一種高效定量檢測C反應蛋白的免疫學試劑盒的制作方法

本發明涉及生物檢測
技術領域：
，具體涉及一種高效定量檢測C反應蛋白的免疫學試劑盒。
背景技術：
：C反應蛋白（C-reactiveprotein）是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應形成復合物的急性時相反應蛋白，半衰期19小時；血清CRP由肝臟合成，白細胞介素1β、6以及腫瘤壞死因子是其合成的最重要的調節因子；CRP的分子量為105500，由含有五個相同的未糖基化的多肽亞單位組成，每個亞單位含有187個氨基酸，這些亞單位間通過非共價鍵連結成環狀的五聚體，并有一個鏈間二硫鍵。1930年，Tillett和Francis首次在急性大葉性肺炎患者的血清中發現一種能在Ca2+存在時與肺炎球菌細胞壁中的C-多糖發生特異性沉淀反應的物質。1941年，Avery等測知它是一種蛋白質，故稱為C反應蛋白(CRP)。1944年，Jones將其作為臨床風濕熱診斷標準的次要指標之一。后來，人們在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都測到了CRP，于是人們認為，CRP是組織損傷的一種非特異性反應。進一步研究發現：病毒或細菌感染、梗塞、免疫復合物沉積等因素都可導致組織損傷。在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血漿蛋白顯著增加，這些蛋白質通稱為急性時相蛋白，其中CRP是急性時相蛋白中變化最顯著的一種。CRP在正常人血清中其含量極微；在組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時CRP可以在數小時內急劇上升，可增高數倍或數百倍，2~3天達峰值，待病情改善時逐漸下降，恢復正常。CRP被廣泛應用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，其升高可見于：1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎癥性疾病，如風濕性關節炎、全身性血管炎、多肌痛風濕病；2、術后感染及并發癥的指標：手術后病人CRP升高，術后7~10天CRP水平應下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并發感染或血栓栓塞；3、可作為細菌性感染和病毒性感染的鑒別診斷：大多數細菌性感染會引起患者血清CRP升高，而病毒性感染則多數不升高。CRP的檢測在八十年代以前作為炎癥和組織損傷的非特異性標志物大量應用于臨床。但由于過去CRP的檢測方法較為落后，假陽性和假陰性很高，影響了它在臨床上的價值，而逐漸被臨床所忽視。近年來，由于檢測技術的更新，測定CRP的快速、簡便和可靠的方法已迅速建立。使CRP在臨床應用領域大大增加。其在醫學上的價值正得到廣泛驗正和承認。目前臨床上用于檢測CRP的方法包括普通ELISA、免疫比濁法和膠體金法。普通ELISA法具有較高的靈敏度，但操作繁瑣，易出現假陽性和假陰性。免疫比濁法有較高的靈敏度，操作簡易，但線性較差。膠體金法靈敏度高，操作簡易，但對定量檢測的要求高，不適合用于精確定量。目前的普通ELISA試劑盒的檢測范圍在3~350mg/L，有必要繼續優化檢測靈敏度，開發能檢測到更低含量CRP的免疫學方法和相應試劑盒。技術實現要素：本發明為了克服現有技術檢測C反應蛋白存在靈敏性低、易出現假陽性的缺陷，提供一種高效定量檢測C反應蛋白的免疫學試劑盒。該試劑盒與傳統的試劑盒相比具有特異性強、靈敏度高、檢測范圍更低、線性條件好等優點。為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的。一種高效定量檢測CRP的免疫學試劑盒，該試劑盒以抗CRP的多克隆抗體和抗CRP的單克隆抗體混合在一起作為聯合捕獲抗體，以抗CRP的單克隆抗體或抗CRP的多克隆抗體作為檢測抗體，通過抗原抗體反應檢測CRP。現有技術中的免疫學試劑盒在檢測CRP時，捕獲抗體都是僅使用一種類型的抗體，要么是單克隆抗體，要么是多克隆抗體；而本發明的試劑盒將抗CRP的單克隆抗體與抗CRP的多克隆抗體混合制備成捕獲抗體，以抗CRP的單克隆抗體作為檢測抗體，這種免疫學試劑盒的檢測敏感性和特異性顯著提高。敏感性和特異性顯著提高的原因在于，聯合捕獲抗體在不同的溶液環境下增加了抗原抗體的結合表位，減少了假陰性，但有可能增加假陽性，所以我們在選擇檢測抗體時采用芯片法來作交叉實驗，篩選到的檢測抗體特異性十分強，該檢測抗體與39種抗原蛋白無交叉反應。從而彌補了聯合捕獲抗體可能導致的假陽性。本發明用作檢測抗體的單克隆抗體和用作聯合捕獲抗體的單克隆抗體均來自于美國瑞博奧生物科技有限公司。