菁染料在檢測凝血酶中的用途、凝血酶檢測試劑盒及方法與流程

本發明涉及檢測領域，具體的，本發明涉及菁染料在檢測凝血酶中的用途、凝血酶檢測試劑盒及方法，更具體的，本發明涉及菁染料和核酸適配體的組合在檢測凝血酶中的用途、一種用于檢測凝血酶的試劑盒和一種檢測樣本中凝血酶的方法。

背景技術：

凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，也是血液凝血級聯反應中的主要效應蛋白酶，顯現出促凝和抗凝的特性。凝血酶是由在凝血酶原復合物中的非活性凝血酶原在Xa因子(FXa)因子的作用下通過蛋白裂解的方式產生。

臨床研究發現，心肌梗死、腦卒中等血栓病人體內凝血酶明顯高于正常水平，日常監測凝血酶濃度可預防此類疾病；腎病、惡性腫瘤、糖尿病患者血漿凝血酶含量明顯高于正常人，凝血酶濃度的檢測對此類疾病的預防、確診、治療有指導意義；血友病等出血性疾病，患者體內的凝血酶濃度明顯低于正常水平，凝血酶濃度的檢測對制定治療方案有直接的指導作用。

然而，檢測凝血酶的方法仍有待進一步開發。

技術實現要素：

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明提出了一種更加靈敏的檢測凝血酶的方法。

在本發明的第一方面，本發明提出了菁染料和核酸適配體的組合在檢測凝血酶中的用途。根據本發明的實施例，菁染料和核酸適配體的組合能夠更加靈敏地檢測凝血酶，根據本發明的實施例，通過采用菁染料和核酸適配體的組合，對凝血酶的檢測限達到了0.5pmol/L，而現有方法檢測凝血酶的濃度通常為nM級別。

根據本發明的實施例，上述菁染料和核酸適配體的組合在檢測凝血酶中的用途還可以進一步包括下列附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述檢測通過圓二色譜法、紫外光譜法、熒光光譜法的至少之一進行的。根據本發明的實施例，凝血酶能夠誘導核酸適配體形成G-四鏈體結構，G-四鏈體進一步誘導菁染料形成J-聚集體，產生J-聚集體信號，因此，通過圓二色譜法、紫外 光譜法或熒光光譜法檢測J-聚集體信號，從而能夠以更高地靈敏性和專屬性檢測出樣本中的凝血酶。

根據本發發明的實施例，所述圓二色譜法的波長范圍是200nm～700nm。發明人通過大量的研究實驗發現，當采用述圓二色譜法檢測凝血酶誘導產生的菁染料J-聚集體信號時，采用200nm～700nm的波長，可以以更高的靈敏性和專屬性檢測出樣本中的凝血酶。

根據本發明的實施例，所述菁染料為式I所示的化合物，

其中：R₁為C_1～6烷基、任選被烷基取代的苯基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₂、R₃、R₄和R₅分別獨立地選自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成5元至7元的環結構，或者R₄和R₅與它們所連接的碳原子一起形成5元至7元的環結構，任選地，所述C₁-C₆的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₆和R₇分別獨立地為任選被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；Y為反離子，所述反離子是基于R₆和R₇所帶電荷而選擇的，當R₆和R₇為烷基時，Y為鹵素陰離子；當R₆和R₇之一攜帶磺酸根，不含Y；當R₆和R₇均攜帶磺酸根時，Y為三乙胺陽離子；以及X₁和X₂分別獨立地選自C、O、S、Se或Te。任選地，所述R₁選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；所述5元至7元環結構為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環結構；所述Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。根據本發明的實施例，上述菁染料和核酸適配體的組合可更有效用于檢測凝血酶，對凝血酶的檢測更具有專屬性，對凝血酶的檢測靈敏度進一步提高。

根據本發明的實施例，所述菁染料為選自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根據本發明的實施例，式II、式III所示化合物的菁染料和核酸適配體的組合可更有效用于檢測凝血酶，對凝血酶的檢測更具有專屬性，對凝血酶的檢測靈敏度也進一步提高。

