定量檢測前白蛋白的免疫層析方法、試紙條的制備和應用與流程

本發明屬于醫學免疫體外診斷技術領域，具體涉及一種定量檢測前白蛋白的免疫層析方法、試紙條的制備和應用。

背景技術：

前白蛋白是由肝細胞合成的一種血清蛋白，電泳時遷移在白蛋白之前，故名前白蛋白。前白蛋白是由4個相同的亞基組成的四聚體，分子量約為54980，消光系數(E280nm)13.6，其半衰期很短，約1.9天，前白蛋白參與血清中甲狀腺素和視黃醇的運輸，并具有胸腺激素活性，可通過促進淋巴細胞的成熟來增加機體免疫力。

血液中前白蛋白是一種負急性時相反應蛋白，出現炎癥和惡性疾病時其濃度水平下降。前白蛋白的半衰期很短，對于了解蛋白質營養不良和肝功能障礙有重要作用，其在血液中的濃度減低的幅度與肝實質損害的程度密切相關，臨床上常見于肝功能損傷、肝硬化、外傷及感染患者。前白蛋白作為一個敏感指標，可以作為觀測肝功能受損及營養缺乏的早期診斷指標。

前白蛋白的檢測方法有很多，過去常用的檢測方法是免疫透射比濁發、免疫擴散法、免疫電泳法、放射免疫分析法、散射比濁法、ELISA法等。這些方法大多較費時，且樣品需要預處理，需要特殊的設備，而且還存在精密度和準確度差等缺點，均不適用于臨床的現場快速檢測。

因此，為了提高前白蛋白的臨床診斷效率及提高診斷的精密度和準確度，亟需研究開發新的診斷方法和產品。

技術實現要素：

本發明的目的是為了縮短檢測時間，提高前白蛋白的臨床診斷效 率及提高診斷的精密度和準確度，而提供一種定量檢測前白蛋白的免疫層析方法、試紙條的制備和應用。

為實現上述目的，本發明提供下述技術方案。

本發明提供的技術方案之一是：一種定量檢測前白蛋白的試紙條，其由底板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙構成，所述樣品墊、所述結合墊、所述硝酸纖維素膜和所述吸水紙依次搭接地粘貼在所述底板上且分別部分重合，在所述硝酸纖維素膜上分布有檢測線和質控線，所述檢測線靠近結合墊端，所述質控線靠近吸水紙端，所述結合墊上包被有2.0～5.0μL/cm的熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I，所述檢測線上包被有0.5～1.25μL/cm抗前白蛋白抗體II，所述質控線上包被有0.5～1.25μL/cm驢抗鼠抗體，其中，所述抗前白蛋白抗體I與所述抗前白蛋白抗體II具有不同的抗原結合位點。

本發明中，所述的熒光微球較佳地是直徑為0.1～10μm的用聚合材料或二氧化硅包裹熒光物質制得的微球，其表面連接有活性基團或與鏈霉親和素偶聯；所述熒光物質為有機或無機的熒光物質或多種熒光物質的摻雜物以及量子點。

所述底板的材料較佳地為PVC塑料膠板。

所述樣品墊的材料較佳地為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜。

所述結合墊的材料較佳地為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜。

如本領域常規，本發明所述的試紙條還包括卡座，即將所述試紙條安裝于卡座上后再使用，一般安裝于卡座上后，樣品墊上方會形成一個便于操作的加樣孔。

本發明提供的技術方案之二是：前述定量檢測前白蛋白的試紙條的制備方法，其包括如下步驟：

(1)硝酸纖維素膜的制備：將抗前白蛋白抗體II和驢抗鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，包被的量均為0.5～1.25μL/cm，干燥后備用；

(2)結合墊的制備：以EDC為偶聯劑，將熒光微球標記在抗前白蛋白抗體I上，將標記有熒光微球的抗前白蛋白抗體I以2.0～5.0μL/cm的噴量噴涂至結合墊上，干燥后備用；

(3)試紙條的組裝：將樣品墊、結合墊、包被有抗前白蛋白抗體II作為質控線的硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接地粘貼在粘性底板上且分別部分重合，即得。

本發明中，步驟(1)為硝酸纖維素膜的制備。

其中，優選地，所述的抗前白蛋白抗體II和驢抗鼠抗體在包被前用抗體保護劑調節濃度。所述的抗體保護劑為本領域常規所述，如在PB緩沖溶液中加入適量的蔗糖、疊氮鈉或BSA等均可以作為適用于本發明的抗體保護劑。所述的抗體保護劑的pH值優選7.2～7.4。所述調節濃度優選將抗前白蛋白抗體II的濃度調節至0.3～1.2mg/mL(最優選0.6mg/mL)，將驢抗鼠抗體的濃度調節至0.5～1.5mg/mL(最優選1.0mg/mL)。

