抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其應用的制作方法

本發(fā)明涉及免疫化學
技術領域：
，尤其涉及一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體、雜交瘤細胞株、以及應用該單克隆抗體檢測H9亞型禽流感病毒特異性抗體的阻斷ELISA試劑盒。
背景技術：
：禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種嚴重危害禽類健康的急性傳染病。該病自1878年意大利雞群首次爆發(fā)以來，世界各地都相繼有各種亞型禽流感病毒引起AI爆發(fā)。其中H9亞型禽流感最早于1966年從美國威斯康辛州的一個火雞養(yǎng)殖場中被分離到，自20世紀90年代開始其傳播越來越廣泛，并在亞洲、中東和北非許多國家形成地方流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來沉重的打擊，也造成無法估量的經(jīng)濟損失。在我國，H9N2亞型AIV從1992年開始在部分省區(qū)局部流行，1998年以來已在全國大部分地區(qū)形成地方流行。H9N2亞型AIV還可以直接感染人，同時還是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等可以感染并致死人的流感病毒的內(nèi)部基因的供體。AI的潛伏期從幾個小時到幾天不等，潛伏期長短與病毒的致病性高低、感染強度、傳播途徑和感染禽種類有關。AI的臨診癥狀也因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況有所感染毒株的毒力和其它環(huán)境因素等不同而表現(xiàn)很不一致，可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對雞群免疫后的效果進行監(jiān)測對禽流感的防控將有積極的意義，同時也要加強對家禽養(yǎng)殖運輸銷售相關從業(yè)人員的禽流感感染監(jiān)測工作。目前，針對病毒檢測的分子診斷方法已經(jīng)建立，本研究室在2013年也建立了病毒檢測的熒光定量PCR法(胡濤,滕巧泱,申偉霞,張月娥,李國新,李雪松,閆麗萍,姜秀云,李澤君,H9N2亞型禽流感病毒熒光定量PCR方法的建立及初步應用.中國動物傳染病學報,2013.21(2):p.7-13.)。ELISA診斷方法具備高敏感性和特異性、檢測方便易行、自動化程度高，而且價格低廉等諸多優(yōu)點，已成為一種常用的檢測方法。針對H9亞型特異抗體的ELISA檢測方法，有報道的是以桿狀病毒表達的HA1分子蛋白為包被抗原建立的間接ELISA方法，該方法若用于不同宿主來源的血清抗體檢測需要不同的二抗試劑才能進行，并且使得結果判定不能統(tǒng)一。阻斷ELISA(blockingeELISA,bELISA)以其特異性更高、不受宿主種類限制的優(yōu)勢在各種病毒疾病診斷和抗體檢測領域得到應用。以A型流感病毒NP(nucleoprotein)單抗為基礎建立的競爭ELISA方法可以檢測不同宿主來源，包括鴨、鵝和野鳥中的流感病毒抗體。目前，還沒有特異性檢測H9亞型AIV特異性抗體的方法，為了更好地掌握H9亞型AIV在雞群和人群中的抗體水平，建立一種可以大規(guī)模、準確、敏感、安全便捷的抗體檢測方法很有必要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決目前沒有特異性針對H9亞型禽流感病毒的抗體檢測方法的技術問題，提供一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體可用于特異、靈敏地檢測H9亞型禽流感病毒。此外，還需要提供一種應用上述單克隆抗體檢測H9亞型禽流感病毒抗體的試劑盒。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn):在本發(fā)明的一個方面，提供了一種一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，其結合H9亞型禽流感病毒的HA蛋白，并具有血凝抑制活性。優(yōu)選的，所述單克隆抗體由保藏號為CCTCCNO.C2015211的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株。優(yōu)選的，該雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCCNO.C2015211。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測H9亞型禽流感病毒抗體的試劑盒，包含上述單克隆抗體。