性珠3020進行清洗3080，去除未結合的擴增子3055和試劑3060。經清洗的磁性珠3020包括與傳感器位置3002相關的擴增核酸3045的克隆組。可以通過任意合適的方法完成清洗3080，例如，用緩沖溶液進行清洗，其流速足以去除溶液中未結合的擴增子3055和試劑，但是不足以將磁性珠3020從它們在陣列上的相應位置3002沖走。可以經由本文其他地方所述的微流體閥和裝置，向傳感器芯片提供清洗流體。

如圖30F所示，然后可以使得試劑(例如，聚合酶、引物、dPTP等)的等分試樣3070(例如經由流動)與傳感器陣列接觸，從而引物與擴增核酸3045接觸，經由聚合酶的作用使得dPTP結合到磁性珠3020的擴增的核酸3045中。分別具有不同dNTP(例如，A、T、C或G的)試劑的等分試樣3070可以以單獨循環引入(例如，循環1＝A，循環2＝T等)，其中，可以在每次循環之間存在緩沖液的清洗步驟，以幫助減少來自未結合的核苷酸的污染可能性。用于測序反應的聚合酶可以是與用于擴增反應相同類型的聚合酶，或者可以是不同類型的聚合酶，并且可以在引入dNTP之前進入或者與dNTP一起引入。傳感器芯片3000的傳感器可以檢測每次dNTP循環過程中的核苷酸納入事件，將從傳感器獲得的信號用于測序擴增的核酸3045，進而用于測序原始的模板核酸3040。

傳感器可以通過例如電極3005和3007中的一個或兩個，來感應核苷酸納入事件(例如，檢測其指示信號)。在一些情況下，電極3005和3007可以通過如下方式感應核苷酸納入事件：感應磁性珠3020和/或與磁性珠3020相關的擴增核酸(或者其他核酸)3045的局部電阻變化、局部電荷變化和/或局部導電率變化。可以通過例如，直接測量局部電阻變化或者測量指示了局部電阻變化的信號來實現傳感。在一些情況下，傳感器可以在磁性珠3020和/或與磁性珠3020相關的擴增核酸3045的德拜長度(例如，德拜層)內感應電阻。還可以通過直接測量局部電荷變化或者局部電導率變化或者指示它們中的一種或多種的信號，來感應核苷酸納入事件。傳感器可以在磁性珠3020和/或與磁性珠3020相關的擴增核酸3045的德拜長度(例如，德拜層)內感應電荷變化或者導電率變化。

在一些情況下，可以在沒有傳感器芯片3000的情況下完成模板核酸3040的克隆擴增。在此類情況下，可以將包含克隆擴增的核酸3045的磁性珠3020提供到傳感器芯片3000，其中，通過磁性元件3010提供的磁場和或通過電極3005和/或3007提供的電場將磁性珠3020固定在一個或多個傳感器位置3002。然后可以如上文所述，在擴增的核酸3045上完成測序反應和感應核苷酸納入事件。

圖23顯示結合了傳感器芯片2300(例如，上文所述的示例性傳感器芯片3000)的示例性微流體DPM芯片的俯視圖。DPM芯片包括12個流體儲器R1-R12，2個泵P1-P2，和13個閥v1-v13。集成芯片可以使得流體以任意順序從儲器流過傳感器芯片。在(未示出的)一些情況下，DPM芯片可構造成進行混合，核酸擴增(例如PCR)或者任意其他制備用于由感應芯片進行感應的樣品所需的分子生物學操作。

參見圖24，其中相同附圖標記表示相同元件，示例性DPM芯片具有流體層2400、膜層2405和氣動層2410。DPM芯片經由流體界面沉淀2420、界面塊2425和芯片界面襯墊2430整合有傳感器芯片組件2415。如圖25所示是組裝系統的額外視圖，包括縮略圖2500、側視圖2510和底視圖2520，其中，顯示了DPM芯片2530和傳感器芯片組件2540。

控制系統

本文提供了計算機控制系統，其編程或者以任意其他方式配置成執行本文的方法和系統。圖26顯示計算機系統2601，其編程或者以任意其他方式配置調節采用本文提供的微流體裝置和系統的樣品加工和/分析。計算機系統2601可以對樣品加工的各個方面進行調節，例如，熱流動(例如，加熱或冷卻)、流體流動、流體混合、流體分離和反應(例如，核酸擴增)。

計算機系統2601包括中央處理器單元(CPU，本文也稱作“處理器”和“計算機處理器”)2605，其可以是單核或者多核處理器，或者用于并行處理的多個處理器。計算機系統2601還包括存儲器或者存儲位置2610(例如，隨機存取存儲器、只讀存儲器、閃存)，電子存儲單元2615(例如，硬盤)，用于與一個或多個其他系統通訊的交互界面2620(例如，網絡適配器)，以及周邊裝置2625，如緩存、其他存儲器、數據存儲器和/或電子顯示器適配器。存儲器2610、存儲單元2615、界面2620和周邊裝置2625與CPU 2605經由通信總線(實線)(如母板)連通。儲存單元2615可以是用于儲存數據的數據儲存單元(或者數據倉庫)。在通信界面2620的幫助下，計算機系統2601可以與計算機網絡(“網絡”)2630操作連接。網絡2630可以是因特網、互聯網和/或外聯網，或者與因特網連通的互聯網和/或外聯網。在一些情況下，網絡2630是電子通信和/或數據網絡。網絡2630可以包括一個或多個計算機服務器，其能夠進行分布式計算，例如云計算。在一些情況下，在計算機系統2601的幫助下，網絡2630可以執行對等網絡，這可以使得與計算機系統2601連接的裝置作為客戶端或者服務器。

