一種液相色譜固定相及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種液相色譜固定相及其制備方法，具體地說是一種配基為聚乙二醇 基鍵合相為功能基團的尺寸排阻色譜固定相。 技術背景
[0002] 蛋白質等生物大分子類藥物逐漸成為醫藥領域關注的熱點，這是因為在醫學生理 病理過程研究、疾病標志物發現、藥物靶點研究以及生物藥物研發等方面都涉及到諸如蛋 白質等生物大分子的參與。特別是在新興的生物藥物領域，研發、生產、質檢等重要環節都 涉及到蛋白質等生物大分子的分離問題。然而蛋白質等生物大分子不同于其他小分子化 合物，本身具有較大的分子量，復雜的空間構造、特殊的帶電性質以及生理性質，這些特性 使得蛋白質這類生物大分子對于分離材料與分離技術提出了較高的要求。高效液相色譜作 為有效的分離技術，在蛋白質等生物大分子分離過程中發揮了強有力的作用并作為較為通 用的分離手段已被廣泛使用。針對蛋白質等生物大分子分離問題的高效液相色譜材料與方 法，已有很多具體的實例應用。但通過考察發現，這些方法、材料都存在一個較大的問題，這 些材料對于蛋白質樣品的吸附現象；使用某些分離材料后，回收的蛋白質總量降低，導致蛋 白質樣品的損失。降低蛋白質樣品在分離材料上的非特異性吸附是目前生物材料領域中較 為熱點的問題之一。因此，針對當前高效液相色譜分離材料在蛋白質等生物大分子分離方 面的不足，開發針對蛋白質低吸附的分離材料將具有巨大的應用需求和發展空間。
[0003] Cesar等發展了一種抗蛋白吸附材料制備方法，通過使用表面引發原子轉移自 由基聚合反應將聚乙二醇等單體鍵合到材料表面，制備出的材料經過表征具有很好的 抗蛋白 口及附倉泛力[Cesar Rodriguez-Emmenegger et al, Biomacromolecules, 2011, 12, I 058]。Huang等合成了一種經聚乙二醇修飾的納米金粒子，這種生物惰性納米金粒子對 于蛋白具有很好的抗吸附能力[Ming Zheng et al, Journal of The American Chemical Society, 2003, 125, 7791]。可以看出，經聚乙二醇聚合物修飾的材料在抗蛋白吸附能力方 面具有一定優勢，這些工作為生物材料的發展提供了很好的借鑒。
[0004] 聚乙二醇修飾材料用于高效液相色譜固定相的相關報道還是較少的，Mondello 等將聚乙二醇修飾的色譜柱與C18色譜柱聯用，成功分離酸類抗氧化劑[Blahova, E. et al, Journal of Separation Science, 2006, 29, 555] ;Barbas 等應用 Supelco Discovery HS PEG反相高效液相色譜柱成功分離感冒藥制劑中的小分子藥物[Garcia，A. et al, Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2003, 785, 237]。使用點擊化學在無金屬催化條件下在有機溶劑或有機溶劑/水 混合溶劑中制備了寡聚乙二醇鍵合硅膠固定相，并用于藥物、生物樣品和天然產物等分離 [梁鑫淼·一種寡聚乙二醇固定相的制備方法：中國，CN102101044B，2013.01.09]。以上 報道的這些色譜柱經PEG修飾后都是應用在反相液相色譜分離中且都是用于分離小分子 化合物，而應用于分離大分子蛋白等生物樣品的報道較少，尤其是尺寸排阻色譜固定相分 離材料方面，尚未出現使用此類材料的相關報道。因此，本專利將引入一種基于硅膠基質， 聚乙二醇基為鍵合相的色譜固定相的制備方法，該制備方法不需使用有機溶劑作為反應溶 劑，且制備材料表面鍵合相密度高，化學性能穩定，對蛋白、多肽等生物樣品具有很好的尺 寸排阻分離性能。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種新型抗蛋白非特異性吸附色譜固定相及其制備方法。該 固定相為聚乙二醇基鍵合硅膠固定相。該固定相的制備方法簡單，用途廣泛。
[0006] 本發明的技術方案是：聚乙二醇色譜固定相，其特征在于結構為：
[0008] 其中 Silica gel 為石圭膠，m = 2-500。
[0009] 本發明還提供了上述固定相的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0010] a.硅膠預處理：硅膠加入質量濃度為1 %~38%的鹽酸或硝酸溶液中，常壓下加 熱至回流，攪拌1~48小時，過濾，水洗至中性，于100~150°C下干燥至恒重；
[0011] b.硅膠表面鍵合：將步驟a所得干燥硅膠置于玻璃或者聚四氟乙烯反應容器中， 在惰性氣體氛圍下加入反應溶劑攪拌，滴加聚乙二醇基硅烷，保持溫度為20~KKTC條件 下攪拌2~48小時。反應體系冷卻至室溫，減壓過濾并用甲醇、水、甲醇洗滌，固體產品在 60~80°C條件下干燥6-24小時即得硅烷化硅膠；
[0012] 所述制備方法步驟b中反應溶劑為酸性水溶液，包括稀硫酸、稀硝酸、稀鹽酸等溶 液；所述制備方法步驟b中反應溶劑為pH為2-4 ;
[0013] 或所述制備方法步驟b中反應溶劑為堿性水溶液，包括氫氧化鉀、氫氧化鈉、氨 水、碳酸氫銨、碳酸鈉、碳酸氫鉀或碳酸氫鈉等溶液；所述制備方法步驟b中反應溶劑為 pH7-9 ；
[0014] 所述制備方法步驟b中所使用的硅烷為2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基 硅烷或2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三乙氧基硅烷，其中聚氧乙烯的聚合度為2-500。
[0015] 本發明具有如下優點：