根據本發明的實施例，所述菁染料與所述核酸適配體的摩爾比是1:(0.05～0.1)。發明人通過大量的研究實驗發現，當菁染料與核酸適配體的摩爾比為1:(0.05～0.1)，菁染料與核酸適配體組合實現對樣本中凝血酶的更高專屬性和更高靈敏度檢測。

根據本發明的實施例，所述核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID NO：1)。

根據本發明的實施例，凝血酶能夠誘導核酸適配體形成G-四鏈體結構，G-四鏈體進一步誘導菁染料形成J-聚集體，產生J-聚集體信號，進而通過檢測J-聚集體信號可更高靈敏度和更高專屬性地檢測樣本中的凝血酶。

在本發明的第二方面，本發明提出了一種用于檢測凝血酶的試劑盒，其特征在于，包括：菁染料；以及核酸適配體。根據本發明的實施例，所述試劑盒能夠用于凝血酶的檢測，檢測靈敏度高、專屬性強。

根據本發明的實施例，上述試劑盒還可以進一步包括下列附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述菁染料為式I所示的化合物，

其中：R₁為C_1～6烷基、任選被烷基取代的苯基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₂、R₃、R₄和R₅分別獨立地選自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成5元至7元的環結構，或者R₄和R₅與它們所連接的碳原子一起形成5元至7元的環結構，任選地，所述C₁-C₆的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₆和R₇分別獨立地為任選被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；Y為反離子，所述反離子是基于R₆和R₇所帶電荷而選擇的，當R₆和R₇為烷基時，Y為鹵素陰離子；當R₆和R₇之一攜帶磺酸根，不含Y；當R₆和R₇均攜帶磺酸根時，Y為三乙胺陽離子；以及X₁和X₂分別獨立地選自C、O、S、Se或Te。任選地，所述R₁選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；所述5元至7元環結構為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環結構；所述Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。根據本發明的實施例，包括具有上述結構的菁染料以及核酸適配體的試劑盒，更有效能夠用于凝血酶的檢測，檢測靈敏度進一步提高、專屬性進一步增強。

根據本發明的實施例，所述菁染料為選自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根據本發明的實施例，所述試劑盒中的菁染料為式II或式III所示化合物，所述試劑盒可更有效用于凝血酶的檢測，檢測靈敏度更高、專屬性進一步增強。

根據本發明的實施例，所述試劑盒進一步包括緩沖液，所述緩沖液含有鉀離子，并且所述緩沖液的pH值為5.0～8.2。發明人驚奇的發現，含有鉀離子的緩沖液，且緩沖液的pH值為5.0～8.2，可最大限度地保持凝血酶的穩定、保持核酸適配體的生物活性，從而，凝血酶可有效促進核酸適配體形成G-四鏈體結構，G-四鏈體進一步誘導菁染料形成J-聚集體，產生J-聚集體信號。因此，所述緩沖液使得所述試劑盒用于檢測凝血酶，其專屬性和靈敏度進一步提高。

根據本發明的實施例，所述緩沖液包括選自磷酸鉀-磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀-氯化鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀-氯化鈉、磷酸二氫鉀-氫氧化鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉-氯化鉀、磷酸二氫鉀-磷酸、硼酸-氯化鉀-氫氧化鈉、氫二鈉-氯化鈉緩沖液的至少之一，優選地，所述緩沖液是磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。根據本發明的實施例，所述緩沖液使得所述試劑盒用于檢測凝血酶，其專屬性和靈敏度進一步提高。

在本發明的第三方面，本發明提出了一種檢測樣本中凝血酶的方法，其特征在于，包括：(1)將所述樣本與菁染料、核酸適配體混合；(2)將步驟(1)中所得到的混合物進行圓二色譜法、紫外光譜法、熒光光譜法的至少之一檢測；(3)基于所述圓二色譜法、紫外光譜法、熒光光譜法的至少之一檢測的結果，確定所述樣本中是否存在凝血酶。根據本發明的實施例，本發明提出的檢測樣本中凝血酶的方法具有專屬性強和靈敏度高的特點。

