一種石墨烯三維微電極陣列芯片、方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種石墨烯三維微電極陣列芯片、制備方法以及應用，本發明提供的石墨烯三維微電極陣列芯片可應用于生物大分子、細胞或組織檢測領域，尤其是應用于細胞、組織的電生理檢測。
【背景技術】
[0002]微電極陣列芯片是利用微加工工藝將多個微米級別的電極集成在一塊芯片上用于生物信號檢測的一種傳感器。微電極陣列芯片可以同時檢測溶液中生物大分子的電學信號，可以檢測細胞和組織的生物電信號，或用來對細胞和組織進行電刺激。
[0003]目前，微電極陣列芯片的電極材料多般為金、鉑等金屬，但它們不透明的性質不能兼容細胞生物學中廣泛使用的倒置顯微鏡。利用這樣的微電極陣列芯片進行細胞或組織片的電生理活性檢測時，需要使用配有水浸式物鏡的正置顯微鏡，存在操作不便而且檢測過后的樣品不能繼續培養只能丟棄等問題。目前基于良好的導電性和透明度，摻錫氧化銦(ΙΤ0)成為最主要的透明導電材料，可以用來制作微電極陣列芯片。然而與金、鉑金屬微電極相比，ΙΤ0微電極存在電化學阻抗高，在溶液中的電化學穩定性差等缺點。開發高性能的透明的微電極陣列芯片是當前亟待解決的一個問題。新興的熱點材料石墨烯擁有高導電性、高透光性、高機械強度、良好的電化學穩定性和很好的生物相容性等優異性質，開始被用來制作微電極陣列，并且能檢測到神經元的動作電位(Xiaowei Du,Lei Wu，Ji Cheng,Shanluo Huang，Qi Cai，Qinghui Jin，Jianlong Zhao，Graphene microelectrode arraysfor neural activity detect1n ,J B1l Phys(2015)41:339-347)。當前，平面的石墨稀微電極陣列其電極位點不能與柔軟的細胞和組織形成緊密接觸，影響了電生理檢測的靈敏度。最近的理論研究表明:單層石墨烯在基體上的形態不受基體硬度及基體波幅變化的影響，表現為完全貼合基體表面的形態特性(LitingX1ng, YuanwenGa0.Surface roughnessand size effects on the morphology of graphene on a substrate.Physica E:Low-dimens1nal System Systems and Nanostructures.2013，172( 1-2): 154-161)。基于此，本申請擬提出一種制作石墨烯三維微電極陣列芯片、方法及應用，以期進一步提高微電極陣列的性能。
【發明內容】
[0004]為了克服現有石墨烯微電極陣列芯片平面的電極位點不能和柔性的細胞或組織形成緊密接觸的缺點，并增大電極位點的比表面積，本發明的目的在于提供石墨烯三維微電極陣列芯片、方法及其應用，具體可應用于細胞和組織的電生理信號檢測。
[0005]本發明的目的通過以下措施來達到:所述的芯片包括透明的石墨烯三維微電極陣列區域和外圍金電極引線引腳區域兩部分(圖1);所述的芯片以硅、石英或硼硅玻璃為基底，在微電極陣列區域外利用lift-off工藝制作金電極引線和引腳(圖2.a);微電極陣列區域內制作SU-8或PI微柱陣列(圖2.b，柱高和直徑之比約為0.3)，再將石墨烯/聚甲基酸甲酯薄膜轉移至微電極陣列區域，與基底上預先制作的金電極引線形成良好的歐姆接觸(圖
2.c)，然后以AZ4620光刻膠作為石墨稀圖形化的掩模層，用氧等離子體(Oxygen Plasma)對石墨烯進行刻蝕(圖2.d)，刻蝕出的石墨烯包括彎曲成三維丘型的微電極位點和二維電極引線兩部分;最后利用PI光刻膠在圖形化的石墨烯表面和金電極引線表面制作絕緣層，暴露出三維丘型的石墨烯微電極位點和金電極引腳(圖2.e)。