CPU 2604可以執行一系列機器可讀取指令，其可以嵌入到程序或者軟件中。可以將指令儲存在存儲器位置，例如存儲器2610。CPU 2605進行的操作的例子可以包括提取、解碼、執行和回寫。

儲存單元2615可以儲存文件，例如驅動、文庫和保存的程序。儲存單元2615可以儲存用戶產生的程序和記錄的會議，以及與程序相關的輸出。儲存單元2615可以儲存用戶數據，例如，用戶配置和用戶程序。在一些情況下，計算機系統2601可以包括位于計算機系統2601外部(例如位于通過內聯網或因特網與計算機系統2601連通的遠端服務器)上的一個或多個額外數據儲存單元。

計算機系統2601可以經由網絡2630與一個或多個遠端計算機系統連通。例如，計算機系統2601可以與用戶的遠程計算機系統連通。遠程計算機系統的例子包括個人電腦(例如，便攜式PC)、平板或平板式PC(例如，iPad，Galaxy Tab)，電話、智能手機(例如，iPhone，安卓設備，)或者個人數字助理。用戶可以通過網絡2630到達計算機系統2601。

可以通過機器(例如，計算機處理器)可執行代碼來執行本文所述的方法，所述可執行代碼儲存在計算機系統2601的電子儲存位置，例如存儲器2610或者電子存儲單元2615。機器可執行或者機器可讀取代碼可以以軟件的形式提供。在使用過程中，處理器2605可以執行代碼。在一些情況下，可以從存儲單元2615找回代碼，并儲存在存儲器2610上，用于被處理器2605易于觸及。在一些情況下，可以排除電子存儲單元2615，將機器可執行指令存儲在存儲器2610上。

可以用具有適于執行代碼的處理器的機器對代碼進行預編譯和配置，或者可以在運行時期間被編譯。可以以編程語言提供代碼，所述編程語言可以選擇為能夠以預編譯或實時編譯的方式執行代碼。

本文所提供的系統和方法的方面，例如計算機系統2601可以嵌入程序中。技術的各個方面可以被認為是“產品”或者“制造的制品”，其通常是機器(或處理器)可執行代碼和/或相關數據的形式，其承載在或者嵌入機器可讀取介質類型中。機器可執行代碼可以儲存在電子存儲單元中，例如，存儲器(例如，只讀存儲器、隨機存取存儲器、閃存)或者硬盤。“存儲”類型介質可以包括如下任意或者全部：計算機或者處理器等的有形存儲器或其相關模塊，諸如各種半導體存儲器、磁帶驅動器以及磁盤驅動器等，其可以在任意時刻為軟件編程提供非臨時存儲。軟件的全部或部分有時可以通過因特網或各種其它電信網絡傳送。此類傳送可以例如實現將軟件從一臺計算機或者處理器裝載到另一臺計算機或者處理器，例如從管理服務器或主機計算機到應用服務器的計算機平臺。因此，可承載軟件元素的另一類介質包括光波、電波和電磁波，例如通過有線和光纖陸線網絡以及各種空中鏈路用于穿透局部裝置之間的物理界面。承載此類波，例如有線或無線鏈路或者光纖鏈路等的物理元素也可被認為是承載軟件的介質。除非另有說明，否則如本文所述的有形“存儲”介質，諸如計算機或機器“可讀介質”的術語是指參與向處理器提供指令以用于執行的任何介質。

因此，機器可讀介質(例如計算機可執行代碼)可以采取許多形式，包括但不限于有形存儲介質、載波介質或物理傳輸介質。非易失性存儲介質包括例如光盤或磁盤，諸如任何計算機等中的任何存儲設備，諸如可以用于實現附圖中所示的數據庫等。非永久性儲存介質包括動態存儲器，例如，此類計算機平臺的主存儲器。有形過渡介質包括同軸光纜、銅線和光纖件，包括在計算機系統內的母線的線。載波傳輸介質可以采取電信號或電磁信號，或者諸如在射頻(RF)和紅外(IR)數據通信期間產生的聲波或光波的形式。因此，常用形式的計算機可讀取介質包括例如，軟盤、軟碟、硬盤、磁帶、任意其他磁性介質、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任意其他光學介質；穿孔卡紙片、任意其他具有孔圖案的物理儲存介質、RAM、PROM、EPROM、FLASH-EPROM以及任意其他存儲芯片或筒；載波傳輸的數據或指令，光纜或連接件用于從可以讀取編碼和/或數據的計算機傳輸此類載波或者任意其他形式的媒體。許多這些形式的計算機可讀取媒介可用于將一個或多個指令的一個或多個序列運載到處理器進行執行。