優(yōu)選的，本發(fā)明試劑盒還包含ELISA酶標板、H9亞型禽流感病毒抗原、酶標二抗、顯色液、陽性對照血清、陰性對照血清。優(yōu)選的，所述抗原的最佳包被濃度為10ng/孔；所述待測血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:10；所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗，其最佳稀釋倍數(shù)為1:5000。所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：用純化的H9亞型禽流感病毒抗原包被ELISA酶標板；將待測血清與包被抗原作用后，依次加入上述單克隆抗體、酶標二抗和顯色液；利用酶標儀讀取吸光度值OD450nm,并按公式：抑制率(％)＝(陰性對照的吸光度值-待測血清的吸光度值)/陰性對照的吸光度值×100％，計算待測血清的抑制率，得檢測結果。所述試劑盒檢測結果的判定標準為：抑制率≥25.0％為陽性，17.6％≤抑制率<25.0％為可疑,抑制率＜17.6％為陰性。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述單克隆抗體的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述單克隆抗體在制備診斷禽流感的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，以及應用該單克隆抗體檢測H9亞型禽流感病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，具有良好的特異性和敏感性，適用于大規(guī)模不同宿主血清的抗體檢測篩查和監(jiān)測，在H9亞型禽流感病毒病的診斷及抗體檢測方面具有很好的應用前景。附圖說明下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1單克隆抗體的免疫熒光鑒定結果圖；圖2是本發(fā)明實施例2的bELISA檢測5份H9N2陽性血清以及H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、NDV陽性血清、DHV-1陽性血清、DPV陽性血清的結果圖；圖3是本發(fā)明實施例2的H9N2亞型AIV感染試驗雞后不同時間血清的HI法和bELISA法檢測結果比較圖。本發(fā)明的抗H9亞型禽流感病毒HA蛋白小鼠雜交瘤細胞株S1B1，已于2015年11月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏號為CCTCCNO.C2015211。具體實施方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學軍,舒躍龍的譯.北京：科學出版社，2004)中所述的方法進行。本發(fā)明采用純化的H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)免疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體制備技術，篩選獲得了1株穩(wěn)定分泌抗SH441株單抗的雜交瘤細胞株，該株單抗經(jīng)鑒定針對SH441株HA蛋白、且具有HI中和活性，命名為S1B1。用純化的SH441株滅活病毒包被ELISA板，將待檢血清與包被抗原作用后，然后分別加入了S1B1單抗、抗鼠IgG抗體和顯色液來測定特異性單抗結合量，建立了檢測H9亞型禽流感病毒抗體的阻斷ELISA方法(blockingELISA,bELISA)。經(jīng)篩選確定，抗原最佳包被濃度為10ng/孔，待測血清最佳稀釋倍數(shù)為1:10，單抗腹水最佳稀釋倍數(shù)為1:1000，HRP抗鼠二抗為1:5000。特異性試驗表明，該方法僅與H9N2AIV抗體呈陽性，具有良好的特異性。適用性試驗表明，該方法能夠檢測2003-2010年不同H9N2AIV分離株的陽性血清，具有對H9N2AIV抗體檢測的普遍適用性。與血清抗體檢測的標準方法血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibition,HI)相比,相關性達96.1％，且所建bELISA方法比HI更敏感，更安全，適用于對不同宿主血清的抗體檢測，克服了異源紅細胞對HI抗體檢測的影響，在大規(guī)模不同宿主血清篩查監(jiān)測中具有優(yōu)勢。實施例1H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)SH441株單克隆抗體的制備及鑒定1.