[0006]本發明的優點在于可同時制作出幾個到數十個石墨烯三維微電極陣列位點;光刻膠微柱具有光滑的邊緣，能夠頂起石墨烯薄膜而不損壞石墨烯薄膜;細胞和組織能夠包裹住丘形狀(或稱為丘陵狀，下同)的石墨烯微電極位點，提高微電極檢測微弱電信號的能力；利用石墨烯優異的電學性質、高透光性、優良的電化學穩定性和生物相容性制作的透明微電極陣列芯片方便與倒置顯微鏡結合使用，使得許多生物成像手段如高分辨率熒光成像能和電生理檢測聯用。
[0007]綜上所述，本發明涉及一種石墨烯三維微電極陣列芯片、方法及其應用。其特征在于所述的利用負性光刻膠制作微柱陣列，在微柱陣列上覆蓋單層石墨烯薄膜制作出微電極陣列;所述的微電極芯片包括透明的石墨烯三維電極陣列區域和外圍金電極引線引腳兩部分。微電極位點為三維凸起。三維的微電極丘形狀微電極結構利于剛性的微電極位點與柔軟的細胞或組織形成緊密的電學耦合，加上石墨烯優異的電學特性，能夠提高微電極陣列的電生理檢測靈敏度。另外，制作在透明基底上的石墨烯三維微電極陣列便于用倒置顯微鏡進行觀察，便于多種細胞顯微成像方法的應用以及結合微流控芯片使用。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發明石墨烯三維微電極陣列芯片示意圖，a)為芯片實物圖，b)為石墨烯三維微電極陣列區域。
[0009]圖2為本發明石墨烯三維微電極陣列芯片制作工藝流程圖，(a)用lift-off工藝制作金電極引線和引腳，(b)用SU8或PI制作微柱陣列，(c)石墨烯轉移，(d)石墨烯圖形化，(e)SU8或PI制作絕緣層。
[0010]圖3為本發明丘形狀石墨烯微電極位點電化學阻抗譜(選取了三個微電極位點)。
[0011]圖4為本發明丘形狀石墨烯微電極位點循環伏安掃描曲線(選取了三個微電極位點)。
[0012]圖5為本發明用倒置顯微鏡觀察培養于石墨烯三維微電極陣列芯片上的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)，并用多通道信號檢測系統檢測細胞的自發動作電位。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0014]實施例1
[0015]石墨烯三維微電極芯片制作工藝流程如圖2所示，具體如下:
[0016](1)清洗基片:使用Phiranha溶液清洗硅片或石英片或硼硅玻璃片(如Prex7740)，再用去離子水沖洗干凈，氮氣吹干，氧等離子體處理5分鐘；
[0017](2)Lift_off工藝制作外微電極陣列區域外電極引線和引腳:在基片上旋涂AZ4620，光刻工藝進行圖形化，然后濺射金屬層(鈦/金)，用丙酮去除光刻膠，留下金屬圖層。(圖2.a)
[0018](3)三維微柱陣列制作:旋涂負性光刻膠(硅片用SU83005，石英片和Prex7740硼硅玻璃用PI 7510),控制轉速300r/min，光刻顯影后，經過固化，形成微柱陣列。(圖2.b)
[0019](4)石墨烯轉移:使用化學氣相沉積制備的單層石墨烯薄膜，實際為“銅/石墨烯/聚甲基酸甲酯”復合膜;該復合薄膜用過硫酸銨浸泡腐蝕銅箔，待銅被完全腐蝕后，留下支撐層”石墨烯/聚甲基酸甲酯”薄膜;用去離子水漂洗薄膜，再將完整的薄膜轉移到三維微柱陣列上，覆蓋陣列并與金電極引線接觸;靜置一段時間后，用85°C烘箱烘30分鐘，然后在丙酮溶液中浸泡去除聚甲基酸甲酯;最后用乙醇、去離子水依次清洗基底。(圖2.c)
[0020](5)制作石墨烯微電極:旋涂AZ4620P光刻膠，通過光刻和氧等離子體刻蝕制作石墨烯圖形，然后用丙酮去除光刻膠，依次用乙醇、去離子水對基底進行清洗。(圖2.d)
[0021](6)制作電極絕緣層:旋涂SU83005，進行光刻、顯影，暴露出石墨烯微電極位點和金電極引腳。(圖2.e)
[0022]實施例2
[0023]石墨烯三維微電極性能檢測方法
[0024]電化學阻抗和