采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白的制作方法

本發明屬于分析檢測領域，具體涉及一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白。

背景技術：

食物過敏是一種人體對食物中抗原物質產生的由免疫介導的不良反應，由此引發身體產生一系列臨床病理生理的變化，嚴重時可能產生過敏性休克，甚至危及生命。據世界衛生組織(WHO)統計，全世界約25％的人患有過敏性疾病，并且以每10年23倍的速度增加，在我國就有2億多食物過敏原患者。近年來，隨著工業化、城鎮化、全球化進程不斷加快，人們生活節奏、方式不斷改變，生活壓力不斷加劇，以及食物種類、加工工藝越來越多，許多原來不過敏的人群逐漸演變成過敏性體質，潛在過敏人群不斷擴大；同時，隨著科技、醫療水平的提高，許多原來未認識到的過敏現象被不斷揭示出來。食物過敏已成為全世界關注的公共衛生熱點問題，而且這個問題正呈現出逐漸擴大的趨勢。

過敏性疾病屬于慢性病，所產生的直接或間接費用對過敏患者及其家庭，對衛生系統和全社會有嚴重的影響。據報道約90％的食物過敏反應主要是由常見的八類食物過敏原(大豆、花生、小麥、堅果、牛奶、蛋類、魚類和甲殼綱動物)引起。其中，牛奶是一類非常重要的過敏原，在兒童中發病率約為0.3％～7.5％，在成年人中的發病率則小于1％。牛奶過敏引起的癥狀表現在呼吸道、消化道和皮膚過敏等，也有可能成為其他過敏性疾病的誘因。因此，牛奶過敏問題日益受到國內外學者的關注和研究。牛奶中引起過敏反應的蛋白包括：β-乳球蛋白(β-LG)、酪蛋白(CAS)、α-乳白蛋白(α-LA)、牛血清白蛋白(BSA)、乳鐵蛋白(LF)以及免疫球蛋白(Igs)等。其中BSA的致敏性較為常見，美國約有50％牛乳過敏患者對BSA產生過敏，且其引發的過敏反應不受其它過敏原的影響。現還證實引起牛肉過敏的主要過敏原就是存在于血漿中的BSA。此外，BSA在醫學臨床及生物領域也有著廣泛的應用，這使得過敏患者很難避免接觸過敏原BSA而遭受健康威脅。

迄今為止，針對食物過敏尚無有效的治療方法，在食品標簽上標識過敏原的存在是避 免過敏患者食入潛在過敏原的最有效的途徑。因此，為保證過敏原標簽、標識制度的實施，各國研究者紛紛開展了針對食物過敏原檢測方法的研究。但目前針對過敏原BSA的檢測方法報道較少。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述存在的問題提供一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白，該方法包括以下步驟：

第一步，抗體的制備，具體的制備過程如下：

(1)動物免疫：選取雌性小鼠，將抗原BSA與弗氏完全佐劑混合首次皮下注射進行免疫，2～3周加強免疫1次，根據小鼠血清效價ELISA檢測結果，選取效價在1：10000以上的小鼠脾細胞進行細胞融合；

(2)細胞融合：將骨髓瘤細胞和經BSA免疫后小鼠的脾細胞混合，通過PEG促使細胞融合；融合10d后開始進行篩選檢測；

(3)融合篩選及亞克隆：將融合后的細胞采用ELISA進行檢測，選取ELISA結果判斷為陽性的細胞；根據有限稀釋法將該陽性的細胞進行亞克隆，檢測至100％陽性后，挑出單克隆孔擴大培養定株，獲得1株穩定分泌抗BSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株9G6；

(4)腹水制備及純化：向預處理過的小鼠腹腔內注射雜交瘤細胞株9G6，7～10d后取腹水，將所收集的腹水離心取上清液，準備好蛋白A瓊脂糖介質并裝柱，將腹水上清液用PBS緩沖液稀釋10倍后緩慢上樣，上樣結束后用PBS緩沖液洗滌至紫外檢測儀達到最低值，甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體；

第二步，標準曲線的繪制，具體過程如下：

①抗原包被：將抗原稀釋，每孔100μL包被酶標板，37℃包被2h，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干；

