用于純化抗體的方法

用于純化抗體的方法
【專利說明】用于純化抗體的方法 發明領域
[0001] 本發明設及使用固定化至固體支持物的超抗原(諸如蛋白A、蛋白G或蛋白L)的蛋 白純化領域。具體地，本發明設及洗涂緩沖液組分和在洗涂步驟中使用所述洗涂緩沖液除 去宿主細胞污染物從而使期望的蛋白產物的損失最小化的方法。 陽00引發明背景 在過去的十年中，蛋白A親和層析作為從哺乳動物細胞培養進料流捕獲單克隆抗體(mAb)的主要候選方法已經變得充分建立。由于蛋白A配體和抗體的Fc-區域之間的特異 性結合，該高特異性的親和步驟能夠在單個步驟中除去98%的雜質。在蛋白A層析的通常 操作條件下，將經澄清的細胞培養進料流應用于柱，直到實現抗體的某個加樣質量。然后通 常將柱用高離子強度緩沖液洗涂W除去通過非特異性相互作用與樹脂結合的宿主細胞污 染物。然后通常將抗體通過抑轉換從柱洗脫，并收集用于進一步處理。因此，該工作的主 要目的是研究與鹽組合的去污劑用于破壞離子和疏水相互作用并增強宿主細胞污染物的 除去由此減小下游單元操作的純化負擔的用途。
[0003] 對于大規模純化，將許多努力放置在優化洗涂和洗脫緩沖液的組分W使產物收率 最大化。但是，在同時純化許多不同蛋白產物的生產情形中，為每種單獨蛋白產物開發單獨 的洗涂緩沖液需要大量時間和資源來篩選多種緩沖液組分W確定對于每種特別的蛋白產 物而言適當的洗涂緩沖液。可W與不同類型的蛋白一起有效地使用的"一般"中間洗涂緩沖 液將是有用的和合乎需要的。本發明提供了使用運樣的洗涂緩沖液組分的蛋白純化方法。
[0004] 發明概述 在一個方面，本發明設及通過超抗原層析從含有至少一種污染物的溶液純化蛋白的方 法，所述蛋白包含抗體、抗體片段或免疫球蛋白單個可變結構域（immunoglobulin single vari油le domain),所述方法包括：a)將所述蛋白吸附至固定化在固體支持物上的超抗原； b)通過使含有吸附蛋白的固定化超抗原接觸包含脂族簇酸鹽的第一種洗涂緩沖液，除去至 少一種污染物；和C)從固定化在固體支持物上的超抗原洗脫所述蛋白。
[0005] 在一個方面，本發明設及一種通過蛋白A層析從污染的蛋白溶液純化蛋白的方 法，所述方法包括： (a)用蛋白A平衡緩沖液平衡固定化在固相上的蛋白A ; (b)將來自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白A ; (C)通過用第一種蛋白A洗涂緩沖液洗涂所述固相，除去至少一種污染物，所述第一種 蛋白A洗涂緩沖液包含約50 ml至約55 ml tris堿、約45 ml至約50 ml乙酸、至少一種 脂族簇酸鹽，具有約抑7. 5,其中所述脂族簇酸鹽選自約100 ml辛酸鋼、約20 ml癸酸鋼和 約20 ml十二酸鋼訊 (d)用蛋白A洗脫緩沖液從所述固相回收蛋白。在本發明的一個方面，在沒有加入化C1的情況下制備所有緩沖液。
[0006] 在一個實施方案中，所述蛋白A洗涂緩沖液進一步包含約1 ml至約500 ml醋酸 鋼。在一個實施方案中，所述蛋白A洗涂緩沖液包含約300 ml醋酸鋼。
[0007] 在一個方面，本發明設及通過蛋白L層析從污染的蛋白溶液純化蛋白的方法，所 述方法包括： (a)用蛋白L平衡緩沖液平衡固定化在固相上的蛋白L; 化）將來自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白L; (C)通過用第一種蛋白L洗涂緩沖液洗涂所述固相，除去至少一種污染物，所述第一種 蛋白L洗涂緩沖液包含約50ml至約55mltris堿、約45ml至約50ml乙酸、至少一種 脂族簇酸鹽，具有約抑7. 5,其中所述脂族簇酸鹽選自約100ml辛酸鋼、約20ml癸酸鋼和 約20ml十二酸鋼訊 (d)用蛋白L洗脫緩沖液從所述固相回收蛋白。在本發明的一個方面，在沒有加入化C1 的情況下制備所有緩沖液。
[0008] 在一個實施方案中，所述蛋白L洗涂緩沖液進一步包含約1ml至約500ml醋酸 鋼。在一個實施方案中，所述蛋白L洗涂緩沖液包含約300ml醋酸鋼。
[0009] 附圖簡述 圖1.辛酸鹽濃度研究結果-抗-0SM。
[0010] 圖2.辛酸鹽濃度研究結果-抗-IL13。
[0011] 圖3.簇酸對比研究結果。 陽〇1引發明詳述 應該理解，本發明不限于特別的方法、試劑、化合物、組合物或生物系統，其當然可W變 化。還應該理解，本文中使用的術語僅用于描述特別的實施方案的目的，且無意進行限制。 在本說明書和所附權利要求中使用的單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括復數指示物， 除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，對"多膚"的提及包括兩種或更多種多膚的組合 等。
[0013] 當提及可測量的值諸如量、時間持續等時，本文中使用的"約"意在包括從指定的 值變化±20%或± 10%(包括±5%、± 1%和±0. 1%)，因為運樣的變化適于執行所公開的方 法。
[0014] 除非另外定義，否則在本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域 的普通技術人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文描述的那些相似或相當的任何方法 和材料可W用于實踐本發明的測試，但是本文描述了優選的材料和方法。在描述和要求保 護本發明時，將使用W下術語。
