一種d-二聚體定量檢測的磁微粒化學發光微流控芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫體外診斷領域，具體涉及一種D-二聚體定量檢測的磁微粒化學發光微流控芯片，能夠在短時間內實現對生物樣品中D-二聚體的定量檢測，具有操作簡單，靈敏度高，低成本等特點。
技術背景
[0002]纖維蛋白溶解系統(fibrinolysis system)是人體最重要的抗凝系統，由4種主要部分組成:纖溶酶原(口138111；[1^611)、纖溶酶原激活劑(。138111；[叫611 ac t i vator，如t_PA，u_PA)、纖溶酶(plasmin)、纖溶酶抑制物(plasmin activator inhibitor, PA1-1，antiplasmin)。當纖維蛋白凝結塊(fibrin clot)形成時，在tPA的存在下，纖溶酶原激活轉化為纖溶酶，纖維蛋白溶解過程開始，纖溶酶降解纖維蛋白凝結塊形成各種可溶片段，形成纖維蛋白產物(FDP)，FDP由下列物質:X-寡聚體(X-oligomer)、D-二聚體(D-Dimer)、中間片段(Intermediate fragments)、片段E(Fragment E)組成。其中，X-寡聚體和D-聚體均含D-二聚體單位。
[0003]纖溶蛋白降解產物中，唯D-二聚體交聯碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。只要機體血管內有活化的血栓形成及纖維溶解活動，D-二聚體就會升高。在生理狀態下，人體正常D-二聚體的水平一般在200yg/L以下，機體保持著凝血與纖溶動態平衡，以保證纖維蛋白及時形成和及時清除。心肌梗死、腦梗死、肺栓塞、靜脈血栓形成、手術、腫瘤、彌漫性血管內凝血、感染及組織壞死等均可導致D-二聚體升高。因此，理論上，D-二聚體的定量檢測可反映藥物的溶栓效果、也可用于診斷、篩選新形成的血栓。
[0004]目前，用于D-二聚體的定量檢測方法中應用較多的主要為:酶聯免疫吸附法(ELISA),乳膠顆粒凝集法(LATEX)、免疫過濾膠體金染色法、雙抗體RBC凝集法和放免法等。臨床最常用是:ELISA、LATEX和免疫過濾膠體金染色法，其中LATEX法測定速度快，但敏感度不如ELISA法;ELI SA法敏感度高，但檢測時耗時較長。中國專利(201110051367.2)公開了一種D-二聚體時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其制備方法，該試劑盒由下述成分組成:1)D-二聚體校準品；2)D-二聚體單克隆抗體包被的微孔板;3)銪元素標記的另一株D-二聚體單克隆抗體;4)洗滌液;5)增強液;6)分析緩沖液。該試劑盒采用銪元素標記抗體，銪元素屬于鑭系稀土金屬元素，價格比較昂貴，且銪熒光壽命lms，在水中不穩定，需要額外添加增強劑才能獲得穩定的熒光。
[0005]近年來，生物分析技術領域得到了快速的發展，出現了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技術是其中最活躍的一支，在科研和實際應用領域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測平臺，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優點，已經在眾多領域中得到了廣泛的應用，尤其是在免疫分析領域已嶄露頭角。
[0006]表面功能化的磁性微球作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細胞，已經被廣泛地應用于各種生化指標的臨床診斷等領域。而微流控芯片系統具有快速、高效、集成化等特點，兩者相結合，將成為一種新型的高性能檢測方法，以解決當前檢測方法中存在的靈敏度低，檢測過程復雜，難以實現微量樣本檢測的問題，有望進一步推動臨床檢測儀器向便攜化和微型化發展。
[0007]免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測方法，目前這種綜合性的檢測方法的主要難點表現為:I)液體在芯片內部微流動的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內部設置多個微栗和微閥，使得微流控體系變得更加復雜化;2)反應體系的混合不充分，導致反應不充分;3)集成化程度不高，導致非特異性背景高。
【發明內容】
[0008]為彌補現有技術的不足，本發明旨在提出一種D-二聚體定量檢測的磁微粒化學發光微流控芯片，檢驗人員只需經過簡單操作，即可在15分鐘內實現樣品中D-二聚體濃度的定量檢測。檢測結果靈敏度高，準確可靠，重復性好。
[0009]本發明所述一種D-二聚體定量檢測的磁微粒化學發光微流控芯片，所述微流控芯片結構主要包括蓋片(I)和底片(11);其中蓋片(I)上的加樣口(2)，樣本液流通道(6)，第一生物標記物存儲池(4)，微混合器(7)，過渡區(10)依次連接;底片(11)上的過濾器(12)，反應池(13)，清洗池(14)，檢測池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接，底片(11)上的檢測池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲池(16)和發光液存儲池(17)連接；
