用于分析細胞運動性的設備的制造方法
【專利說明】用于分析細胞運動性的設備
[0001] 本發明設及一種中型流體系統，其用于分析樣品中細胞的運動性，特別是精子樣 品中細胞的運動性。本發明還設及評估樣品中運動細胞的數量和質量的方法，W及從非運 動細胞中取出運動細胞的方法，特別是使用所述中型流體系統從非運動細胞中取出運動細 胞的方法。 現有技術
[0002] 意識到在過去幾十年中男性生育能力下降已經很高，因此產生了分析精子樣品的 需求。特別是，已經知曉樣品中運動精子細胞的濃度是關于評估樣品可育性的最具有預測 性的因素（Tomlinson等人，2013,HumanFertility, 1-19)。目前，用于評定精子樣品中細 胞的數量和運動性的分析通常由專業人員在實驗室環境中完成，并且在現有技術中用于評 估男性生育能力的家庭診斷設備僅在有限范圍內實現。運類家庭診斷設備應該優選易于 使用，并且為了具有用后可丟棄的性質，其應該W低成本購買，而不需要輔助儀器例如顯微 鏡、用于阻抗測量的電極或類似物。
[0003] W02012/126478中記載了一種用于在家中的舒適環境中測試精子樣品的設備。 W02012/126478記載了一種中型流體系統，其能夠基于運動細胞的運動性分離運動細胞， 并允許檢測和定量所述細胞。所述系統包括通過通道與另一分析室流體連通的第一分析 室，其中所述通道具有與所述第一分析室流體連通的進入端口W及與所述另一分析室流體 連通的離開端口，其中所述進入端口的橫截面積大于所述離開端口的橫截面積。每個分析 室還包括固-液分離單元，其界定了面向所述分析室的上游表面和面向流出通道的下游表 面，W便經由所述固-液分離單元允許所述分析室和所述流出通道之間的流體連通。所連 接的分析室允許運動細胞從所述第一分析室移至下一個分析室，從而提供樣品中細胞運動 性的評估。
[0004] W02012/126478還記載了中型流體系統的一個實施方案，所述中型流體系統還 包括界定與調節培養基側相對的樣品應用側的細胞可透過的過濾器（cellperme油le filter)，其中所述細胞可透過的過濾器具有允許運動細胞游動穿過所述過濾器的孔尺寸。 所述細胞可透過的過濾器被描述為將應用到樣品應用側的樣品的液體與存在于或加入到 調節培養基側的調節培養基的混合最小化。因此，提供細胞可透過的過濾器W確保細胞不 通過對流（convection)被從樣品應用側運輸到調節培養基側，W使存在于調節培養基側 的細胞將成為已經通過游動穿過細胞可透過的過濾器而橫穿其的運動細胞。 陽0化]現有技術的設備存在一些缺點，其在評估運動細胞的數量時提供有限的準確度。 特別地，甚至當并入細胞可透過的過濾器時，目前可購得的設備尚不能充分降低，例如非運 動細胞的污染。運進而意味著，非運動細胞可能被包括在細胞運動性的評估結果中。此外， 運動精子細胞穿過流體通道的遷移可能將定量的點的濃度降低到難W檢測的水平。運對于 包括一些串聯連接的分析室的系統來說似乎特別正確。
[0006] 因此，本發明的目標是克服運些缺點并提供一種具有提高的評估準確性并同時符 合可操作的家庭診斷設備的要求的中型流體系統。
【發明內容】
[0007] 本發明的第一個方面設及一種中型流體系統，其包括具有樣品室和分析室的基 體；所述樣品室包括界定樣品應用隔室和調節培養基隔室的細胞可透過的過濾器；
[0008] 所述樣品室具有在所述樣品應用隔室中的樣品入口端口；
[0009] 所述分析室具有進入端口和離開端口；
[0010] 所述調節培養基隔室經由通道與所述分析室的進入端口流體連通；
[0011] 其中所述樣品應用隔室在所述細胞可透過的過濾器的下方并且所述調節培養基 隔室在所述細胞可透過的過濾器的上方。