[0015] "多膚"、"膚"和"蛋白"在本文中互換地用于表示氨基酸殘基的聚合物。多膚可 W具有天然的（組織來源的）起源，從原核或真核細胞制備物重組或天然表達，或經由合 成方法化學產生。該術語適用于運樣的氨基酸聚合物：其中一個或多個氨基酸殘基是對應 的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，W及適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存 在的氨基酸聚合物。氨基酸模擬物表示運樣的化學化合物：其結構不同于氨基酸的一般化 學結構，但是其作用方式類似于天然存在的氨基酸。在科學和專利文獻中充分描述了非天 然殘基；在下面描述了可用作天然氨基酸殘基的模擬物的幾種示例性非天然組合物和指 南。芳族氨基酸的模擬物可W通過用例如W下氨基酸替換而產生：0-或心糞基（naphyl) 丙氨酸；D-或k苯基甘氨酸；D-或嚷吩基丙氨酸；D-或kl、-2、3-或4-巧基丙氨 酸；D-或心3嚷吩基丙氨酸；D-或k(2-化晚基）-丙氨酸；D-或k(3-化晚基）-丙氨酸； 0-或心(2-化嗦基）-丙氨酸；0-或心(4-異丙基）-苯基甘氨酸：D-(S氣甲基）-苯基甘 氨酸；D- (S氣甲基）-苯丙氨酸：D-對氣-苯丙氨酸；D-或k對聯苯基苯丙氨酸；K-或 k對甲氧基-聯苯基苯丙氨酸：D-或嗎I噪（烷基）丙氨酸；和D-或k烷基丙氨酸 (ainine)，其中烷基可W是被取代的或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、下基、戊基、異丙 基、異下基、sec-isotyl、異戊基或非酸性的氨基酸。非天然氨基酸的芳族環包括，例如，嚷 挫基、苯硫基、化挫基、苯并咪挫基、糞基、巧喃基、化咯基和化晚基芳族環。
[0016] 本文中使用的"膚"包括為本文具體舉例說明的那些膚的保守變異的膚。本文中使 用的"保守變異"表示使用另一種生物學上相似的殘基替代氨基酸殘基。保守變異的例子包 括、但不限于，一個疏水殘基諸如異亮氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半脫氨酸、甘氨酸、苯 丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個疏水殘基，或一個極性殘 基置換另一個極性殘基，諸如精氨酸置換賴氨酸、谷氨酸置換天冬氨酸、或谷氨酷胺置換天 冬酷胺等。可互相置換的中性親水氨基酸包括天冬酷胺、谷氨酷胺、絲氨酸和蘇氨酸。"保 守變異"還包括使用取代的氨基酸替代未取代的母體氨基酸，前提條件是，針對取代的多膚 的抗體也與未取代的多膚發生免疫反應。運樣的保守置換是在本發明的膚的種類的定義之 內。本文中使用的"陽離子的"表示在pH7.4具有凈正電荷的任何膚。通過本領域技術人 員已知的和本文描述的標準方法，可W確定膚的生物活性。
[0017] 當關于蛋白使用"重組"時，表示該蛋白已經通過引入異源核酸或蛋白或者改變天 然核酸或蛋白進行了修飾。
[0018] 本文中使用的"治療性蛋白"表示運樣的任何蛋白和/或多膚：其可W施用給哺乳 動物W引起組織、系統、動物或人的生物學或醫學應答，所述應答是例如研究人員或臨床醫 師所尋求的。治療性蛋白可W引起超過一種生物學或醫學應答。此外，術語"治療有效量" 是指運樣的任何量：與未接受該量的相應受試者相比，該量導致、但不限于疾病、病癥或副 作用的痊愈、預防或改善，或者疾病或障礙的進展速率的下降。該術語在其范圍內還包括有 效地增強正常生理功能的量、W及在患者中有效地造成增強或有助于第二種藥學試劑的治 療效果的生理功能的量。
[0019] 本文中鑒定的所有"氨基酸"殘基呈天然的心構型。與標準多膚命名法一致，氨 基酸殘基的縮寫如在下表中所示。
[0020] 表1.氨基酸縮寫。_
陽021] 應當指出，所有的氨基酸殘基序列在本文用式表示，所述式從左至右的方向為從 氨基端至簇基端的常規方向。
[0022] 在另一個實施方案中，所述多膚是抗原結合多膚。在一個實施方案中，所述抗原結 合多膚選自可溶性的受體、抗體、抗體片段、免疫球蛋白單個可變結構域、Fab、F(ab'）2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv或雙抗體。
[0023] 本文中使用的術語"抗原結合多膚"表示能夠結合抗原的抗體、抗體片段和其它蛋 白構建體。
[0024] 術語Fv、Fc、Fd、F油或F(油)2使用它們的標準含義（參見，例如，Harlow等人， AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory, (1988))。
[00巧]"嵌合抗體"表示一類經工程改造的抗體，其含有來源于供體抗體的天然存在的可 變區（輕鏈和重鏈）W及來源于受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
[00%]"人源化抗體"表示一類經工程改造的抗體，其具有來源于非人供體免疫球蛋白的 它的CDR，該分子的剩余的免疫球蛋白衍生的部分來源于一種（或多種）人免