一種交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物大分子分離介質的制備方法，尤其涉及一種交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，生物技術的發展非常迅速。運用基因工程、蛋白質工程、發酵工程等生物技術，已能設計、制造、生產人們急需的多種蛋白質。和其它生物產品的生產過程一樣，蛋白質的生產過程一般也分為上、中、下游過程。上、中游過程是運用生物技術生產目標產物，下游過程是指對含有目標產物的物料進行處理、分離、純化、加工目標產物，涉及到二十多個單元操作，占整個生產成本的70-80%，其中，層析是一門關鍵技術。由于層析技術具有分離效率高、過程易于放大、易于自動化的特點，其應用也最為廣泛。
[0003]根據不同的保留機制，層析介質分為:凝膠過濾介質、離子交換介質、疏水作用層析介質、親和層析介質等。良好的蛋白分離層析介質一般需滿足以下幾個條件:(1)高度的親水性。以便蛋白能夠與之發生可逆性的吸附；(2)適宜孔徑結構。便于大分子量的活性蛋白擴散進出，通過表面作用或體積排阻實現蛋白質的分離；(3)適宜功能基團密度。使其具有較高的吸附容量。
[0004]現在廣泛應用的蛋白質層析分離介質的骨架一般瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等親水材料的凝膠微球。對于離子交換型層析介質，交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球是應用最為廣泛的分離材料之一。出于商業上的考慮，國內外文獻中有關其羧甲基化瓊脂糖凝膠微球的制備技術的報道并不多，且語焉不詳。其一般制備步驟是:(1)首先制備瓊脂糖微球；(2)將微球交聯，以提高其機械強度和獲得適宜的孔徑結構；(3)在交聯微球上鍵聯羧甲基功能基團。但是上述制備方法中，由于羧甲基化反應須在強堿性條件下完成，使得交聯微球的機械強度和孔徑結構易于發生變化，進而影響羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球分離性能和機械強度。因此，在利用該方法制備交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球時，存在生產過程中羧甲基化反應對微球機械強度和孔徑影響不易控制的缺點，且產品分離性能的穩定性差。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法。
[0006]本發明所述交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法，步驟是:
[0007](1)將瓊脂糖和95%的乙醇按lg:3?8ml的比例加入反應器中，然后按瓊脂糖和NaOH為lg: 1.4?2g的比例加入NaOH，室溫下攪拌12± lh，再按氯乙酸和NaOH為lg:1.4?2.0g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸與總反應液的體積為lg:3?12ml的比例，在溫度20?45°C下反應2?4h ;然后升溫至60?65°C反應8 ± lh，完畢后，用濾紙過濾，收集的沉淀物用95%乙醇洗滌并在80±2°C下干燥24h以上，得到羧甲基化瓊脂糖；其中，所述氯乙酸溶液是按氯乙酸與95%乙醇為lg:l?4ml的比例配制；
[0008](2)按設定量稱取羧甲基化瓊脂糖，加入水中并加熱溶解，配成濃度以g/ml計為3?6%的羧甲基化瓊脂糖溶液，在90±2°C溫度條件下保溫備用；
[0009](3)將含有Span 80的大豆油作為油相加入反應器，其中所述Span 80在大豆油的含量以體積百分比計為4?9%，在90±2°(:下以80(^.min 1轉速攪拌0.5?lh后將步驟⑵制得的羧甲基化瓊脂糖溶液與油相按體積比為1:4?1:10的比例加入油相中，繼續在800r.min 1轉速下攪拌45±5min，然后用冰水浴將反應液冷卻至10?30°C，再在200r.min 1轉速下攪拌20±3min，完畢后，用250目的濾布過濾，收集的沉淀物用95%乙醇洗滌去殘余的油相，沉淀為羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球；按凝膠微球與50%乙醇按體積比為1:10的比例將所述微球置于50%乙醇中貯存，備用；
[0010](4)取步驟(3)貯存的羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球用濾紙過濾去除液體，再按羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球與50%乙醇積比為1:1?4的比例配成反應體系，并按NaOH與反應體系為lg: 10?30ml的比例向該體系中加入NaOH，攪拌反應5?10h ;然后按NaOH與環氧氯丙烷為lg: 1.2?2.0ml的比例在20?45°C下向該體系中緩慢滴加環氧氯丙烷溶液，并使環氧氯丙烷的加入量以體積比計為總反應液體積的4-15%，其中所述環氧氯丙烷溶液是按環氧氯丙烷與95%乙醇為lml:l?3ml的比例配制；滴加完畢后，在45°C溫度條件下反應2?4h，然后升溫至65±5°C反應6?10h，當反應液降至室溫后，用250目的濾布過濾，收集微球并用蒸餾水洗凈，用分樣篩篩分出120?250目的微球樣品，即獲得交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球，將所述微球置于20%乙醇中貯存。