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干；

③競爭結合：用封閉液將抗原稀釋為460ng/mL，然后做2倍梯度稀釋，共計23個濃度梯度，按每孔50μL將各梯度的稀釋液加入孔內；隨即每孔加入50μL稀釋過的純化后 的抗體，與之前加入的不同濃度梯度的抗原標準溶液混合，室溫反應2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物標記抗體，每孔100μL，室溫反應1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值；

⑥標準曲線繪制：以抗原濃度的對數為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，繪制標準曲線，并根據標準曲線計算半數效應濃度；

⑦線性范圍確定：根據標準曲線呈明顯相關的區段，以標準品濃度的對數為橫坐標，以抑制率[(A_標/A₀)×100％]為縱坐標繪制擬合后的標準曲線，其中A₀為零標準品孔OD₄₅₀值，A_標為各濃度標準品孔OD₄₅₀值；

第三步，將待測樣品采用如下測定程序進行測定：

①抗原包被：用包被緩沖液將待測樣品稀釋至工作濃度，加入酶標板，每孔100μL，37℃包被2h，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干；

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干；

③競爭結合：先將待測樣品加入酶標板，每孔50μL，再加入純化后的抗體，每孔50μL，室溫競爭反應2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物標記抗體，每孔100μL，室溫反應1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值；

⑥采用第二步擬合的標準曲線，計算得到待測樣品的濃度。

本發明技術方案的第二步①中，抗原包被濃度為0.25μg/mL。

本發明技術方案的第二步③中，抗體稀釋終濃度為1:32000。

本發明技術方案的第三步①中，工作濃度為0.25μg/mL。

附圖說明

圖1單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖；

圖2單克隆抗體免疫分析結果；

圖3包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數對反應靈敏度的影響；

圖4標準曲線；

圖5線性擬合曲線；

圖6特異性檢測。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍不限于此：

細胞及實驗動物

鼠骨髓瘤細胞SP2/0購自中國科學研究院上海細胞研究所。6～8周齡BALB/c雌性小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心。

主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)，購自美國Sigma公司；蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay kit)，美國Novagen公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，購自美國Promega公司；羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體購自美國Proteintech公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Miliipore公司。主要設備

各種量程微量移液器，德國Eppendorf公司；酶標儀(iMark)、凝膠成像儀(Gel Doc XR)，美國Bio-Rad公司；CO₂恒溫培養箱(MCO-15AC)，日本SANYO公司；臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R)，美國Beckman公司；紫外可見分光光度計(SpectrumLab54型)，上海棱光技術有限公司；精密酸度計(PHS-2C)，上海雷磁儀器廠；ELISA酶標板(96孔)，美國Corning Incorporated公司)；電泳儀(DYY-6C)，北京六一儀器廠。

緩沖液及其它溶液配制

10×PBS緩沖液(0.1mol/L，pH7.4)：稱取80g NaCl，2g KCl，2.58g KH₂PO₄，29g Na₂HPO₄·12H₂O，加蒸餾水至1000mL，抽濾，室溫長期保存，用時取100mL加900mL蒸餾水配成1×PBS緩沖液。

包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)：稱取0.17g Na₂CO₃，0.258g NaHCO₃，加蒸餾水至100mL，4℃保存。

洗滌液(PBST，pH7.4)：含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/L，pH7.4PBS。

封閉液：含10％(w/v)馬血清的pH7.4PBST，4℃保存。

終止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：量取11.1mL濃H₂SO₄，加入到80mL蒸餾水中，冷卻后，定容至100mL。

動物免疫

選取6只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，將抗原(BSA)與弗氏完全佐劑混合首次免疫，皮下注射100μg，2～3周加強免疫1次，采用弗氏不完全佐劑與抗原混合，皮下注射100μg。四免后采血檢測，根據小鼠血清效價ELISA檢測結果，選取效價在1：10000以上的小鼠進行122細胞融合。未免疫的小鼠血清為陰性血清，-20℃凍存。