[0012] 根據本發明的中型流體系統可用于評估樣品中特別是液體樣品中的運動細胞的 數量。通常，將樣品添加至樣品應用隔室，存在于樣品中的運動細胞會從所述樣品應用隔室 游動穿過細胞可透過的過濾器進入存在于調節培養基隔室中的調節培養基中。調節培養基 隔室中的液體可W被移至分析室，在所述分析室中可W對細胞進行分析例如定量。由于運 動細胞與不能穿過細胞可透過的過濾器的非運動細胞分離，因此在分析室中被量化的細胞 是運動細胞。 陽〇1；3]對于本發明，手冊"W冊 1 油oratorymanualfortheExaminationand processingofhumansemen"(第五片反，WorldHealthOrganization, 2010,ISBN978 92 4 154778 9)提供了關于精子細胞的背景信息，并且所述手冊W引用的方式全文納入本文。
[0014] 基體可W由任何合適的材料制成。樣品室可具有任何合適的形狀或尺寸，條件是 樣品室能夠被細胞可透過的過濾器分為兩個單獨的隔室。細胞可透過的過濾器界定調節培 養基隔室和樣品應用隔室，并且因此細胞可透過的過濾器被認為具有分別面向調節培養基 隔室和樣品應用隔室的調節培養基側和樣品應用側。在所述系統的一個設想的用途中，調 節培養基被添加至調節培養基隔室。待分析的樣品被添加至樣品應用隔室。添加調節培養 基和樣品的順序不重要，雖然在一個具體的實施方案中，在將調節培養基添加至調節培養 基隔室之前將樣品添加至樣品應用隔室。因此，樣品應用隔室和調節培養基隔室可W分別 具有任何合適的尺寸。細胞可透過的過濾器通過跨越樣品室界定樣品應用隔室和調節培養 基隔室，使得僅該兩個隔室之間的流體連通（fluidicconnection)通過細胞可透過的過濾 器。細胞可透過的過濾器可W具有任何合適的設計、材料和形狀，其允許待分析的運動細胞 游動穿過所述過濾器，從而允許細胞從樣品應用隔室行進到調節培養基隔室中。具體地，根 據待分離的細胞的尺寸和其它特征，例如，根據細胞的尺寸相對于細胞可透過的過濾器的 孔的尺寸來選擇細胞可透過的過濾器。細胞可透過的過濾器，例如細胞可透過的過濾器的 孔，可包括將運動細胞吸引至其的材料。樣品應用隔室在細胞可透過的過濾器的下方，并且 調節培養基隔室因此在細胞可透過的過濾器的上方。術語"下方"是參照重力場看的，使得 將在從"上方"到"下方"的方向上施加重力。細胞可透過的過濾器可提供樣品隔室在 調節培養基隔室的下方的任何合適的方式跨越樣品隔室。
[0015] 本發明人驚奇地發現，當樣品應用隔室在細胞可透過的過濾器的下方并且調節培 養基隔室在細胞可透過的過濾器的上方時，應用細胞可透過的過濾器的用于將運動細胞與 非運動細胞分離的效果顯著提高。在另一個方面，本發明設及評估樣品中運動細胞的數量 的方法，所述方法包括W下步驟：提供細胞可透過的過濾器；
[0016] 將含有運動細胞的樣品應用在細胞可透過的過濾器的下方；
[0017] 允許樣品中的運動細胞游動穿過細胞可透過的過濾器；
[0018] 檢測已經游動穿過所述過濾器的運動細胞。在一個另外的方面，本發明設及從非 運動細胞中取出運動細胞的方法，所述方法包括W下步驟：提供細胞可透過的過濾器；
[0019] 將含有運動細胞和非運動細胞的樣品應用在細胞可透過的過濾器的下方；
[0020] 允許樣品中的運動細胞游動穿過細胞可透過的過濾器；
[0021] 取出已經游動穿過所述過濾器的運動細胞。一般來說，為本發明的任何方面所描 述的所有變化和實施方案都與本發明的任何其它方面相關，并且實施方案的特征可W自由 組合。
[0022] 本發明的系統或方法可W采用存在于或添加到細胞可透過的過濾器下方的細胞 調節培養基。在本發明的上下文中，"細胞調節培養基"是任何意欲支持樣品中的細胞例如 保持細胞有活力的液體，并且它可W視情況對于特定細胞而言含有例如營養素、鹽、緩沖液 和/或粘度改性劑。同樣地，本發明的系統或方法可W采用存在于或添加到細胞可透過的 過濾器的上方的樣品培養基。"樣品培養基"還可W視情況對于特定細胞而言含有營養素、 鹽、緩沖液和/或粘度改性劑，并且它可W與細胞調節培養基相同，或者樣品培養基和細胞 調節培養基可W具有不同組分。在某些實施方案中，細胞調節培養基和/或樣品培養基可 W包含檢測試劑。在某一實施方案中，所述中型流體系統或所述方法不采用樣品培養基。