根據本發明的實施例，上述檢測樣本中凝血酶的方法還可以進一步包括下列附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述圓二色譜法的波長范圍是200nm～700nm。根據本發明的實施例，當對步驟(1)中所得到的混合物進行圓二色譜法檢測時，采用200nm～700nm的波長，可以實現對樣品中凝血酶的更高專屬性和更高靈敏性的檢測。

根據本發明的實施例，在步驟(3)中，所述圓二色譜法檢測結果中存在620nm峰和 642nm峰是所述樣本中存在凝血酶的指示。發明人驚奇地發現，當凝血酶與菁染料、核酸適配體混合后，對所述混合物進行圓二色譜法檢測，可在620nm和642nm處出現特異性峰，因此，待測樣品在圓二色譜法檢測結果中存在620nm峰和642nm峰是樣本中存在凝血酶的指示。

根據本發明的實施例，檢測樣本中凝血酶的方法進一步包括：(4)基于所述620nm峰和642nm峰至少之一的面積，確定所述樣本中凝血酶的量。根據本發明的實施例，本發明所提出的方法中，特異性峰620nm峰和642nm峰的至少之一的面積與樣本中凝血酶的量對應。步驟(4)可進一步確定樣品中凝血酶的量。

根據本發明的實施例，在步驟(4)中，通過將所述620nm峰和642nm峰至少之一的面積與標準曲線進行比較，確定所述樣本中凝血酶的量。根據本發明的實施例，通過將所述620nm峰和642nm峰至少之一的面積與標準曲線進行比較，可更加準確確定所述樣本中凝血酶的量

根據本發明的實施例，所述標準曲線是利用多個含有已知量凝血酶的樣本進行平行實驗確定的。平行實驗是指在檢測條件完全一致的情況下進行的實驗。根據本發明的實施例，利用多個含有已知量凝血酶的樣本進行平行實驗，實驗條件與本發明所述提出的檢測凝血酶的方法條件完全一致，從而繪制峰面積-凝血酶酶濃度標準曲線，進而利用將所述620nm峰和642nm峰至少之一的面積與標準曲線進行比較，可更加準確確定所述樣本中凝血酶的量。

根據本發明的實施例，所述樣本的pH是5.0～8.2，樣本中凝血酶的含量為至少0.5pM。根據本發明的實施例，所述樣本中凝血酶的含量為至少0.5pM，0.5pM是本發明所提出方法的最低檢測限；pH為5.0～8.2的含有金屬鉀離子的樣本使得本發明所提出檢測凝血酶的方法的靈敏度和專屬性進一步提高。

根據本發明的實施例，所述菁染料為式I所示的化合物，

其中：R₁為C_1～6烷基、任選被烷基取代的苯基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₂、R₃、R₄和R₅分別獨立地選自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成5 元至7元的環結構，或者R₄和R₅與它們所連接的碳原子一起形成5元至7元的環結構，任選地，所述C₁-C₆的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；R₆和R₇分別獨立地為任選被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任選地，所述C_1～6烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；Y為反離子，所述反離子是基于R₆和R₇所帶電荷而選擇的，當R₆和R₇為烷基時，Y為鹵素陰離子；當R₆和R₇之一攜帶磺酸根，不含Y；當R₆和R₇均攜帶磺酸根時，Y為三乙胺陽離子；以及X₁和X₂分別獨立地選自C、O、S、Se或Te。任選地，所述R₁選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基；所述5元至7元環結構為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環結構；所述Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。根據本發明的實施例，將所述樣本與式I所示化合物、核酸適配體混合后，繼而對混合物進行圓二色譜法、紫外光譜法、熒光光譜法的至少之一檢測；基于所述圓二色譜法、紫外光譜法、熒光光譜法的至少之一檢測的結果，可確定所述樣本中是否存在凝血酶。所述檢測樣品中凝血酶的方法的靈敏度和專屬性進一步提高。

根據本發明的實施例，所述菁染料為選自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根據本發明的實施例，所述檢測樣品中凝血酶的方法中菁染料選自式II、式III所示化 合物，所述檢測樣品中凝血酶的方法的靈敏度和專屬性進一步提高。