細胞融合

融合前1周準備好Sp2/0骨髓瘤細胞。小鼠在融合前3d終免，腹腔注射抗原100μg。融合當天用頸椎脫臼法安樂死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min，無菌取脾臟，經過研磨、過網、沖洗、離心等操作，收集脾細胞計數。混合骨髓瘤細胞和脾細胞，使骨髓瘤細胞同脾細胞數量比在1:20為宜。通過PEG促使細胞融合，把融合的細胞鋪到96孔板中，每孔100μL。然后將細胞培養板放到CO₂培養箱中培養。融合后4d觀察，雜交瘤細胞克隆率在50％以上，細胞生長狀態良好。融合10d后開始進行篩選檢測。

融合篩選及亞克隆

(1)融合篩選：吸取細胞上清100μL/孔進行間接ELISA檢測，根據ELISA結果判斷陽性孔(樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔)，選擇其中較高讀數的10株陽性細胞進行亞克隆。

(2)亞克隆：根據有限稀釋法進行亞克隆，檢測至100％陽性后，挑出單克隆孔擴大培養定株，獲得1株穩定分泌抗BSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株9G6。

腹水制備及純化

(1)腹水制備：向預處理過的小鼠腹腔內注射雜交瘤細胞。按每只小鼠注射1×10⁶個細胞的量，注射雜交瘤細胞。7～10d，用注射器針頭小心采出盡可能多的液體。小鼠在最后一次采集后頸椎脫位法處死。

(2)純化：將所收集的腹水離心取上清，準備好蛋白A瓊脂糖介質并裝柱，將腹水用PBS緩沖液稀釋10倍后緩慢上樣，上樣結束后用PBS緩沖液洗滌至紫外檢測儀達到最低值，甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，立即在PBS緩沖液中進行4℃透析過夜，隔日進行濃度、純度和效價的測定。

抗BSA單克隆抗體的效價測定

①抗原包被：用包被緩沖液將抗原稀釋至5μg/mL，加入酶標板，每孔100μL，4℃包 被過夜，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。

③抗體檢測：加入待測抗體，每孔100μL，室溫競爭反應2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，通過間接ELISA法測定其OD₄₅₀值。

單克隆抗體的蛋白免疫印跡分析

過敏原溶液(0.5mg/mL)經SDS-PAGE電泳后轉膜到PVDF膜上，用10％馬血清室溫封閉2h(或4℃過夜)，用PBST洗滌3次，加入制備的抗BSA單克隆抗體(1:1000倍稀釋)，室溫作用1.5h，用PBST洗滌3次，加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:5000倍稀釋)，室溫作用1.5h，PBST洗滌3次，于TMB顯色液中顯色2min。

將純化后抗體進行SDS-PAGE電泳，可見抗體純化后純度較高，在95％以上(圖1)。純化的單克隆抗體有兩條條帶，一條是分子量約為25KD的輕鏈，一條是分子量約為50KD的重鏈。將所純化的抗體進行蛋白免疫印跡反應分析，試驗結果表明單克隆抗體可與過敏原BSA發生免疫印跡反應，證明可用所制備的單克隆抗體建立免疫學檢測方法，以檢測食品中BSA成分(圖2)。

最佳包被抗原濃度和抗體稀釋度的確定

①抗原包被：用包被緩沖液將抗原BSA分別稀釋為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0μg/mL，橫向加入酶標板，每孔100μL，37℃包被2h(或4℃包被過夜)，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。③抗原抗體反應：用封閉液將抗BSA單克隆抗體分別進行1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000稀釋，縱向加入酶標板，每孔100μL，同時設置陰性對照，室溫反應2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值。

用矩陣法確定最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數。一般來說，在OD值為1.0時， 誤差相對最小，所以選擇OD₄₅₀值為1.0，陰性對照小、陽性對照/陰性對照值大的抗原包被濃度及抗體稀釋倍數為理想工作濃度，結果見表1和圖3。抗原包被濃度過高或過低均會影響反應的靈敏度，濃度過低，抗原包被量不足，微孔內吸附的抗原少，可供抗體結合的抗原決定簇少；包被濃度過高，微孔內吸附的抗原多，產生空間位阻，同樣可控抗體結合的抗原決定簇少，從而影響包被抗原進一步與抗體的結合，降低靈敏度。因此確定本試驗的最適包被濃度為0.25μg/mL，抗體工作濃度為1:32000。