[0011 ] 上述交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法中:所述反應器優選是三口反應瓶。
[0012]上述交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法中:步驟(1)所述氯乙酸和NaOH優選按lg:1.4?1.7g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸與總反應液的體積優選為lg:6?9ml的比例。
[0013]上述交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法中:步驟(3)所述Span 80在大豆油的含量以體積百分比計優選為5?8% ;所述羧甲基化瓊脂糖溶液與油相的體積比為1:5?1:8，最優選為1:5 ;其中羧甲基化瓊脂糖溶液濃度以g/ml計優選為4?6%。
[0014]上述交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法中:步驟(4)所述NaOH與環氧氯丙烷優選按lg: 1.2?2.0ml的比例在30?45°C下向反應體系中緩慢滴加環氧氯丙烷溶液，并使環氧氯丙烷的加入量以體積比計優選為總反應液體積的6?12%。
[0015]本發明公開的交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的制備方法對通常制備交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球的步驟進行了重新組合和調整，產生了意想不到的效果。涉及的技術方案是將瓊脂糖羧甲基化，然后再將羧甲基化瓊脂糖加工成微球，繼而用環氧氯丙烷和微球發生交聯反應，進而制得交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球。應用本發明公開的方法，每一步驟都易于控制，解決了通常制備交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球時，羧甲基化反應對微球機械強度和孔徑影響不易控制的缺點，為羧甲基化瓊脂基糖凝膠微球層析介質分離性能的穩定性提供了保障。實驗證實:本發明方法制備的交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球對牛血清蛋白(BSA)具有良好的吸附能力，在0.1M的鹽酸和0.1M NaOH溶液中浸泡24小時，其形狀沒有發生明顯的變化。預示本發明方法在規模化生產高品質羧甲基化瓊脂基糖凝膠微球產品中具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0016]圖1:羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球實物照片。
[0017]圖2:交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019](1)在500ml的三口燒瓶中，加入25g瓊脂糖和150ml 95%乙醇和40g NaOH，室溫下攪拌12h，然后緩慢滴加氯乙酸25g(先將其溶于50ml 95%乙醇中)，保持反應液的溫度不高于45°C，耗時約90min。然后升溫至65°C反應8h，完畢后，用濾紙過濾，收集的沉淀物用95%乙醇洗滌并在80°C下干燥24h以上，得到羧甲基化瓊脂糖；
[0020](2)稱取4g羧甲基化瓊脂糖，加入100ml水中并加熱溶解，配成濃度為4% (g/ml)的羧甲基化瓊脂糖溶液，在90°C溫度條件下保溫備用；
[0021](3)在 1000ml 三口燒瓶中，加入 500ml 6% (v/v) Span 80 的大豆油，800r.min 1轉速攪拌，升溫至90°C，然后中加入100ml 90°C的4%羧甲基化瓊脂糖(步驟(2)制備)溶液，保持攪拌轉速800r -min Μδπ?η。然后用冰水浴，將反應液迅速冷卻至室溫，再保持轉速200r.min 1攪拌20min。完畢后，用250目的濾布過濾，收集的沉淀物用95%乙醇洗滌去殘余的油相，沉淀為羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球；按凝膠微球與50%乙醇按體積比為1:10的比例將所述微球置于50%乙醇中貯存，備用；
[0022](4)在250ml三口燒瓶中，加入50ml羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球，100ml 50%乙醇和6g NaOH,室溫下，攪拌反應6h。然后緩慢滴加9ml環氧氯丙烷(先將其9ml溶于9ml95%乙醇中)，保持反應液的溫度不高于45°C，耗時約30min。環氧氯丙烷加入完畢后，45°C下反應2h，然后升溫至65°C反應8h。反應液降至室溫后，用250目的濾布過濾，收集微球并用蒸餾水洗凈，用分樣篩篩分出120?250目的微球樣品，即獲得交聯羧甲基化瓊脂糖基凝膠微球，將所述微球置于20%乙醇中貯存。
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