根據本發明的實施例，所述菁染料與所述核酸適配體的摩爾比是1:(0.05～0.1)。根據本發明的實施例，當菁染料與核酸適配體的摩爾比為1:(0.05～0.1)，所得圓二色譜檢測峰圖在620nm和642nm處出現特征峰，如果菁染料與核酸適配體的摩爾比不在1:(0.05～0.1)范圍內，則圓二色譜檢測峰圖不出現620nm和642nm的特征峰，因此當菁染料與所述核酸適配體的摩爾比是1:(0.05～0.1)時，本發明所提出的方法能夠更高專屬性和更高靈敏度地檢測樣品中的凝血酶。

根據本發明的實施例，所述核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。根據本發明的時施例，含有凝血酶的樣品與菁染料、具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸適配體混合后，凝血酶使核酸適配體形成G-四鏈體結構，G-四鏈體進一步誘導菁染料形成J-聚集體，產生J-聚集體信號，進而通過檢測J-聚集體信號可以確定樣品中的凝血酶。本發明所提出的檢測方法專屬性強、靈敏度高進一步提高。

根據本發明的實施例,所述菁染料的濃度是1～20微摩爾/升，優選地，所述菁染料的濃度是12微摩爾/升。根據本發明的實施例，發明人發現，當菁染料的濃度是1～20微摩爾/升，所得圓二色譜檢測峰圖在620nm和642nm處出現特征峰，當菁染料的濃度為12微摩爾/升時，圓二色譜檢測峰圖在620nm和642nm處的峰值最高，因此，在菁染料的濃度為1～20微摩爾/升，優選菁染料的濃度為12微摩爾/升時，可實現對樣品中凝血酶的更高專屬性和更高靈敏性的檢測。

根據本發明的實施例，所述核酸適配體的濃度為0.5～2微摩爾/升，優選地，所述核酸適配體的濃度為1微摩爾/升。根據本發明的實施例，發明人發現，當核酸適配體的濃度是0.5～2微摩爾/升，所得圓二色譜檢測峰圖在620nm和642nm處出現特征峰，當核酸適配體的濃度為1微摩爾/升時，圓二色譜檢測峰圖在620nm和642nm處的峰值最高，因此，在核酸適配體的濃度為0.5～2微摩爾/升，優選核酸適配體的濃度為1微摩爾/升時，可實現對樣品中凝血酶的更高專屬性和更高靈敏性的檢測。

需要說明的是，本專利中術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發明的描述中，“多個”的含義是兩個或兩個以上，除非另有明確具體的限定。

附圖說明

圖1是根據本發明實施例1的專屬性實驗結果統計圖；

圖2是根據本發明實施例2的靈敏度實驗圓二色譜檢測圖譜；

圖3是根據本發明實施例2的靈敏度實驗圓二色譜檢測圖譜；

圖4是根據本發明實施例3的核酸適配體濃度篩選實驗的圓二色譜檢測圖譜；

圖5是根據本發明實施例4的菁染料濃度篩選實驗的圓二色譜檢測圖譜；以及

圖6是根據本發明實施例5的菁染料與核酸適配體的濃度比例范圍篩選實驗的圓二色譜檢測圖譜。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

在以下實施例中，為保證凝血酶的最佳活性，檢測凝血酶的最佳檢測溫度為0攝氏度，最佳檢測時間為現取現用。

實施例1專屬性實驗

在本實施例中所使用的菁染料具有式II所示的結構，核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，濃度均為1μM。

本實施例對5種不同蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG、LA)進行專屬性考察，

每種蛋白配制4個不同濃度的樣本進行驗證，各樣本核酸適配體的濃度為濃度均為1微摩爾/升，菁染料的甲醇溶液濃度為12微摩爾/升。

實驗步驟如下：

1)5mM的PBS-K⁺緩沖溶液溶解蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG、LA)，得到濃度為100微摩爾/升的母液待用，每種蛋白的4個樣品瓶中分別加入該蛋白母液0、10微升、50微升、100微升；