所述檢測線和所述質控線間的距離為本領域常規，一般檢測試紙條的檢測線和質控線之間的距離均適用于本發明，本發明優選所述檢測線和所述質控線間的距離為5～8mm。

所述包被的量優選均為1.0μL/cm。

所述干燥優選環境的濕度低于40％。

本發明中，步驟(2)為結合墊的制備。較佳地，步驟(2)為將熒光微球加入MES緩沖溶液，再加入EDC溶液混勻，然后加入用MES緩沖溶液稀釋的抗前白蛋白抗體I，混勻后室溫攪拌反應1～3h，加入BSA封閉1～2h，離心棄上清，沉淀用MES緩沖溶液復溶至起始體積，將制備好的熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I噴涂至結合墊上，干燥后備用。

其中，所述結合墊優選經過緩沖液、表面活性劑、穩定劑、非離子表面活性劑和防腐劑中的一種或多種處理后再使用；所述緩沖液更 優選磷酸鹽緩沖液；所述表面活性劑更優選聚乙烯吡咯烷酮或TWEEN-20；所述穩定劑更優選蔗糖或牛血清白蛋白；所述非離子表面活性劑更優選聚乙二醇對異辛基苯基醚；所述防腐劑更優選疊氮化鈉。

所述MES緩沖溶液為本領域常規所述，MES是4-Morpholine Ethane Sulfonic Acid的簡稱，即2(N-嗎啉)乙磺酸，所述EMS緩沖溶液的pH值優選為5.0～7.0，更優選為5.5。

所述EDC溶液為本領域常規所述，EDC是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的英文字母簡稱，所述EDC溶液的濃度沒有特殊要求，常規的濃度均適用。

步驟(2)中還可以EDC/NHS(Hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-s ulfonicacid sodium salt，N-羥基硫代琥珀酰亞胺)作為偶聯劑；即，在熒光微球中加入EDC和NHS混勻，活化羧基官能團，離心后再加入抗前白蛋白抗體I進行偶聯。以此方法偶聯能夠使不同批次生產的試紙條產品的質量更穩定，數據指標均一性更優良。

所述抗前白蛋白抗體I在加入體系前優選用MES緩沖溶液稀釋至0.3～0.8mg/mL，更優選稀釋至0.5mg/mL。

所述抗前白蛋白抗體I的加入量優選為每mg熒光微球中加入20～80μg(更優選25～50μg)抗體。

所述噴量優選3μL/cm。

所述干燥優選環境的濕度低于40％。

所述制備方法較佳地還包括步驟(4)：將試紙條切成寬度為3.5～4.5mm的條狀。

所述制備方法更佳地還包括步驟(5)：將步驟(4)制得的長方形的試紙條裝入卡座，所述卡座起固定試紙條的作用，同時使樣品墊上方形成一個易于操作的加樣孔。

本發明的一較佳實例包括如下步驟：

(1)硝酸纖維素膜的制備：

用0.01M pH 7.2～7.4的抗體保護劑調節抗前白蛋白抗體II的濃度為0.6mg/mL、驢抗鼠抗體的濃度為1.0mg/mL，使用Bio-Dot XYZ3050型三維噴點平臺(Bio-Dot，美國)將抗前白蛋白抗體II及驢抗鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質控線，兩線相隔5mm，噴膜量均為1.0μL/cm，37℃條件下真空干燥2h，室溫干燥的環境下保存備用；

(2)結合墊的制備：

以3mL體系計，取15μL10mg/mL的熒光微球加入3mL 0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液，再加入3.75μL 4.0mg/mL EDC溶液，振蕩混勻后，加入9～30μL 0.5mg/mL的用MES緩沖溶液稀釋的抗前白蛋白抗體I，充分混勻后，室溫攪拌反應2h，加入占反應體系體積1/10的濃度為10％的BSA封閉1h，在4℃條件下11000r/min離心20min，棄上清，沉淀用3mL 0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液復溶，4℃條件下11000r/min離心20min，最后棄上清，沉淀用0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液復溶至起始體積，將制備好的熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I用Bio-Dot XYZ3050型三維噴點平臺噴涂至結合墊上，噴量為3μL/cm，37℃條件下真空干燥2h，室溫干燥的環境下保存備用；