美國瑞博奧生物科技有限公司將小鼠脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0融合后得到2株雜交瘤細胞株，分別命名為H16740（該雜交瘤細胞分泌的抗CRP單克隆抗體的貨號119-16740）和H14815（該雜交瘤細胞分泌的抗CRP單克隆抗體的貨號為119-14815）。作為檢測抗體的抗CRP的單克隆抗體為貨號為119-16740的抗體；作為聯合捕獲抗體的單克隆抗體為貨號為119-14815的抗體。本發明在前期篩選檢測抗體時，也用到了其他類型的抗體，如美國瑞博奧生物科技有限公司，貨號為119-16718的抗CRP單克隆抗體，但是該抗體采用芯片法來作交叉實驗時，其特異性并不好。優選地，本發明所述抗CRP的多克隆抗體是根據以下方法制備的：將SEQIDNO:1所示基因通過原核表達系統獲得的蛋白作為CRP抗原標準品免疫SPF級新西蘭兔，得到含有抗CRP多抗的兔血清，先用硫酸銨沉淀法從兔血清中初步純化免疫球蛋白IgG，再用ProteinG/A親和柱進一步純化，得到抗CRP多抗。所述的CRP抗原標準品是采用原核表達系統表達的蛋白，該蛋白可溶性程度高，空間構象更接近天然抗原。優選地，所述試劑盒為檢測CRP的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒包括包被聯合捕獲抗體的微孔板，濃縮洗滌液，重組人CRP蛋白的標準品抗原，待測樣本濃縮稀釋液，稀釋抗體和標記酶的濃縮稀釋液，生物素標記的檢測抗體，標記酶溶液，TMB底物，終止液；所述捕獲抗體是抗CRP多克隆抗體和抗CRP單克隆抗體混合在一起的聯合捕獲抗體；檢測抗體為抗CRP的單克隆抗體或抗CRP的多克隆抗體。優選地，檢測CRP的酶聯免疫試劑盒中，所述聯合捕獲抗體的包被濃度是每種抗體0.3~0.5ug/孔，所述待測血清的稀釋倍數是1：10，所述檢測抗體的濃度為0.1mg/L，所述生物素標記的檢測抗體的稀釋濃度是1:5000。優選地，所述試劑盒為檢測CRP的膠體金試劑盒，試劑盒包括至少一個試紙條，試紙條包括樣品墊，標記墊，硝酸纖維素膜，吸水紙，標記墊上包被膠體金標記的抗CRP檢測抗體，硝酸纖維素膜包括包被有抗鼠IgG二抗的質控區和包被有聯合捕獲抗體的檢測區。更優選地，所述聯合捕獲抗體的包被濃度分別為0.5~1mg/ml，用量按膜包被液量為20~25ug/30cm2；所述檢測抗體的包被濃度為0.2~1mg/ml，用量按膜包被液量為0.8ug/cm2。優選地，所述試劑盒為檢測CRP的時間分辨熒光免疫層析試劑盒，試劑盒包括多個檢測試紙條，所述試紙條包括樣品墊、結合物釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述結合物釋放墊中含過量的抗CRP檢測抗體和熒光微球的復合物；硝酸纖維素膜上有檢測線（又稱T線）和對照線（又稱C線），檢測線含定量的聯合捕獲抗體，對照線含定量的抗鼠IgG二抗。本發明所述時間分辨熒光免疫層析試劑盒的檢測原理是雙抗夾心法，將直徑范圍0.01~1um的膠乳微球與抗CRP單抗和各類不同的熒光素共價結合，利用熒光素在激光發作用下可以發射熒光，當此熒光膠乳標記的CRP單抗與樣本中的抗原結合形成復合物，在層析作用下移至包被膜的檢測區，在包被膜的檢測區包被有能與CRP抗原結合的聯合捕獲抗體。復合物聚積在包被膜的T線區，受到光源激發釋發出相應波長的發射光，通過熒光檢測系統捕捉的光信號轉化為數字信號，從而可用于準確定量的快速免疫檢測中與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明所述的高效定量檢測C反應蛋白（CRP）的酶聯免疫試劑盒，采用抗CRP的多克隆抗體和抗CRP的單克隆抗體兩種抗體聯合作為捕獲抗體，以特殊的抗CRP的單克隆抗體作為檢測抗體，這種試劑盒具有特異性強、檢測范圍更低、靈敏度高，靈敏度可達200pg/ml（對照組檢測值<效價檢測值的一半），而常規CRP檢測試劑盒檢測范圍的最低檢測值是3ug/ml。附圖說明圖1.抗CRP檢測單抗交叉反應測試；A.蛋白芯片檢測結果顯示該單抗和其它39個靶標無交叉反應；B.交叉反應測試40個靶標列表。圖2.本發明所述的試劑盒的樣本檢測值與醫院檢測值的比較圖。圖3.時間分辨熒光側向層析試紙條的結構。具體實施方式下面通過說明書附圖和具體實施例對本發明進一步具體描述，下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本
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現有常規的方法，所使用的配料或材料，如無特殊說明，均為通過商業途徑可得到的配料或材料。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