材料和方法1.1病毒、細胞與試驗動物H9N2亞型禽流感病毒SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)由本實驗室分離并保存；MDCK細胞、293T細胞和SP2/0細胞為本實驗室保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗技術有限公司；清潔級BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；所用4-5周齡試驗雞由SPF雞胚孵化飼養(yǎng)于負壓隔離器中。pCAGGS-H9-HA重組真核質粒為本實驗室構建并保存。1.2主要材料和試驗用血清DMEM，Opti-MEM培養(yǎng)基購自GBICO公司；8-氮鳥嘌呤、PEG1450、HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、β-丙內(nèi)酯(β-propiolactone，BPL)溶液購自Sigma公司；FITC標記羊抗鼠IgG和HRP標記羊抗鼠IgG購自JacksonImmunoResearch公司；ISA70VG佐劑購自發(fā)國SEPPIC公司。H9N2AIV陽性和陰性血清、其他H9病毒分離株，以及H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)、I型鴨肝炎病毒(typeⅠduckhepatitisvirus，DHV-1)、鴨瘟病毒(duckplaguevirus，DPV)陽性血清均為本實驗室保存。1.3SH441株抗原的制備將種毒SH441以104TCID50的劑量感染SPF雞胚，72h收集含有病毒的尿囊液，0.05％BPL在4度滅活12h，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化病毒，測定蛋白濃度，分裝于-70℃保存，用作免疫抗原和包被抗原。1.4SH441株單克隆抗體的制備及其鑒定1.4.1小鼠免疫用純化的SH441株抗原加入等量弗氏完全佐劑乳化后，經(jīng)腹部和背部皮下注射6-8周齡雌性BALB/c小鼠，每只50μg；用純化的SH441株抗原加入等量弗氏不完全佐劑乳化后，每隔兩周分別進行第二次和第三次免疫，劑量與首免相同；三免兩周后進行加強免疫，靜脈注射25μg純化抗原后第三天開始細胞融合。1.4.2陽性雜交瘤細胞株的建立按常規(guī)方法制備小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)層細胞，脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)按10:1的比例在融合劑PEG1450作用下融合，按有限稀釋法進行克隆，經(jīng)間接ELISA和HI法篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞。結果：利用淋巴細胞雜交瘤技術，通過間接ELISA和HI法檢測雜交瘤細胞上清，共獲得一株能夠穩(wěn)定分泌抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并將該細胞株命名為抗H9亞型禽流感病毒HA蛋白小鼠雜交瘤細胞株S1B1，該雜交瘤細胞株已于2015年11月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏號為CCTCCNO.C2015211。1.4.3單克隆抗體腹水的制備將0.5mL滅菌的石蠟油注射小鼠腹腔，一周后再注入106個雜交瘤細胞，7-10天后，小鼠腹部的腹水極度膨脹時抽取腹水，分裝備用。1.4.4單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(IFA)將MDCK細胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，待細胞長成單層后，用SH441株感染MDCK細胞，同時設陰性對照孔。感染24h后，棄上清，細胞用4％的多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌三次，加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時，PBST洗滌三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37℃孵育1小時，PBST洗滌三次，最后在熒光下顯微鏡下觀察，凡有綠色熒光者判為陽性；無熒光者判為陰性。結果：用SH441感染MDCK細胞，用S1B1單抗進行間接免疫熒光試驗，設未感染MDCK細胞為空白對照。呈現(xiàn)特異綠色熒光信號的為陽性，無綠色熒光信號的為陰性。