清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及血液凈化系統技術領域，特別是一種清除血液膽紅素的分子印跡吸附 劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 膽紅素是血紅素代謝降解的產物，是一種內源性毒素，在正常的生理條件下，血清 蛋白與膽紅素結合，幫助膽紅素轉移至肝臟后得以排泄。當肝功能失常時，膽紅素代謝出現 障礙，致使其在血液中積累，血液中過高濃度的膽紅素會，導致梗阻性黃疸，甚至發生急性 腎功能衰竭。正常血清總膽紅素濃度為當血清膽紅素濃度為1.7~17.1ymol/L(0.1~lmg/ dL)，高水平膽紅素具有干擾細胞代謝，刺激皮膚神經，抑制心臟傳導系統，在腎小管中形成 栓塞而引起腎功能障礙等毒性作用，嚴重者可導致多器官衰竭。體內膽紅素水平的高低一 般與肝細胞的病變程度呈正相關關系。因此，清除病患者血液中過高濃度的膽紅素是臨床 急待解決的難題之一。
[0003] 對于重型肝炎或肝衰竭患者來說，其自身已基本失去了代謝膽紅素的能力，僅用 一般的內科臨床處理難以清除體內膽紅素，故常采用血液凈化的方式除去致病物質，從而 達到臨床治療目的。血液灌流和血漿吸附可以有效地治療黃疸等高膽紅素血癥，有效地清 除病患者體中高濃度的膽紅素，然而制備血液相容性好、吸附性能強、高特異性的吸附材料 則是發展血液灌流技術的關鍵所在。
[0004] 分子印跡聚合物在血液凈化領域的應用很少，國內的南開大學采用過傳統的包埋 法制備了具有對血液膽紅素吸附的分子印跡吸附劑(CN104174385)，中北大學高保嬌教授 課題組的研究《表面印跡法制備膽紅素分子印跡材料及其識別性能》、《以交聯聚乙烯醇微 球為基質的膽酸表面分子印跡材料的制備及分子識別性能的研究》。但是，傳統包埋法分子 印跡聚合法制備的印跡聚合物顆粒較大，且不夠均勻，對模板分子包埋過深或過緊，洗脫困 難;而且由于孔道深，模板分子擴散阻力大，傳質速度慢，不易與識別位點結合。因此，傳統 的包埋法分子印跡聚合法制備的吸附劑吸附率比較低，難以滿足臨床應用所需的性能。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的不足，本發明提供一種制備清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑方 法。
[0006] -種清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑的制備方法，包括步驟：
[0007] a.載體接枝改性:對多孔吸附載體加入引發劑后氮氣保護下引發15min，再滴加接 枝單體試劑，在45°C~70°C溫度下攪拌回流反應2h~6h，待反應完畢后，取出反應物抽濾， 用丙酮和蒸餾水洗去未反應的單體和引發劑；
[0008] b.模板分子印跡:將步驟a的改性后的多孔吸附載體置于生理鹽水中，浸泡30min 左右，吸干表面水分，然后加入富含膽紅素的人血漿，在37°C下避光恒溫震蕩2~5h，取出抽 濾后以O.lmol/L的PBS溶液清洗表面的血漿至平衡，接著將多孔吸附載體轉移至裝有乙醇 溶液的反應容器中，加入交聯劑并調節pH至7~8,在30°C~60°C溫度下攪拌4h~12h;
[0009] C.模板分子洗脫:交聯反應結束后，用NaOH和乙醇的混合溶液沖洗除去模板分子， 抽濾后得到膽紅素表面分子印跡吸附劑。
[0010]其中步驟a所述多孔吸附載體材料是纖維素、聚苯乙烯二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯 類、聚乙烯醇、殼聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺類或硅膠。所述多孔吸附載體為球型，比表面積 為500~1300m2/g，微球大小為100~ΙΟΟΟμπι，孔徑大小為3~60nm。所述接枝單體試劑是含 有堿性基團的烯烴單體，優選為丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯或N-(3-甲氨基丙基）甲基丙烯 酰胺。所述引發劑是硝酸鈰銨、過硫酸鹽類引發劑、偶氮類引發劑、氧化還原類引發劑或有 機過氧化物引發劑。
[0011]步驟b所述交聯劑是含有疏水鏈段的二縮水甘油醚類，優選為雙酸A二縮水甘油醚 或1，6-己二醇二縮水甘油醚。
[0012] 步驟C所述混合溶液是0. lmol/L的NaOH溶液與乙醇按體積比1:4~4:1混合而成。
[0013] 還提供了以上述制備方法所得的產物:一種清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑， 其印跡位點分布于多孔吸附載體表面或非常接近表面。所述多孔吸附載體表面還接枝有對 膽紅素具有吸附能力的支鏈。