表1最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數的確定

標準曲線的制作及線性范圍的確定

①抗原包被：將抗原BSA稀釋至0.25μg/mL，每孔100μL包被酶標板，37℃包被2h(或4℃包被過夜)，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。

③競爭結合：用封閉液將抗原稀釋為460ng/mL，然后做2倍梯度稀釋，共計23個濃度梯度(含460ng/mL)，按每孔100μL將各梯度的稀釋液加入孔內；隨即每孔加入100μL最適濃度的抗BSA單克隆抗體，室溫反應2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值。

⑥標準曲線繪制：以抗原濃度的對數為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，繪制標準曲線，并根據標準曲線計算半數抑制濃度(IC₅₀)。

⑦線性范圍確定：根據標準曲線呈明顯相關的區段，以標準品濃度的對數為橫坐標， 以抑制率[(A_標/A₀)×100％]為縱坐標繪制標準曲線，并根據曲線的具體情況選擇最佳的擬合模型，其中A₀為零標準品孔OD₄₅₀值，A_標為各濃度標準品孔OD₄₅₀值。

在上述最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數條件下，通過間接競爭ELISA程序，以不同待測抗原濃度梯度的對數為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，作圖得標準曲線(圖4)。根據標準曲線公式算出IC₅₀為52.3ng/mL。本試驗還根據標準曲線呈明顯相關的區段，選擇合適的抗原濃度梯度(3.5938～460ng/mL)，確定其線性關系，見圖5。結果顯示，擬合的線性回歸直線方程為y＝－47.4489x+135.8663(R²＝0.9973)，符合線性關系的判定標準。

靈敏度試驗

隨機選擇10個孔做零標準品間接競爭ELISA檢測，求所得10個孔OD₄₅₀值的均值和標準差(SD)，在標準曲線上對應的標準品濃度即為此方法的靈敏度(最低檢測限)。

靈敏度測定結果見表2。在標準曲線上對應的標準品濃度為6.71ng/mL，即最低檢測限。

表2靈敏度測定

特異性試驗

將競爭結合步驟中將馬血清、豬血清、兔血清、羊血清、狗血清、雞血清、小鼠血清(陰性對照)分別稀釋，各取100μL，分別與100μL抗BSA單克隆抗體一起加入酶標板，利用間接競爭ELISA檢測其交叉反應性。

按照本試驗建立的方法分別對馬血清、豬血清、兔血清、羊血清、狗血清、雞血清和小鼠血清(陰性對照)進行交叉反應檢測。結果表明該方法特異性良好，與所檢測的其他種屬血清白蛋白無交叉反應(圖6)。

精密度試驗

本試驗嚴格控制反應條件，按照標準進行操作，對建立的間接競爭ELISA檢測方法進行精密度測試，結果以批內和批間變異系數(CV)表示該方法的精密度。分別設3個濃度梯度的待測樣品，同一樣品測定兩個批次，每個批次重復測定32次。以每批次內3 個水平變異系數的均值代表各批內變異系數，總的批內變異系數為兩批次批內變異系數之均值。批間變異系數是將兩批次每個水平按64次重復計算變異系數，再取平均值。

分別設200、100和50ng/mL 3個水平標準品濃度。分兩批每批32個重復，測定結果見表3。ELISA方法第一批次批內變異系數為3.21％，第二批次批內變異系數為3.03％，總的批內變異系數為3.12％。批間變異系數為3.12％。本檢測方法批內與批間的變異系數均小于5％，可知本方法精確度較高，重復性較好。

表3精密度測定

1.2.8回收率試驗

將不同溶度的BSA與小麥粉蛋白提取液中攪拌均勻，作為待測樣品，檢測待測樣品中BSA濃度，根據如下公式計算回收率。以小麥粉蛋白提取液作為空白對照檢測。

回收率(％)＝(測量質量溶度/實際質量溶度)×100

將不同濃度的BSA標準品添加至小麥粉蛋白提取液中，制備不同污染濃度的樣品，以間接競爭ELISA法檢測樣品中BSA的回收率，每個濃度重復32次，見表4。當添加BSA的質量濃度在50～200ng/mL范圍時，隨著樣品中BSA質量濃度的增加，回收率變異系數減小，精確度提高，可知本研究的間接競爭ELISA法滿足檢測要求。

表4 BSA加標回收率測定