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的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。實施例1S1.CRP基因的分泌表達：將如SEQIDNO:1所示的CRP基因序列插入pET28a載體，經測序成功后轉入大腸桿菌，表達產物經SDS-PADG驗證得到單一條帶，經WesternBlotting驗證分泌表達產物與抗CRP單抗特異結合。S2.抗CRP多抗的制備、純化及鑒定：用S1所述的大腸桿菌表達的CRP蛋白免疫SPF級新西蘭兔（廣東省實驗動物中心），免疫三次，每次間隔半個月。最后一次加強免疫三天后，通過心臟采血，血清析出后，先用硫酸銨沉淀法從兔血清中初步純化免疫球蛋白IgG，再用ProteinG/A親和柱進一步純化抗CRP多抗，SDS-PAGE和WesternBlotting鑒定純化的抗體。S3.抗CRP單抗：本發明用作檢測抗體的單克隆抗體和用作聯合捕獲抗體的單克隆抗體均來自于美國瑞博奧生物科技有限公司。美國瑞博奧生物科技有限公司將小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合后得到2株雜交瘤細胞株，分別命名為H16740（該雜交瘤細胞分泌的抗CRP單克隆抗體的貨號119-16740）和H14815（該雜交瘤細胞分泌的抗CRP單克隆抗體的貨號為119-14815）。作為檢測抗體的抗CRP的單克隆抗體為貨號為119-16740的抗體；作為聯合捕獲抗體的單克隆抗體為貨號為119-14815的抗體。本發明在前期篩選檢測抗體時，也用到了其他類型的抗體，如美國瑞博奧生物科技有限公司，貨號為119-16718的抗CRP單克隆抗體，但是該抗體采用芯片法來作交叉實驗時，其特異性并不好，會出現交叉反應。實施例2一、以實施例1所述的聯合捕獲抗體和檢測抗體建立一種檢測CRP的酶聯免疫試劑盒（ELISA），試劑盒的組成如下：1.ELISA酶標板：采用吸附性能好，空白值低，批次穩定的聚苯乙烯板包被捕獲抗體，預先用封閉液處理。2.聯合捕獲抗體：采用實施例1制備的多克隆抗體和篩選的單克隆抗體作為聯合捕獲抗體，每個抗體的包被濃度每孔在0.3~0.5ug之間。3.檢測抗體：將實施例1篩選的檢測抗體進行生物素化，檢測抗體的最佳稀釋濃度為0.1mg/L。4.洗滌液：含0.1%Tween-20的20X濃縮洗滌液。5.標準品：含重組人類CRP蛋白的標準品抗原干粉。6.稀釋液：2瓶用于稀釋樣本的15ml5X濃縮稀釋液D，1瓶用于稀釋抗體和HRP-鏈親和素的15ml5X濃縮稀釋液B。其中，1X濃縮稀釋液D的組成為：加入0.5%BSA,0.1~1%的還原劑的PBS緩沖液；1X濃縮稀釋液B的組成為：加入0.5%BSA，0.05%的吐溫-20的PBS緩沖液。7.200μl300X濃縮HRP-鏈親和素溶液。8.底物：12mlTMB溶液。9.終止液：8ml濃度為0.2M的硫酸溶液。二、所述ELISA試劑盒的操作步驟1.將所有試劑放置室溫條件（18~25℃）下平衡30分鐘，標準品和樣本都設置至少一個重復。2.加入100μl稀釋好的標準品及樣品，蓋上封板膜室溫條件下孵育2.5個小時或者4℃過夜，放置于洗板機洗滌并倒轉微孔板在紙巾上吸干凈。3.加入100μl稀釋好的生物素化的檢測抗體，室溫條件下孵育1個小時。4.放置于洗板機洗滌并倒轉微孔板在紙巾上吸干凈。5.加入100μl稀釋好的HRP-鏈親和素，孵育45分鐘。6.重復4的步驟。7.加入100μlTMB反應30分鐘，再加入50μl終止液終止反應，于酶標儀450nm讀數。8.根據檢測結果得出折線圖公式，計算待測血清的CRP含量。三、所述ELISA試劑盒的質量分析1.ELISA試劑盒的靈敏度：參照實施例1中的操作步驟，分別用聯合抗體及單抗包被，在微孔板中依次加入1800、1200、900、600、200、66.67、22.22、7.41pg/ml的CRP抗原蛋白，設兩個重復求平均值，所得檢測結果如下，可知采用聯合抗體包被其檢測靈敏度可達200pg/ml（對照組檢測值<效價檢測值的一半），而采用單抗包被的靈敏度只有600pg/ml，見表1。常規CRP檢測試劑盒檢測范圍的最低檢測值是3ug/ml。表1抗原（pg/ml)聯合抗體包被單抗包被18001.0470.91512000.7640.4789000.6440.3436000.4610.2142000.1930.09866.670.0870.08122.220.0670.06600.0680.0672.ELISA試劑盒檢測抗體的特異性：采用RayBiotech公司出品的人類蛋白芯片，加入抗CRP檢測單抗，所得結果如圖1所示，可知抗體與其它抗原蛋白無交叉反應。