(3)試紙條的組裝

將樣品墊、結合墊、包被有抗前白蛋白抗體II作為檢測線與驢抗鼠抗體作為質控線的硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接地粘貼在粘性底板上且分別部分重合；

(4)將試紙條用切條機切成寬度為4.0mm的條狀。

本發明提供的技術方案之三是：包含前述定量檢測前白蛋白的試紙條的試劑盒。

本發明提供的技術方案之四是：利用前述試紙條定量檢測前白蛋 白的方法，其包括如下步驟：

(1)在試紙條的樣品墊上加入含有不同已知濃度的前白蛋白標準物的溶液，反應10～20min后，將試紙條置于激發光源下，測定檢測線和質控線上條帶的熒光強度，根據檢測線的熒光強度與質控線的熒光強度的比值繪制反映前白蛋白含量的標準曲線；

(2)在試紙條的樣品墊上加入待測物溶液，反應10～20min后，將試紙條置于激發光源下，測定檢測線和質控線上條帶的熒光強度，將檢測線的熒光強度與質控線的熒光強度的比值對照步驟(1)得到的標準曲線，讀取待測物溶液中前白蛋白的含量。

本發明中，所述的激發光源的波長較佳地為470nm。

步驟(1)中所述反應的時間較佳地為15min。

步驟(2)中所述反應的時間較佳地為15min。

本發明的檢測原理為：

按照檢測步驟把樣本溶液加入到試紙條的樣品墊上，當檢測樣本中不含前白蛋白抗原時，熒光微球-抗體復合物只會被硝酸纖維素膜質控線上的驢抗鼠抗體捕獲，在激發光源的激發作用下只有質控線出現熒光條帶；當檢測樣本中含有前白蛋白抗原時，熒光微球-抗體復合物就會和檢測樣本中的抗原結合形成熒光微球-抗體-抗原復合物，這種熒光微球-抗體-抗原復合物被硝酸纖維素膜檢測線上的抗前白蛋白抗體捕獲，未結合的熒光微球-抗體復合物在毛細作用下繼續向吸水紙方向移動，被質控線上包被的驢抗鼠抗體捕獲，在激發光源的激發作用下檢測線和質控線均出現熒光條帶；在一定范圍內，隨檢測樣本中前白蛋白抗原的濃度增加，硝酸纖維素膜上檢測線的熒光亮度越強。

本發明提供的技術方案之五是：前述試紙條或試劑盒在定量檢測前白蛋白中的應用。

在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即 得本發明各較佳實例。

本發明所用試劑和原料均市售可得。

本發明的積極進步效果在于：

相比傳統的前白蛋白檢測方法，本發明的試紙條和檢測方法有極大優勢：

(1)靈敏度高，其靈敏度是用傳統的染料和有色標記物質檢測方法的10～1000倍，能達到pg/mL，可以與氣質聯用和HPLC等精密檢測方法相媲美，使用雙抗夾心提高了捕獲效率，增強了靈敏度；

(2)微球表面攜帶活性化學基團，抗體標記使用的是化學偶聯方法，形成的熒光微球-抗體復合物能穩固結合，標記穩定性好、非特異性低；

(3)操作方便耗時短，檢測線性范圍寬，本發明試紙條的線性檢測范圍可達5-100ng/mL，只需10～20min就能得到檢測結果，而商業化的前白蛋白ELISA試劑盒的檢測范圍是6.25～200μg/mL，其檢測時間需要大約90min。

附圖說明

圖1為實施例1中熒光微球免疫層析試紙條的結構示意圖，其中，1為樣品墊、2為結合墊、3為硝酸纖維素膜、4為檢測線、5為質控線、6為吸水紙、7指包括底板的試紙條。

圖2為實施例1中卡座的實拍圖。

圖3為實施例2中反映前白蛋白含量的標準曲線，其中，縱坐標為檢測線和質控線上條帶的熒光強度的比值，橫坐標為前白蛋白的濃度。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但并不用來限制本發明的范圍。除特殊說明的之外，各實施例中所用的設備和試劑均常規市售可得。

實施例1定量檢測樣本中前白蛋白熒光微球免疫層析試紙條的制備

本實施例中，底板材料為PVC塑料膠板，材料購自余姚市富誠塑化有限公司；樣品墊材料為玻璃纖維膜，材料購自上海金標生物科技有限公司；結合墊的材料為玻璃纖維膜，材料購自上海金標生物科技有限公司。