實施例

實施例1-反應混合和孵育

圖27顯示反應體積混合的結果。將具有黃色或藍色食用染料的溶液放在井中，如圖16所示(在圖16中，黃色呈現為亮灰色，以及藍色呈現為暗灰色)。2700顯示了單體積混合的一般結果。在該實驗中，對儲器L2和S1中的藍色或黃色食用染料分別進行涂底并引入到P1和P0中，然后如上文所述進行混合。圖27還顯示了6體積混合2705(在[P0-P5]與P6之間往復傳輸6個泵體積)和12體積混合2710(在[P0-P5]+P6與P7之間往復傳輸12個泵體積)的結果。在每種情況下，混合的體積近似是相同顏色，表明良好混合。

RPA(重組酶聚合酶擴增)反應證實了芯片的化學相容性。RPA反應-Mg⁺⁺放入儲器LR2中，以及Mg⁺⁺放入儲器S1中。兩種組分以1:1進行混合，并在芯片中孵育10分鐘。將產物泵送到儲器P并回收。用熒光試驗確定雙鏈DNA含量。結果表明，在芯片中混合且孵育了10分鐘的RPA擴增反應與常規微管中進行的反應水平近似相同(對于微流體反應為368ng/μL，對于微管為434ng/μL)。

實施例2-磁性珠加工和DNA純化

如圖28所示并參見圖14所示的示例性裝置，可以通過位于芯片下方的高強度磁體來俘獲超順磁性珠2800(Seradyne Speedbeads，1μm雙殼超順磁性聚合物珠)。珠俘獲涉及將珠結合反應從左到右依次泵送通過P5到右邊I/O軌道中的廢物儲器，在升高位置中，P5下方具有外磁體。通過在與泵P4或P5相連的氣動控制線中(計算機控制)插入空氣流限流器，促進了有效的珠俘獲。例如，泵P4的限流器減緩了當P4的控制線從真空切換為正壓時，P4的膜從打開轉變為關閉狀態。泵膜速度的這種下降導致通過P5的線性流體速度的下降，降低了P5中的珠上的水力拖曳，允許更多時間來進行珠俘獲。一旦俘獲在P5中，可以以類似的方式來清洗和干燥珠，通過泵送清洗緩沖液(例如，70-90％的EtOH)，以及然后泵送空氣通過P5到廢物。可以通過如下方式從經清洗和干燥的珠洗脫俘獲的核酸：用洗脫緩沖液(例如，TE)填充P5，以及任選地，通過磁體在下方，在P4和P5之間往復泵送，使得俘獲的珠“團”破裂。然后可以在P5中再次俘獲經洗脫的珠，以及可以將(含有核酸的)洗出液泵送到產物輸出儲器(P)或者泵送回到P4進行進一步加工。執行如上所述過程(例如，珠俘獲、清洗、干燥和洗脫)的效率近似為小試規模參照實驗的80％，所述工作臺參照實驗采用初始珠結合λ相DNA和7％的PEG8000，2.5M的NaCl珠結合溶液，Seradyne Speedbeads。

實施例3-溫度控制和熱循環

如本文所述并參見圖14所示的示例性裝置，可以對主處理器的P0-P4區域的頂表面和底表面兩者進行加熱，以提供恒溫(等溫)孵育或者這些泵中組件的反應的熱循環。圖29顯示示例性系統的PCR熱循環溫度曲線，包括由置于芯片膜的流體側上的P2和P3之間的熱電偶監測的內部芯片溫度。顯示底部加熱器設定點、頂部加熱器設定點、底部加熱器熱電偶、頂部加熱器熱電偶和內部芯片熱電偶的軌跡，它們分別顯示相似時間標度上的溫度變化。這些結果顯示60℃至95℃轉變的升溫時間和降溫時間都近似為40秒。系統中的冷卻是被動的，因為芯片的底表面的塊體緊緊夾住較大塊的室溫鋁基底歧管。在40次PCR循環沒有觀察到芯片結構的脫層或變形，證實了COP-TPE粘結在熱循環過程中是穩定的。

雖然本文顯示和描述了本發明的優選實施方式，但本領域技術人員顯然了解這些實施方式僅以舉例方式提供。不旨在將本發明限于說明書內所提供的具體例子。盡管已經參考上述說明書對本發明進行了描述，本文實施方式的描述和闡述并不意味著在構成限制。本領域技術人員在不背離本發明的情況下可以作出多種改變、變化和取代。此外，應理解的是，本文的所有方面不限于本文中其具有各種條件和變量的特定描述、構造或相對比例。應理解，本文所述的本發明實施方式的各種替代形式可用于實施本發明。因此，預期本發明還覆蓋了任意此類替代方式、改進方式、變化形式或者等價形式。這意味著所附的權利要求書限定了本發明的范圍，并且覆蓋了這些權利要求書范圍中的方法和結構及其等價形式。