四、所述ELISA試劑盒的應用與改良CRP定量檢測試劑盒針對同一批臨床樣本（59例病人血清）共做了兩次檢測，其中第一次只采用抗CRP單克隆抗體作為捕獲抗體包板，檢測結果如下表2所示。表2OD450值樣本檢測值（ug/ml)醫院檢測值(ug/ml)1.0148.398.842.3121.351111.23310.5812.42.11519.466.31.0548.7910.22.43222.571621.17910.0411.21.48613.1114.12.25920.841161.19410.197.942.22420.4981.30.8176.425.11.54313.6813.41.69315.1819.32.45522.82072.32321.481841.80316.28202.1820.0541.90.988.057.292.60724.322411.76315.88221.25510.88.262.64424.691970.9798.048.181.17610.0110.20.9798.048.841.44612.7117.41.54913.7415.21.1439.688.71.56213.8714.11.37912.04131.3751221.61.44112.6614.61.9617.8534.81.21810.4311.21.97317.9844.31.2210.4512.81.0738.9812.21.63514.629.21.23510.6131.71315.3818.22.22220.4766.52.22520.592.60.6975.225.142.23620.61781.79416.1917.71.9617.8542.51.80416.29381.37712.0210.91.82416.4918.31.83716.6230.82.28121.0667.50.8266.517.371.0098.347.230.7035.285.591.62514.511.31.39312.1812.32.26620.9176.22.00318.2836.9從上表2中可以看出：大多數檢測值與醫院檢測值沒有相關性。于是針對第一次的結果對實驗進行了調整，采用聯合抗體（即實施例1篩選的抗CRP的多克隆抗體和抗CRP的單克隆抗體混合在一起作為聯合捕獲抗體）的方式進行包板，這種試劑盒對59例病人血清的檢測結果如下表3和圖2所示。表3OD450值樣本檢測值（ug/ml）醫院檢測值（ug/ml）0.58516.368.841.135164.741110.57215.912.40.90487.7166.30.51213.8310.21.151336.971620.64818.6511.21.03435.6214.11.037143.111160.53414.587.941135.4981.30.368.955.10.70820.9313.40.95431.619.31.0542932071.095311.281841.00233.97201.06374.3241.90.43811.47.291.053366.232410.85827.16220.5715.838.261.158340.291970.46112.148.180.5816.1810.20.4712.448.840.7422.217.40.64618.5715.20.48512.938.70.76423.1714.10.77623.66130.67319.5921.60.72321.5214.61.12840.7834.80.53314.5511.20.8654.4944.30.61417.412.80.51513.9412.20.97832.7729.20.69120.27130.78924.218.20.71363.3866.50.832104.0992.60.260.5965.140.63873.11780.929.0517.70.81550.5842.50.85153.7380.53914.7510.90.77523.6218.30.96131.9430.70.74166.7167.50.3779.487.3743211.217.230.42510.985.590.47312.5411.30.63618.212.31.757288.8976.20.78748.2336.9由表3和圖2的結果可以看出，經調整后大部分檢測值都在標準曲線范圍內，相關系數是0.904，匹配度高。圖2采用樣本檢測值作為X軸，醫院檢測值作為Y軸繪制散點圖，生成趨勢線和公式，并得R平方值為0.904，結果表明，用聯合抗體的方式，檢測的準確度更高。