[0014] 上述清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑可應用于血漿吸附或血液灌流。
[0015] 本發明以膽紅素蛋白結合物為印跡模板分子，選擇具有合適孔徑、高比表面積、生 物相容性良好的多孔吸附載體，通過接枝側鏈、印跡交聯和洗脫模板分子制備成一種清除 血液膽紅素的分子印跡吸附劑，選用含有堿性基團的烯烴類接枝單體和含有疏水鏈段的縮 水甘油醚類交聯劑可增加吸附劑對膽紅素蛋白結合物分子的作用位點，由此制備而成的吸 附劑具有對膽紅素蛋白結合物的靜電和疏水作用，識別膽紅素類物質并對其特異性吸附， 這與抗體抗原結合的作用類似，吸附性能優良且具有良好的生物相容性。本發明所述方法 制備的吸附劑可用于血液灌流或血漿吸附治療高膽紅素血癥。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1:將lml已沉實的多孔聚乙烯醇微球置于50ml三口燒瓶中，加入30ml 50% 乙醇溶液和〇.〇5g硝酸鈰銨后氮氣保護下引發15min，再滴加0.20g單體丙烯酸N，N-二乙基 氨基乙酯，在60°C溫度下攪拌回流反應3h。待反應完畢后，取出反應物抽濾，用丙酮和蒸餾 水清洗未反應的單體和引發劑。
[0017] 將改性后的多孔聚乙烯醇微球置于50ml錐形瓶中，用生理鹽水浸泡30min左右，吸 干表面水分，加入l〇ml富含膽紅素的人血漿，在37°C溫度下，避光恒溫震蕩3h，取出抽濾后， 用0. lmol/L的PBS溶液清洗表面的血漿至平衡，接著將微球轉移至裝有10ml、濃度50 %的乙 醇溶液的錐形瓶中，加入0.10g 1，6_己二醇二縮水甘油醚，用4%的NaOH調節pH至8,在35°C 溫度下攪拌4h~12h，反應結束后用0. lmol/L的NaOH溶液與乙醇按體積比1:4混合成沖洗 液，以除去膽紅素蛋白結合物，抽濾后得到清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑(吸附劑1)。
[0018] 實施例2:將2ml已沉實的多孔殼聚糖微球置于50ml三口燒瓶中，加入30ml 50%乙 醇溶液和〇.〇2g過氧化苯甲酰后氮氣保護下引發15min，再滴加0.40g單體丙烯酸N，N-二乙 基氨基乙酯，在50°C溫度下攪拌回流反應4h。待反應完畢后，取出反應物抽濾，用丙酮和蒸 餾水清洗未反應的單體和引發劑。
[0019] 將改性后的多孔殼聚糖微球置于50ml錐形瓶中，用生理鹽水浸泡30min左右，吸干 表面水分，加入20ml富含膽紅素的人血漿，在37°C溫度下，避光恒溫震蕩2h，取出抽濾后，用 0. lmol/L的roS溶液清洗表面的血漿至平衡，接著將微球轉移至裝有20ml、濃度50%的乙醇 溶液的錐形瓶中，加入〇. 20g雙酸A二縮水甘油醚，用4%的NaOH調節pH至7.5，在40°C溫度下 攪拌5h，反應結束后用0. lmol/L的NaOH溶液與乙醇按體積比2:3混合成沖洗液，以除去膽紅 素蛋白結合物，抽濾后得到清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑(吸附劑2)。
[0020] 實施例3:將5ml已沉實的多孔聚苯乙烯二乙烯苯苯微球置于100ml三口燒瓶中，加 入60ml 50%乙醇溶液和0.05g過硫酸鉀后氮氣保護下引發lOmin，再滴加 l.Og單體N-(3-甲 氨基丙基）甲基丙烯酰胺，在60°C溫度下攪拌回流反應3h。待反應完畢后，取出反應物抽濾， 用丙酮和蒸餾水清洗未反應的單體和引發劑。
[0021] 量取2ml的改性后的多孔苯乙烯二乙烯苯微球置于50ml錐形瓶中，用生理鹽水浸 泡30min左右，吸干表面水分，加入20ml富含膽紅素的人血漿，在37 °C溫度下，避光恒溫震蕩 2h，取出抽濾后，用0.1M的PBS溶液清洗表面的血漿至平衡，接著將微球轉移至裝有20ml、濃 度50%的乙醇溶液的錐形瓶中，加入0.20g 1，6-己二醇二縮水甘油醚，用4%的NaOH調節pH 至8，在45°C溫度下攪拌4h，反應結束后用0. lmol/L的NaOH溶液與乙醇按體積比1:1混合成 沖洗液，以除去膽紅素蛋白結合物，抽濾后得到清除血液膽紅素的分子印跡吸附劑(吸附劑 3) 〇
[0022] 實施例4:將lml已沉實的多孔纖維素微球置于50ml三口燒瓶中，加入30ml 50%乙 醇溶液和0.04g過硫酸銨后氮氣保護下引發15min，再滴加0.20g單體N-( 3-甲氨基丙基）甲 基丙烯酰胺，在60°C溫度下攪拌回流反應3h。待反應完畢后，取出反應物抽濾，用丙酮和蒸 餾水清洗未反應的