2)向上述4份待測樣本中分別加入20微摩爾/升的核酸適配體溶液50微升；再依次向上述4份樣本中加入166微摩爾/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分別補加PBS-K⁺緩沖溶878微升、868微升、828微升、778微升，制得總體積相同、核酸適配體和菁燃料濃度相同、該蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG或LA)濃度不同的待測樣本4份；

4)圓二色譜法檢測待測溶液，波長選擇200-700nm，圓二色譜儀對上述待測樣品進行分析，一切操作都在0攝氏度下進行；

5)結果分析：以圓二色譜的吸收為縱坐標，以圓二色譜的波長為橫坐標，制得圖1。

結果如圖1所示，其中thrombin為凝血酶、BSA為牛血清白蛋白、HSA為人血清白蛋 白、IgG為免疫球蛋白、LA為乳酸；BSA、HAS、IgG、LA四種血液蛋白濃度高達10微摩爾/升，檢測體系中也沒有出現J-聚集體特征峰信號(642nm)。

由圖1可以看出，本發明提出的檢測樣品中凝血酶的方法可特異性檢測凝血酶，具有很強的專屬性。

實施例2靈敏度實驗

本實施例中，發明人所用的菁染料具有式II或式III所示的結構。

核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本實施例對8個不同濃度的凝血酶(購自Sigma-Alodrich)樣本進行驗證，各樣本凝血酶濃度為：0、0.5pM、1pM、2pM、3pM、5pM、10pM、20pM。

實驗步驟如下：

1)5mM的PBS-K⁺緩沖溶液溶解凝血酶，得到濃度為0.1nM的凝血酶溶液待用，8個樣品瓶中分別加入待用凝血酶溶液0、5微升、10微升、20微升、30微升、50微升、100微升、200微升；

2)向上述8份凝血酶待測樣本中分別加入1微摩爾/升的核酸適配體5微升、166微摩爾/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分別補加PBS-K⁺緩沖溶923微升、918微升、913微升、903微升、893微升、873微升、823微升、723微升，制得總體積相同、核酸適配體和菁燃料濃度相同、凝血酶濃度不同的待測樣本8份；

4)圓二色譜儀對上述待測樣品進行分析，一切操作都在0攝氏度下進行。圓二色譜波長范圍為200～700nm。

5)以圓二色譜的吸收為縱坐標，以圓二色譜的波長為橫坐標，制得圖2和圖3。

其中，圖2所用的菁染料具有式II所示的結構，圖3所用的菁染料具有式III所示的結構。

由圖2和圖3可以得出，本發明提出的檢測樣品中凝血酶的方法對凝血酶的檢測限可低至0.5pM，相比現有技術(檢測限為nM級)靈敏度顯著提高。

實施例3核酸適配體濃度篩選

在本實施例中所使用的菁染料具有式II所示的結構，核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶濃度均為3pM；

本實施例對10個不同濃度的核酸適配體樣本進行驗證，各樣本核酸適配體的濃度為：0、0.5微摩爾/升、0.6微摩爾/升、0.8微摩爾/升、1微摩爾/升、1.2微摩爾/升、1.4微摩爾/升、1.6微摩爾/升、1.8微摩爾/升、2微摩爾/升。

實驗步驟如下：

1)5mM的PBS-K⁺緩沖溶液溶解凝血酶，得到濃度為0.1nM的凝血酶溶液待用，10個樣品瓶中分別加入待用凝血酶溶液30微升；

2)向上述10份凝血酶待測樣本中分別加入200微摩爾/升的核酸適配體溶液，體積分別為2.5微升、3微升、4微升、5微升、6微升、7微升、8微升、9微升、10微升；再依次向上述10份樣本中加入12微摩爾/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分別補加PBS-K⁺緩沖溶878微升、875.5微升、875微升、874微升、873微升、873微升、871微升、870微升、869微升、868微升，制得總體積相同、凝血酶和菁燃料濃度相同、核酸適配體濃度不同的待測樣本10份；