試驗結果顯示：S1B1單抗可產(chǎn)生特異性的綠色熒光(見圖1)，圖1中，A為S1B1單抗，B為空白對照。1.4.5抗H9N2AIV(SH441株)HA蛋白單克隆抗體的鑒定將293T培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，待細胞長成單層后，將重組真核表達質粒pCAGGS-H9-HA轉染293T細胞，同時設陰性對照孔。轉染24h后，棄上清，細胞用4％的多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌一次，加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時，PBST洗滌三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37℃孵育1小時，PBST洗滌三次，最后在熒光顯微鏡下觀察，凡有特異的綠色熒光者判為陽性；無熒光者判為陰性。結果：經(jīng)pCAGGS-H9-HA真核質粒轉染的293T細胞的IFA檢測，對照轉染空pCAGGs質粒的293T細胞沒有特異的熒光，S1B1單抗出現(xiàn)特異的綠色熒光，結果見圖1C&D，進而確認S1B1單抗為抗H9N2AIVHA蛋白的單抗。圖1中，C為pCAGGS-HA轉染的293T細胞，D為pCAGGs轉染的293T細胞。實施例2H9N2AIV抗體阻斷ELISA方法(blockingELISA,bELISA)的建立1.H9N2AIV抗體阻斷ELISA操作方法⑴用PH9.6的碳酸鹽緩沖液包被純化的SH441株滅活病毒抗原，每孔100ng/孔,4℃過夜。次日取出后，用0.05％Tween-20PBS(PBST)洗滌三次，每次3min；⑵用5％脫脂乳的PBS封閉酶標板，37℃2h，洗滌3次，方法同上；⑶加入抗體稀釋液稀釋10倍的待測血清、陰性和陽性對照，每孔100μL37℃孵育1小時，洗滌方法同上；⑷每孔100μLS1B1單克隆抗體腹水(1000×)，37℃孵育1小時，洗滌3次；⑸每孔加入抗體稀釋液稀釋到的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標記的羊抗鼠二抗(5000×)100微升，37℃1小時，洗滌3次；⑹每孔加入TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)底物顯色液100微升，室溫避光顯色10分鐘；⑺每孔加入2MH2SO450uL終止反應，酶標儀讀取吸光度值OD450nm,計算抑制率，抑制率(％)＝(陰性對照的吸光度值-待測樣本的吸光度值)/陰性對照的吸光度值×100％。2.臨界值的確定對58份鴨陰性血清和58份雞陰性血清進行bELISA檢測，對所得的檢測結果進行統(tǒng)計學分析，計算陰性樣本的平均抑制率和標準偏差(SD)。根據(jù)公式：臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+2或3×標準偏差(SD)，分別計算其臨界值。結果：利用bELISA方法共檢測116份陰性血清的平均抑制率為2.8％，標準偏差為7.4％。根據(jù)公式：陽性臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+3×標準偏差，陽性樣品臨界值為25.0％，即當樣品的抑制率(Percentinhibitionvalue,PIvalue)≥25.0％時，該血清為陽性；陰性臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+2×標準偏差，陰性樣品臨界值為17.6％，即當樣品的抑制率PI＜17.6％時，該血清為陰性；當17.6≤PI＜25.0％時，該血清為可疑，需重復檢測一次，若仍低于25.0％，則判定為陰性，否則判為陽性。3.適用性和特異性試驗用建立的B-ELISA方法分別檢測H9N2亞型AIV2003-2010年的26個分離株免疫雞血清，這些分離株的HA序列顯示具有不同的進化分支，來確定該bELISA方法的適用性。用本發(fā)明試劑盒來檢測H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、NDV陽性血清、DHV-1陽性血清、DPV陽性血清，驗證本發(fā)明試劑盒對其它病毒的陽性血清的交叉反應性，來確定該bELISA方法的特異性。結果顯示：bELISA檢測后，只有H9N2亞型AIV陽性血清呈陽性，PI在77.9％-85.3％，所有樣品用HI法進行平行檢測，結果見表1；其他病毒血清均為陰性(見圖2)。說明該方法適用于不同進化分支的H9亞型禽流感病毒特異抗體的檢測，且不與其他亞型流感病毒及禽常見的其他病毒性疾病具有交叉反應，特異性良好。表126株H9亞型禽流感病毒血清的HI法和bELISA法檢測結果4.