實施例3以實施例1篩選的聯合捕獲抗體和檢測抗體建立一種檢測CRP的膠體金免疫層析試劑盒：試劑盒包括多個檢測試紙條，所述試紙條由樣品墊，膠體金標記墊，硝酸纖維素膜（NC膜）和吸水紙組成（見圖3），所述NC膜包被有檢測區和質控區，檢測區包被聯合捕獲抗體，質控區包被抗鼠IgG二抗；所述膠體金標記墊包被檢測抗體；所述膠體金標記墊的制備過程為，以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備活化的膠體金溶液，將檢測抗體按照100~500ug檢測抗體蛋白每100ul膠體金溶液的比例加入到膠體金溶液中，攪拌室溫反應2小時，離心洗滌2次，沉淀用膠體金溶液復溶至50ml，按0.8ug/cm2的用量涂覆在膠體金標記墊上，室溫干燥備用。硝酸纖維素膜的制備過程為：將聯合捕獲抗體（抗CRP的單抗和多抗）和抗鼠IgG用包被液調整至濃度為0.5至1mg/ml，將抗鼠IgG用包被緩沖液PBS調整至濃度為0.8mg/ml，按膜包被液量為20ug/30cm2至25ug/30cm2的用量將聯合捕獲抗體噴到NC膜的檢測區，分別按膜包被液量為25ug/30cm2至30ug/27cm2的用量將抗鼠IgG噴到質控區，過夜冷凍干燥，加入干燥劑封存備用。在底板上依次相互搭接地粘貼樣品墊，膠體金標記墊，NC膜和吸水紙，按照要求切割成適當寬度的試紙條形成試劑盒。實施例4以實施例1所述的聯合捕獲抗體和檢測抗體建立一種檢測CRP的時間分辨熒光免疫層析試劑盒，所述試劑盒包括多個檢測試紙條，所述試紙條由樣品墊，熒光微球包被的釋放墊，硝酸纖維素膜（NC膜）和吸水紙組成（見圖3）。其中，樣品墊用于加樣（血清或全血）；釋放墊中含過量的抗CRP檢測抗體和熒光微球的復合物；NC膜上有兩道線：檢測線，又稱T線，含定量的聯合捕獲抗體；對照線，又稱C線，含定量的抗鼠IgG二抗。本試劑盒采用時間分辨熒光微球作為標記載體，將檢測抗體標記于熒光微球上，利用側向層析技術，將標記抗體的微球干燥于釋放墊上，同時在NC膜上噴制相應的聯合捕獲抗體，利用雙抗體夾心法檢測血清或全血中的CRP。當將含有待測抗原（CRP）的樣品滴在加樣區，待測樣品中的CRP與結合墊中的熒光納米微球標記的抗CRP檢測抗體結合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區后，與檢測線上固定的聯合捕獲抗體結合，形成微粒-抗體-抗原的抗體夾心復合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標記物繼續向前層析，與固定在質控線二抗結合。反應結束后，用紫外光源（365nm）對檢測區掃描檢測，檢測線和質控線上熒光納米微球發出高強度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質中自然發生的短壽命熒光（1~10ns）全部衰變后，再測量微球的特異性激發熒光，這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。SEQUENCELISTING<110>廣州瑞博奧生物科技有限公司<120>一種高效定量檢測C反應蛋白的免疫學試劑盒<130><160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>675<212>DNA<213>CRP基因序列<400>1atggagaagctgttgtgtttcttggtcttgaccagcctctctcatgcttttggccagaca60gacatgtcgaggaaggcttttgtgtttcccaaagagtcggatacttcctatgtatccctc120aaagcaccgttaacgaagcctctcaaagccttcactgtgtgcctccacttctacacggaa180ctgtcctcgacccgtgggtacagtattttctcgtatgccaccaagagacaagacaatgag240attctcatattttggtctaaggatataggatacagttttacagtgggtgggtctgaaata300ttattcgaggttcctgaagtcacagtagctccagtacacatttgtacaagctgggagtcc360gcctcagggatcgtggagttctgggtagatgggaagcccagggtgaggaagagtctgaag420aagggatacactgtgggggcagaagcaagcatcatcttggggcaggagcaggattccttc480ggtgggaactttgaaggaagccagtccctggtgggagacattggaaatgtgaacatgtgg540gactttgtgctgtcaccagatgagattaacaccatctatcttggcgggcccttcagtcct600aatgtcctgaactggcgggcactgaagtatgaagtgcaaggcgaagtgttcaccaaaccc660cagctgtggccctga675當前第1頁1 2 3