本發明涉及獸藥殘留檢測技術領域，特別是檢測大米中氟樂靈的酶聯免疫試劑盒。
背景技術：
氟樂靈是優良的旱田除草劑。主要用于棉花、大豆、花生、向日葵、甘藍、辣椒、豆類、果園等，也可用于麥地和旱稻田，防除一年生禾本科和種子繁殖的多所生雜草和某些闊葉雜草，如稗草、狗尾草、馬唐、看麥娘、蟋蟀草、千金子、早熟禾、雀麥、野燕麥、雀舌草、藜、莧、粟米草、繁縷、地膚、馬齒莧等。對龍葵、蒼耳、苘麻等宿根性多年生雜草防效差或基本無效。對成株雜草無效。高梁、谷子等敏感作物不能使用；甜菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜等抗性不強，又能用作移栽田。合世界年消費量達萬噸及水平。廣譜的旱地芽前除草劑。可用于棉花、大豆、豌豆、油菜、花生、土豆、冬小麥、大麥、蓖麻、向日葵、甘蔗、蔬菜、果樹等，主要用于防除單子葉雜草和一年生闊葉雜草，如稗草、大畫眉、馬唐、狗尾草、蟋蟀草、早熟禾、千金子、牛筋草、看麥娘、野燕麥等，也可防除小粒種子的藜、莧菜、馬齒莧、繁縷、蓼等雙子葉雜草。
酶聯免疫吸附法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用于食品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。
技術實現要素：
為了克服色譜法的不足，本發明提供一種檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
本發明檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒，包括酶標板、氟樂靈標準品、氟樂靈抗體工作液、氟樂靈酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
本發明檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標板的制備、氟樂靈標準品的制備、氟樂靈抗體工作液的制備、氟樂靈酶標二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
其進一步特征在于：所述的酶標板經由氟樂靈抗原包被制備，具體步驟是將氟樂靈半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將氟樂靈包被抗原稀釋成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶標板甩掉板內液體，加入經稀釋的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封于4℃條件下保存。
氟樂靈標準品濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述氟樂靈抗體工作液是采用氟樂靈人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
所述氟樂靈酶標二抗工作液由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯免疫反應原理，該方法包括以下步驟：
(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有氟樂靈抗原的酶標板，加標準品/樣本50 μL/孔到對應的微孔中，加入氟樂靈酶標二抗工作液，50 μL/孔，然后加入氟樂靈抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環境中反應30 min；
(4)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260 μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15～20 min；
(6)加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5 min內讀完數據）；
(7)以的標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中氟樂靈的含量。
本發明檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理：樣品中的氟樂靈與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標二抗，與抗體反應，通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中氟樂靈的含量。如果樣品中的氟樂靈含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。
具體實施方式
氟樂靈蛋白質偶聯物的制備：
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的氟樂靈半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10：1的結合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應的半抗原，將得到的蛋白質偶聯物溶液于-20℃保存備用。
氟樂靈抗體的制備：
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質偶聯制備的免疫抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天后取脾制備脾細胞懸浮液與骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細胞系進行克隆化，選擇處于對數生長期的雜交瘤細胞進行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7-10天后可產生腹水，待腹水盡可能多時用注射器抽取腹水，反復收集數次，4000 rpm離心15 min，收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 ℃保存備用。
制備包被有氟樂靈包被抗原的酶標板：
包被抗原是將氟樂靈半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到的，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將氟樂靈抗原稀釋成1:40000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封后置4℃下保存。
氟樂靈標準品配制濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
氟樂靈抗體工作液的制備：采用氟樂靈人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
氟樂靈酶標二抗工作液由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 mol/L的硫酸，濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
基于上述制備的試劑，本發明用于檢測氟樂靈的酶聯免疫試劑盒包括如下材料：
(1)96孔酶標板×1塊；
(2)標準液×6瓶：(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg；
(3)抗體工作液 7 mL；
(4)酶標二抗工作液 7 mL；
(5)底物液A 7 mL；
(6)底物液B 7 mL；
(7)終止液 7 mL；
(8)10×濃縮稀釋液 40 mL；
(9)10×濃縮洗滌液 40 mL；
本發明的試劑盒用于檢測農作物樣本中氟樂靈殘留量時，通過以下步驟實施：樣品預處理、用本發明試劑盒進行檢測、分析結果。
(1)用本發明試劑盒檢測待測樣品中氟樂靈殘留量
取包被有氟樂靈抗原的酶標板，加標準品/樣本50 μL/孔到對應的微孔中；加入酶標二抗工作液，50 μL/孔，然后加入氟樂靈抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環境中反應30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300 μL/孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 s，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15 min；加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5 min內讀完數據）；對比待測樣品與標準品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中氟樂靈殘留量。
(2)分析結果
百分吸光度值的計算，標準品或樣本的百分吸光度值等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) ＝B/B0×100%
其中B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0—0 ppb標準溶液的平均吸光度值。
以氟樂靈的標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氟樂靈的實際濃度。