敏感性和相關性試驗用SH441株病毒靜脈感染4周齡負壓隔離飼養(yǎng)的SPF雞后，不同時間(0h，12h，24h，48h，72h，96h)采集動物血清，分別用建立的bELISA方法和血清抗體檢測的標準方法血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibition,HI)進行檢測，以比較兩者的敏感性和相關性。結果：見圖3，0h-24h兩種方法均顯示血清抗體為陰性，48h后兩種方法均顯示抗體水平為陽性，兩者的相關系數(shù)為96.1％。5.重復性試驗⑴批內(nèi)重復試驗：用同一批次包被的酶標板檢測不同的樣本，一份陽性樣本，一份陰性樣本，每份樣本重復6孔，進行bELISA檢測，計算出同一樣本PI值的變異系數(shù)，以檢驗批內(nèi)檢測樣品的重復性；⑵批間重復性試驗：用不同批次包被的酶標板6塊重復檢測1份陽性樣本和1份陰性樣本，進行bELISA檢測，計算同一份樣本PI值的變異系數(shù)，以檢驗批間檢測樣本的重復性。結果：對同一批次和不同批次的bELISA進行批內(nèi)和批間重復試驗，其PI值經(jīng)統(tǒng)計學分析，變異系數(shù)均小于10％，說明本發(fā)明試劑盒重復性良好(見表2和表3)。表2批內(nèi)重復性試驗實施例3檢測H9亞型禽流感病毒特異性抗體的阻斷ELISA(B-ELISA)試劑盒的組成和應用1、試劑盒的組成按表4所列的試劑盒內(nèi)容，裝配成試劑盒，組裝后置于相應條件保存。表4H9亞型禽流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒內(nèi)容編號內(nèi)容數(shù)量備注1待包被可拆卸酶標板1塊8×12規(guī)格，4℃保存2包被抗原一管100μL/管，-20℃保存3包被緩沖液(1×)一瓶10mL/瓶，4℃保存4封閉液一瓶20mL/瓶，4℃保存5陽性對照血清1管50μL/管，-20℃保存6陰性對照血清1管50μL/管，-20℃保存7單克隆抗體1管100μL/管，-20℃保存8HRP-抗鼠IgG(5000×)1管5微升/管，-20℃保存9抗體稀釋液(1×)1瓶10mL/管，4℃保存10TMB顯色液1瓶10mL/瓶，4℃保存11終止液1瓶10mL/瓶，4℃保存12PBS-T洗滌液(10×)1瓶50mL/瓶，4℃保存13試劑盒說明書1份2、本發(fā)明試劑盒的使用方法：1)使用步驟A包被：于檢測前一天用包被抗原包被待包被可拆卸酶標板，即將上述試劑的包被抗原置于包被液中混勻，每孔100微升，4℃過夜，次日取出后，用1×PBS-T洗滌液三次，每次3min；B封閉：封閉液200微升/孔，37℃1h，1×洗滌液洗滌3次，每次3min；C將待測血清、陰性及陽性對照血清用抗體稀釋液稀釋10倍備用，每孔100微升加入酶標板中，37℃孵育1小時。1×洗滌液洗滌3次，每次3min，方法同上；D將單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋20×，每孔100μL單抗，37℃孵育1h，洗滌3次；E每孔加入用抗體稀釋液稀釋到1×的HRP-抗鼠IgG100μL，37℃1h，洗滌3次；F每孔加入TMB底物顯色液100μL，室溫避光顯色10min；G每孔加入終止液50uL，酶標儀讀取吸光度值OD450nm,計算抑制率，抑制率(％)＝(陰性對照的吸光度值-待測血清的吸光度值)/陰性對照的吸光度值×100％。2)檢測結果的判定及分析當陽性血清的抑制率大于50％，表明實驗結果可信，根據(jù)以下標準判定：當血清樣本的抑制率值大于等于25.0％時，該樣本判定為H9亞型禽流感病毒抗體陽性；當血清樣本的抑制率值小于17.6％時，該樣本判定為H9亞型禽流感病毒抗體陰性；當血清樣本的抑制率值介于二者之間時，判定可疑，重新檢測可疑樣本，若抑制率仍低于25.0％，則判定為陰性，否則判為陽性。3、本發(fā)明試劑盒的應用用建立的bELISA方法測定鴨和雞免疫H9N2滅活疫苗之后的免疫抗體產(chǎn)生情況，鴨和雞各22只，檢測了免疫后1w，2w，3w，5w，7w，9w，11w，13w，15w，17w，19w，21w，23w，25w和27w的共計660份血清樣品，同時用HI試驗平行檢測上述樣本。結果顯示，本發(fā)明bELISA檢測試劑盒可以更快速便捷地檢測大量不同宿主來源的血清樣品，與HI試驗相比，不需要使用活病毒，不受異源紅細胞影響檢測結果，且可以減少檢測血清的用量。對于免疫后不同時間點的330份鴨血清和330份雞血清進行檢測，檢測結果顯示bELISA與HI實驗的符合率達100％(見表5)。表5H9N2滅活疫苗免疫后鴨和雞血清的抗體檢測結果以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁1 2 3