1、硝酸纖維素膜的制備

①篩選合適的抗前白蛋白抗體及驢抗鼠抗體；

②硝酸纖維素膜上檢測線和質控線的制備；

用0.01M pH 7.2～7.4的PB緩沖液(加入3％蔗糖)調節抗前白蛋白抗體II的濃度為0.6mg/mL、驢抗鼠抗體的濃度為1.0mg/mL，使用Bio-Dot XYZ3050型三維噴點平臺(美國Bio-Dot公司產品)將抗前白蛋白抗體II及驢抗鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，兩線相隔5mm，噴膜量均為1.0μL/cm，37℃條件下真空干燥2h，室溫干燥的環境下保存備用，所述干燥的環境濕度低于40％。

2、熒光微球結合墊的制備

①熒光微球標記抗前白蛋白抗體的制備；

以3mL體系計，取15μL 10mg/mL的熒光微球(直徑為175nm的用聚合材料包裹熒光物質的微球，其表面連接有-COOH)加入3mL 0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液，再加入15μL 1.0mg/mL EDC溶液，振蕩混勻后，加入20μL 0.5mg/mL的抗前白蛋白抗體I(抗體用MES緩沖溶液稀釋)，充分混勻后，室溫攪拌反應2h，加入1/10體積10％的BSA封閉1h，在4℃條件下11000r/min離心20min，棄上清，沉淀用3mL的0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液復溶，用上述的離心條件再次離心，最后棄上清，沉淀用0.05M pH 5.5的MES緩沖溶液復溶至起始體積。

②熒光微球結合墊的制備；

將制備好的熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I用Bio-Dot XYZ3050型三維噴點平臺噴涂至結合墊上，噴涂量為3μL/cm，37℃ 條件下真空干燥2h，室溫干燥的環境下保存備用。

3、試紙條的組裝

熒光微球免疫層析試紙條的組裝，即在粘性底板上依次搭接地粘貼樣品墊、熒光微球結合墊、包被有抗前白蛋白抗體II作為檢測線與驢抗鼠抗體作為質控線的硝酸纖維素膜和吸水紙且各部分呈分別部分重合(如圖1所示)。圖1中，結合墊上噴涂有熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I，檢測線上包被有與所述熒光微球標記的抗前白蛋白抗體I具有不同抗原結合位點的抗前白蛋白抗體II，質控線上包被有驢抗鼠抗體。

4、將試紙條用切條機切成50mm×4.0mm的長方形，再裝在塑料卡座上(如圖2所示)，即組裝成熒光微球免疫層析試紙條，裝入卡座后，樣品墊上方形成一個方便加樣的加樣孔。將免疫層析試紙條裝入鋁箔袋，加入干燥劑后，封口保存，于室溫干燥的環境下至少可保存一年。

實施例2樣本中前白蛋白的定量檢測

使用實施例1制備的試紙條對樣本中的前白蛋白進行檢測，其步驟包括：

(1)在試紙條的加樣孔中加入含有不同已知濃度(具體為0、2.5、5.0、12.5、25.0、37.5、75.0、100、200ug/L)的前白蛋白標準物的溶液，反應15min后，將試紙條置于470nm波長激發光源下，測定檢測線和質控線上條帶的熒光強度，以檢測線和質控線上條帶的熒光強度的比值為縱坐標，前白蛋白的濃度為橫坐標繪制標準曲線(如圖3所示)。結果顯示，本發明在前白蛋白濃度為5.0～100.0μg/L范圍內有很好的線性相關(R²＝0.998)，其檢測靈敏度為2.5μg/L。

(2)在試紙條的加樣孔中加入待測物溶液，反應15min后，將試紙條置于470nm波長激發光源下，測定檢測線和質控線上條帶的熒光強度，將檢測線的熒光強度與質控線的熒光強度的比值對照步驟(1) 得到的標準曲線，讀取待測物溶液中的前白蛋白的含量。

實施例3樣本中前白蛋白的定量檢測

取實施例1制備的試紙條，打開鋁箔袋取出試紙條，平放于桌面，取10μL血樣于裝有2mL 0.01M pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液的試劑瓶中，充分混勻后取100μL加入試紙條的加樣孔中，反應15min后將試紙條置于激發光源下，測定檢測線和質控線上條帶的熒光強度，將檢測線的熒光強度與質控線的熒光強度的比值對照實施例2中的標準曲線，即可得出檢測血液樣本中前白蛋白的含量。

雖然，上文中已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明的基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。