一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法與流程

本發明屬于免疫檢測分析
技術領域：
，尤其涉及一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法。
背景技術：
：動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是嚴重危害人類健康的常見病種，在過去很長一段時間內始終是醫學和生物化學研究的重點。因為它普及面廣，在人體內潛伏期長，往往以局部缺血、心絞痛、心肌梗塞、中風、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆發，已成為現階段最常見的死因。脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)是心血管疾病中一種新的炎癥酶，屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶，能水解氧化低密度脂蛋白(LDL)，產生溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(oxidizedfreefattyacids，ox-FA)，促進動脈粥樣硬化的形成和發展。越來越多的研究證實，Lp-PLA2活性能反映動脈粥樣硬化病變的嚴重程度，并與易損斑塊的穩定性有關。它可作為缺血性卒中獨立的預測因子，可提供傳統危險因子評估以外的預測信息，測定其水平有助于指導預防策略。Lp-PLA2與其他炎性因子(如C-反應蛋白等)相比，受其他危險因素的影響較小，檢測具有更高的靈敏度和特異性，目前已被用作預測心血管事件的風險指標，用以對患者心血管疾病進行早期診斷、療效觀察及預后評估。大量臨床研究證實，Lp-PLA2與其他心血管疾病標志物聯檢，可以更進一步提高診斷的敏感性和特異性。目前，臨床上用于測定Lp-PLA2的方法有ELISA法和免疫比濁法兩種。ELISA法實驗過程受影響因素多，很容易造成結果失真，重復性準確性較差；免疫比濁法檢測靈敏度低，很容易受血脂濃度影響產生假性升高，且不適用于 大批量、自動化式檢測平臺。化學發光免疫分析技術是繼ELISA之后發展起來的一項新的免疫測定技術。它將化學發光分析的高靈敏度與抗原抗體反應的高特異性相結合，與目前常見的免疫分析法相比具有更高的靈敏度、特異性，且具有檢測時間短、測量線性范圍寬、穩定性好、操作簡便快捷、便于自動化、安全無污染等諸多優點，已廣泛應用于傳染病、肥胖相關疾病、內分泌系統、遺傳病、腫瘤的早期診斷、動植物檢驗檢疫等眾多領域，并已逐漸成為標記免疫分析的一個重要方向。目前，化學發光免疫分析技術在人Lp-PLA2免疫分析產品的應用方面仍是空白。技術實現要素：本發明實施例的目的在于提供一種簡便、快捷、準確的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法，旨在解決化學發光免疫分析技術在人Lp-PLA2免疫分析產品的應用方面仍是空白的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒，該脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒包括：標準品和質控品、包被載體、酶標記物、化學發光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；標準品和質控品是以胎牛血清為基質，由脂蛋白相關磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標準品的濃度包括1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/rnL、0ng/mL共6個濃度，質控品分為質控低值和質控高值，濃度范圍依次為150±15ng/mL、300±35ng/mL。進一步載體為微孔板、磁性顆粒或塑料管。進一步用于標記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。進一步化學發光底物液為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷或魯米諾。進一步分析緩沖液為含有1％牛血清白蛋白和0.05％吐溫-20的10mM磷酸 鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。進一步濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。本發明實施例的另一目的在于提供一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒制備方法，該脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒制備方法包括以下步驟：步驟一，制備脂蛋白相關磷脂酶A2標準品和質控品：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎緩沖液，用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標準品；用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質控品和150ng/mL低值質控品，高、低質控品的濃度測定范圍經統計學分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；步驟二，制備包被有脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的載體：載體為微孔板或塑料管時，包被載體通過以下方法制備：脂蛋白相關磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經過稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體負載于載體上，包被結束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫18-25℃干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；封閉緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/LPBST溶液，內含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；封閉后包被載體的干燥環境相對濕度小于30％；載體為磁性顆粒時，包被載體通過以下方法制備：吸取3mL內含2％磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調整 體積至6mL；加入5mg脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，置于4℃內混勻30min；加入12mg碳二亞胺，置于4℃內孵育過夜；用pH7.4、100mmol/LPBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L；調節pH至7.4，抗體終濃度為1mg/mL，得到脂蛋白相關磷脂酶A2抗體包被載體，清洗液為pH6.0、10mmol/LPBS緩沖液；步驟三，制備脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶標記物：用于標記的酶為堿性磷酸酶時，酶標記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯法將脂蛋白相關磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，置于4℃保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；用于標記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標記抗體的制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進行還原，經pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；步驟四，制備化學發光底物液：上述堿性磷酸酶標記抗體對應的化學發光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)，AMPPD化學發光底物液的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；上述辣根過氧化物酶標記抗體對應的化學發光底物為魯米諾，魯米諾化學發光底物液的配制方法為：基于1000mL化學發光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調整pH至8.0；基于1000mL化學發光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調整pH至7.6；步驟五，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內含1％BSA、0.1％Proclin300；步驟六，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內含1％吐溫-20；步驟七，組裝脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒，將標準品和質控品、包被載體、酶標記物、化學發光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒。本發明提供的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法，采用雙抗體夾心反應模式，可以對人血樣本中的脂蛋白相關磷脂酶A2分子進行專一的定量檢測。它既有效地利用了化學發光的技術原理，又在酶聯免疫分析的基礎上應用酶催化發光底物，具有靈敏度高、檢測范圍寬、穩定性好、操作簡便快速無污染等優點。本發明與其他開放式全自動化學發光檢測平臺相結合，可以有效縮短檢測時間，降低檢測成本和人力花費。項目開發的產品市場前景廣闊，經濟和社會效益顯著；與酶聯免疫、免疫比濁等方法相比較，本發明簡化了操作步驟，縮短了檢測時間、大大提高了測定的靈敏度和準確性。本發明使用的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體具有高度特異性，得到的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法可以取代其他試劑盒來進行脂蛋白相關磷脂酶A2的定量檢測。與國外試劑盒相比，本發明試劑盒不僅價格低廉，而且操作簡便，靈敏度高，便于在臨床上大規模推廣使用。附圖說明圖1是本發明實施例提供的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒制備方法流程圖；圖2是本發明實施例提供的實施例1所制備的試劑盒中標準品線形圖；圖3為本發明實施例提供的的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒及制備方法與美國PLAC公司脂蛋白相關磷脂酶A2酶聯免疫測定試劑盒檢測200例心血管病人相關性的結果示意圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。本發明實施例的一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒包括：標準品和質控品、包被載體、酶標記物、化學發光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；標準品和質控品是以胎牛血清為基質，由脂蛋白相關磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標準品的濃度包括1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL共6個濃度，質控品分為質控低值和質控高值，濃度范圍依次為150±15ng/mL、300±35ng/mL；載體為微孔板、磁性顆粒或塑料管；用于標記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；化學發光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷或魯米諾；分析緩沖液為含有1％牛血清白蛋白和0.05％吐溫-20的10mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4；濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。如圖1所示，本發明實施例的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒制備方法包括以下步驟：S101：制備脂蛋白相關磷脂酶A2標準品和質控品；S102：制備包被有脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的載體；S103：制備脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶標記物；S104：制備化學發光底物液；S105：制備分析緩沖液；S106：制備濃縮洗滌液；S107：組裝脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒，將標準品和質控品、包被載體、酶標記物、化學發光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒。本發明具體的方法如下：步驟一，制備脂蛋白相關磷脂酶A2標準品和質控品：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎緩沖液，用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標準品；用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質控品和150ng/mL低值質控品，高、低質控品的濃度測定范圍經統計學分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；步驟二，制備包被有脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的載體：載體為微孔板或塑料管時，包被載體可通過以下方法制備：脂蛋白相關磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經過稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體負載于載體上，包被結束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25℃)干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關磷脂酶A2抗體包被載體，所述 包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，所述脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；所述稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；所述包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；所述封閉緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/LPBST溶液，內含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；所述封閉后包被載體的干燥環境相對濕度小于30％；載體為磁性顆粒時，包被載體可通過以下方法制備：吸取3mL內含2％磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調整體積至6mL；加入5mg脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，置于4℃內混勻30min；加入12mg碳二亞胺，置于4℃內孵育過夜；用pH7.4、100mmol/LPBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L；調節pH至7.4，抗體終濃度為1mg/mL，得到脂蛋白相關磷脂酶A2抗體包被載體，所述清洗液為pH6.0、10mmol/LPBS緩沖中液；步驟三，制備脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶標記物：用于標記的酶為堿性磷酸酶時，酶標記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯法將脂蛋白相關磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；用于標記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標記抗體的制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進行還原，經pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體 酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；步驟四，制備化學發光底物液：上述堿性磷酸酶標記抗體對應的化學發光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)，所述AMPPD化學發光底物液的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；上述辣根過氧化物酶標記抗體對應的化學發光底物為魯米諾，所述魯米諾化學發光底物液的配制方法為：基于1000mL化學發光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調整pH至8.0；基于1000mL化學發光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調整pH至7.6；步驟五，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內含1％BSA、0.1％Proclin300；步驟六，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內含1％吐溫-20；步驟七，組裝脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒，將標準品和質控品、包被載體、酶標記物、化學發光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒。結合以下的實施例對本發明的應用效果做進一步的說明：實施例1：本發明實施例的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒包括標準品和質控品、包被載體、堿性磷酸酶酶標記物、化學發光底物液AMPPD、分析緩沖液、濃縮洗滌液；其中：1.標準品和質控品用下述方法制成：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎緩沖液，用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標準品；用基礎緩沖液將脂蛋白相關磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質控品和150ng/mL低值質控品，高、低質控品的濃度測定范圍經統計學分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；2.包被微孔板的制備步驟為：脂蛋白相關磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經過稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體負載于載體上，包被結束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25℃)干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH7.2、10mmol/L磷酸鹽溶液，所述脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；所述稀釋的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；所述包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；所述封閉緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；所述封閉后包被載體的干燥環境相對濕度小于30％；3.堿性磷酸酶標記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯法將脂蛋白相關磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；4.化學發光底物液AMPPD的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；試劑盒中標準品線形圖如圖2所示；5.分析緩沖液的制備配方為：pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內含1％BSA、0.1％Proclin300；6.濃縮洗滌液的制備配方為：pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內含1％吐溫-20：7.半成品及成品組成：上述步驟所得產品分裝即為半成品，隨機抽取三批進行特異性、精密度、靈敏度及穩定性檢驗，合格后組裝為脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用塑料管替代實施例1步驟2中的微孔板，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；用磁性顆粒替代實施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實施例2：一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒包括以下組分：1.標準品和質控品(同實施例1)：2.包被載體(同實施例1)3.辣根過氧化物酶標記物，其制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于 1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進行還原，經pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標記好的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體酶結合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；4.化學發光底物液魯米諾，其配制方法為：基于1000mL化學發光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調整pH至8.0；基于1000mL化學發光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調整pH至7.6；5.分析緩沖液(同實施例1)；6.濃縮洗滌液(同實施例1)；7.半成品及成品組成(同實施例1)；實驗證明：用塑料管替代實施例1步驟2中的微孔板，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；用磁性顆粒替代實施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶 A2化學發光檢測試劑盒；實驗證明：用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實施例1，可以制備出相應的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒；實施例3：以下給出采用實施例1中制備的化學發光檢測試劑盒檢測臨床樣本中脂蛋白相關磷脂酶A2的具體操作方法：1.樣本處理：待測樣本為血漿時，用EDTA抗凝管取血2mL，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；待測樣本為血清時，用普通管或促凝管取血2mL，4℃下放置30分鐘后，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；2.樣本檢測：將樣本、分析緩沖液加到固相有脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的微孔板中，反應30min后，樣本中的脂蛋白相關磷脂酶A2與固相抗體特異性結合，洗去游離成分，加入酶標記物避光反應30min，被酶標記的脂蛋白相關磷脂酶A2抗體與抗原、固相抗體形成“夾心”復合物，洗去游離成分，加入發光底物液，避光反應5min后測定各孔發光值RLU，樣本的RLU與其中的脂蛋白相關磷脂酶A2抗原濃度正相關，樣本濃度依據樣本的RLU數值可進行定量計算；實施例4：以下給出按照本領域中常規的制造及檢定規程對實施例1中制備的化學發光檢測試劑盒進行檢定，結果見表1：表1檢驗項目檢驗標準檢驗結果靈敏度≤10ng/mL符合標準精密度CV(％)批內＜5％，批間＜10％符合標準準確性平均回收率101.51％±1.23％符合標準特異性與類似物的交叉反應率≤0.01％符合標準穩定性各試劑組分置于37℃至少7天，仍保持穩定符合標準說明本發明的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒相關技術指標符合國家體外診斷試劑規范；實施例5：以下給出使用實施例1中制備的脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒與美國PLAC公司脂蛋白相關磷脂酶A2酶聯免疫測定試劑盒共同檢測150份心血管病人樣本的相關性結果；1.臨床樣本的來源：從天津市武警總醫院收集心血管病人血清樣本150份，其中動脈粥樣硬化患者81例，冠心病患者69例；2.使用實施例1的試劑盒(按實施例3操作)和PLAC試劑盒(按其說明書操作)分別對150份血清樣本進行檢測；3.兩種試劑盒的測定結果經統計學分析顯示，兩種方法檢測的結果高度相關，見附圖3，相關系數r＞0.98，P＜0.01，說明兩種方法具有同等的使用價值，但本發明制備的一種脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光檢測試劑盒成本低廉，操作簡便、快速，更易于推廣；以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3