4)圓二色譜法檢測待測溶液，波長選擇200-700nm，圓二色譜儀對上述待測樣品進行分析，一切操作都在0攝氏度下進行；

5)結果分析：以圓二色譜的吸收為縱坐標，以圓二色譜的波長為橫坐標，制得圖4。

由圖4可以看出，核酸適配體濃度在0.5微摩爾/升～2微摩爾/升時，檢測體系中出現J-聚集體特征峰信號(642nm)(620nm)，核酸適配體濃度為1微摩爾/升時，圓二色譜信號(CD)強度最強，以此確定最佳的核酸適配體濃度為1微摩爾/升。

實施例4菁染料濃度篩選

在本實施例中所使用的菁染料具有式II所示的結構，核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶濃度均為3pM；

本實施例對8個不同濃度的菁燃料(甲醇溶液)樣本進行驗證，各樣本菁染料的濃度為：0、1微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、12微摩爾/升、15微摩爾/升、18微摩爾/升、20微摩爾/升。

實驗步驟如下：

1)5mM的PBS-K⁺緩沖溶液溶解凝血酶，得到濃度為0.1nM的凝血酶溶液待用，8個樣品瓶中分別加入待用凝血酶溶液30微升；

2)向上述10份凝血酶待測樣本中分別加入200微摩爾/升的核酸適配體溶液5微升；再依次向上述8份樣本中加入166微摩爾/升的菁染料的甲醇溶液0、6微升、30微升、60微升、72微升、90微升、108微升、120微升；

3)分別補加PBS-K⁺緩沖溶965微升、959微升、935微升、905微升、893微升、875微升、857微升、845微升，制得總體積相同、核酸適配體和凝血酶濃度相同、菁燃料濃度不同的待測樣本10份；

4)圓二色譜法檢測待測溶液，波長選擇200-700nm，園二色譜儀對上述待測樣品進行分析，一切操作都在0攝氏度下進行；

5)結果分析：以圓二色譜的吸收為縱坐標，以圓二色譜的波長為橫坐標，制得圖5。

由圖5可以看出，菁染料濃度在1微摩爾/升～20微摩爾/升時，檢測體系中出現J-聚集體特征峰信號(642nm)(620nm)，菁染料濃度為12微摩爾/升時，圓二色譜(JASCO J-815)信號(CD)強度最強，以此確定最佳的菁染料濃度為12微摩爾/升。

實施例5菁染料與核酸適配體的濃度比例范圍篩選

在本實施例中所使用的菁染料具有式II所示的結構，核酸適配體具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶濃度均為3pM，菁燃料(甲醇溶液)的濃度均為12微摩爾/升。

本實施例對10個不同濃度比例的(菁燃料/核酸適配體)樣本進行驗證，各樣本核酸適配體的濃度為：0、0.5微摩爾/升、0.6微摩爾/升、0.8微摩爾/升、1微摩爾/升、1.2微摩爾/升、1.4微摩爾/升、1.6微摩爾/升、1.8微摩爾/升、2.0微摩爾/升。

實驗步驟如下：

1)5mM的PBS-K⁺緩沖溶液溶解凝血酶，得到濃度為0.1nM的凝血酶溶液待用，10個樣品瓶中分別加入待用凝血酶溶液50微升；

2)向上述10份凝血酶待測樣本中分別加入166微摩爾/升的菁染料的甲醇溶液72微升；再依次向上述10份樣本中加入20微摩爾/升的核酸適配體溶液0、25微升、30微升、40微升、50微升、60微升、70微升、80微升、90微升、100微升；

3)分別補加PBS-K⁺緩沖溶878微升、853微升、848微升、843微升、838微升、835微升、828微升、825微升、818微升、815微升，制得總體積相同、菁燃料和凝血酶濃度相同、核酸適配體濃度不同的待測樣本10份；

4)圓二色譜法檢測待測溶液，波長選擇200-700nm，園二色譜儀對上述待測樣品進行分析，一切操作都在0攝氏度下進行；

5)結果分析：以圓二色譜的吸收為縱坐標，以圓二色譜的波長為橫坐標，制得圖6。

由圖6可以看出，菁染料與核酸適配體的濃度比例范圍為12μM:(0.6-1.2)μM(1:(0.05～0.1))，比例不在此范圍，無J-聚集體信號。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例 進行變化、修改、替換和變型。