[0010]所述第一生物標記物存儲池(4)中存儲酶或發光劑標記的抗D-二聚體抗體溶液；所述清洗液存儲池(16)，發光液存儲池(17)中存儲清洗液、發光基底液;所述反應池(I 3)中包被磁顆粒標記的抗D-二聚體抗體;所述蓋片(I)和底片(11)用膠帶(20和22)密封組裝;所述第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)、發光基底液存儲池(17)和檢測池(I5)中存儲預封裝試劑；
[0011 ]所述第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)、發光基底液存儲池(17)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述微流控芯片的過濾器(12)由一個具有固定形狀的腔體和濾血膜組成；所述過濾器濾血膜材料為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或Cy toSep 膜等。
[0012]具體地，所述微流控芯片的第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)和發光液存儲池(17)的體積為10?500yL，為液囊或腔體。
[0013]優選地，微流控芯片的第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)和發光液存儲池(17)的體積為1?300yL。
[0014]具體地，所述微流控芯片的微混合器(7)是寬度為20?300μπι，深度為10?ΙΟΟμπι的蛇形，折線形或方波形結構。
[0015]優選地，所述微混合器為寬150μπι，深度為50μπι的方形結構，在外部壓力作用下，可使樣本和試劑充分混合，提高反應效率。
[0016]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為管狀通道或矩形的毛細管微通道，允許微液體流進或通過。
[0017]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為管狀通道，直徑為0.5?10mm。
[0018]優選地，所述微流控芯片的反應池(13)為管狀通道，直徑為5mm，進一步優選2mm或Imm0
[0019]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為矩形通道，寬為0.1?5mm，深度為0.01?2mm，長為5 ?40mm ο
[0020]優選地，所述微流控芯片的反應池(13)為矩形通道，寬為0.3?2mm，深度為0.2?1mm，長為5 ?20mm ο
[0021]具體地，所述磁顆粒為核殼型的超順磁性顆粒，磁核為Fe3(k或γ-Fe203化合物，夕卜殼為聚苯乙稀，磁顆粒粒徑為0.1?ΙΟμπι。
[0022]優選地，磁核為Fe3(k化合物，且磁顆粒粒徑為I?3μηι，更優選粒徑為2.0μηι的磁顆粒。
[0023]具體地，所述加樣口(2)的加樣體積為5?200μ1，優選10yL，進一步優選50yL，再進一步優選10yL。
[0024]具體地，所述蓋片(I)上還有空氣栗(3)和氣流微通道(5)，按壓空氣栗(3)使氣流通過氣流微通道(5)驅動樣本通過樣本液流通道(6)。
[0025]具體地，本發明所述微流控芯片的過濾器主要包括腔體和濾血膜，所述腔體體積為樣本體積的3?1倍，優選腔體體積為樣本體積的4?6倍。
[0026]具體地，本發明所述微流控芯片底片中過濾器內的濾血膜材料可以為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或CytoS印膜等，作為優選以玻璃纖維膜作為濾血膜。
[0027]本發明所述微流控芯片的制備方法如下:
[0028]步驟I)酶或發光劑標記抗D-二聚體抗體，磁顆粒標記抗D-二聚體抗體，這兩種抗體可同一種抗體或不同種類抗體；
[0029]步驟2)將酶或發光劑標記抗體溶液放入蓋片的第一生物標記物存儲池中，密封，將磁顆粒標記抗體溶液放入底片的反應池，干燥，將清洗液和發光基底液分別注入清洗液存儲池和發光液存儲池中，密封，用膠帶(20和22)密封蓋片和底片，并組裝形成一完整的微流控芯片。
[0030]本發明所述微流控芯片，各功能區之間通過微通道和微結構進行銜接，內部形成一個完整的液流和氣流系統。
[0031]本發明所述微流控芯片蓋片和底片內的微通道和微結構的加工工藝包括模塑法、熱壓法、激光刻蝕法和軟光刻法等，本發明的實施例中優選模塑法來制作微流控芯片，可有效降低檢測成本。
[0032]本發明所述微流控芯片蓋片和底片內除上述主要微通道和微結構外還有許多透氣孔，用于排除液體流動過程中產生的氣泡，同時還有用于組裝固定的讓位孔和立柱。
[0033]本發明所述微流控芯片蓋片上的空氣栗(3)主要是通過氣流通道(5)傳遞壓力，主要作用是用于樣本和第一生物標記物的混合，提高一級孵育效果。
[0034]本發明所述微流控芯片的氣流通道尺寸為0.1?ΙΟΟμπι，進一步優選2?50μηι。
[0035]本發明所述微流控芯片蓋片的過渡區是蓋片和底片連接