[0023] 用于定量運動細胞的任何合適的方法可W應用在根據本發明的系統中，并且分析 室可W具有任何合適的適應所選擇的方法的形狀或尺寸。分析室包括進入端口和離開端 口。在本發明的上下文中，"端口"是任何合適的允許經由該端口的流體連通的開口。端口 可W是默認開放的，或者它可W是閉合的，需要經由致動器（例如閥）打開。進入端口為液 體提供入口，例如，含有運動細胞的調節培養基至分析室的入口。離開端口允許調節培養基 離開分析室，并且進一步地還可W經由分析室的離開端口將調節培養基應用到調節培養基 隔室。同樣地，分析室的端口允許流體流動穿過本中型系統。進入端口和離開端口可W具 有任何合適的提供該功能的設計，并且端口可W與流體通道流體連通。在一個具體的實施 方案中，樣品入口端口例如經由通道與用于接收樣品例如精子樣品的接收小室（receiving well)流體連通。
[0024] 因此，所述系統和方法改善了樣品中運動細胞與非運動細胞的分離，然后可W在 分析室中定量所述運動細胞。當通過細胞可透過的過濾器將樣品應用隔室與調節培養基隔 室分開時，樣品液體與調節培養基的混合被最小化。本發明人認為，雖然細胞可透過的過濾 器的應用不能完全防止例如非運動細胞從樣品應用側對流傳遞到調節培養基側，但是他們 已經在根據本發明的系統中（即當樣品應用隔室在調節培養基隔室下方時）觀察到跨越細 胞可透過的過濾器的對流的顯著減少。在本發明的上下文中，術語"對流"通常描述物質的 任何被動傳遞，例如順著液體流動攜帶液體成分的情況。本發明人認為，減少的對流W及擴 散，可W至少部分地歸因于作用在樣品上的重力。目P，在所有粒子例如樣品中的細胞上施加 向下的力，從而限制在向上方向的被動運動。沒有辦法對抗重力的非運動細胞較低程度地 通過對流和擴散作用向上轉移穿過細胞可透過的過濾器。另一方面，有辦法在樣品液體中 W任何給定的方向主動自我轉移的運動細胞可W容易地克服其上施加的重力，并且通過其 自身游動轉移穿過細胞可透過的過濾器。具體地，一旦運動細胞遇到細胞可透過的過濾器， 它們傾向于沿著所遇到的表面游動，從而游動穿過細胞可透過的過濾器。因此，樣品在細胞 可透過的過濾器下方的位置在更大程度上確保細胞不會經由對流從樣品應用側被動轉移 到調節培養基側。因此，在根據本發明的系統中分析精子樣品的過程中，存在于調節培養基 側的細胞會是已經通過游動穿過細胞可透過的過濾器而橫穿其的運動細胞。本系統的一個 另外的優勢是與其中通過細胞在通道中的行進距離來測量運動性的系統相比，運動細胞將 必須行進的距離是短的。因此，較短的距離導致較短的實施分析所需的時間。
[00巧]本發明人進一步觀察到，本發明的中型流體系統和方法還降低了調節培養基隔室 中調節培養基的污染。樣品例如精子樣品通常包括也可W穿過細胞可透過的過濾器并進入 調節培養基的另外的粒子、細胞和分子。但是，在細胞可透過的過濾器下方應用樣品還減少 了樣品的此類另外的成分的對流和擴散，所述對流和擴散另外可能降低后期調節培養基內 含物的分析的質量。特別地，精子樣品例如樣品液體可能包含能對分析具有不利作用的酶， 因此從包含所述酶的樣品液體中分離運動細胞是特別有利的。
[00%] 因此，本發明人已經發現，例如通過提供具有在細胞可透過的過濾器下方的樣品 應用隔室和在細胞可透過的過濾器上方的調節培養基隔室的設備，將具有運動細胞的樣品 應用在細胞可透過的過濾器下方，使得由非運動細胞W及樣品另外的污染性成分引起的調 節培養基的污染降低。應確保只有運動細胞會進入分析室，運由此防止存在于樣品中的非 運動細胞、碎片和其它成分W假陽性和/或假陰性貢獻的形式對測試結果具有不利影響。
[0027] 在本發明的一個實施方案中，調節培養基隔室還包括可W與外界環境流體連通的 培養基入口端口。培養基入口端口可W促進液體的進入，所述液體例如含有分析細胞所必 需的成分的樣品調節培養基，并且此外，因為培養基入口端口可W與外界環境流體連通，因 此它可W提供壓力釋放功能。培養基入口端口從而確保當經由分析室的離開端口施加負相 對壓力時或者當經由培養基入口端口施加正相對壓力時，樣品應用隔室中的樣品不會主動 地轉移穿過細胞可透過的過濾器并進入調節培養基隔室和/或分析室中，運是因為細胞可 透過的過濾器處的壓降比培養基入口端口處的壓降顯著更大。當經由分析室的進入端口或 經由培養基入口端口向調節培養基隔室裝載液體時或從調節培養基隔室