[0016] 1.結構新穎。本發明首次提出以2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷表 面聚合鍵合相為抗蛋白吸附色譜固定相。該固定相結構中含有聚乙二醇基，呈現電中性，對 于蛋白等生物大分子具有很好的抗吸附能力，十分適合作為抗蛋白吸附色譜固定相。
[0017] 2.材料表面密度與厚度可調控。本發明提供的硅膠表面聚乙二醇基聚合鍵合相可 以通過調整硅烷試劑的比例實現表面密度的調控；同時通過改變鍵合相長度即聚乙二醇的 聚合度，可實現材料表面厚度的改變，進而實現材料制備的優化與調控。
[0018] 3.本發明提供的抗蛋白吸附色譜固定相是一種普適型的色譜固定相，對絕大部分 生物大分子都具有很好的分離選擇性，可廣泛用于各類生物樣品的分離。
[0019] 4.制備過程簡單可靠，有利于實現產業化。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例12的色譜圖；
[0021] 圖2為實施例13的色譜圖；
[0022] 圖3為實施例14的色譜圖；
[0023] 圖4為實施例15的色譜圖；
[0024] 圖5為實施例16的色譜圖；
[0025] 圖6為實施例17的色譜圖；
[0026] 圖7為實施例18的色譜圖；
[0027] 圖8為實施例19的色譜圖；
[0028] 圖9為實施例20的色譜圖；
[0029] 圖10為實施例21的色譜圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實例，對本發明做進一步說明。實施例僅限于說明本發明，而非對本發明 的限定。
[0031] 實施例1
[0032] 稱取IOg球形硅膠（粒徑為3 μ m，孔徑為IOnm,比表面積400m2/g)，置于250mL 玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5%的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，過 濾，水洗至中性，150°C干燥24小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干 燥的氮氣的條件下，向硅膠中加入70mL，pH為8. 8的氫氧化鉀溶液，攪拌均勻，然后滴加 10mL2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷（聚合度為10~15)，KKTC回流攪拌反 應4小時。反應體系過濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌，產物在70°C條件下干燥12小時即得 色譜固定相1。
[0033] 實施例2
[0034] 稱取20g球形硅膠（粒徑為5 μ m，孔徑為IOOnm,比表面積30m2/g)，置于250mL 玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為10%的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，過 濾，水洗至中性，KKTC干燥24小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干 燥的氮氣的條件下，向硅膠中加入70mL，pH為8. 5的氫氧化鉀溶液，攪拌均勻，然后滴加 30mL2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷（聚合度為9~12)，95°C回流攪拌反應 18小時。反應體系過濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌，產物在70°C條件下干燥12小時即得色 譜固定相2。
[0035] 實施例3
[0036] 稱取5g球形硅膠（粒徑為5 μ m，孔徑為IOnm,比表面積305m2/g)，置于250mL玻 璃燒瓶中，加入IOOmL體積濃度為15%的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，過濾，水 洗至中性，KKTC干燥12小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮 氣的條件下，向硅膠中加入70mL，pH為2. 8的稀硫酸溶液，攪拌均勻，然后滴加5mL2-[甲氧 基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷（聚合度為2~8)，90°C回流攪拌反應12小時。反應 體系過濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌，產物在60°C條件下干燥12小時即得色譜固定相3。
[0037] 實施例4
[0038] 稱取IOg球形硅膠（粒徑為5 μ m，孔徑為30nm,比表面積280m2/g)，置于250mL玻 璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為10%的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，過濾，水 洗至中性，150°C干燥24小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮 氣的條件下，向硅膠中加入70mL，pH為2的稀硫酸溶液，攪拌均勻，然后滴加10mL2-[甲氧 基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷（聚合度為90~100)，70°C回流攪拌反應24小時。 反應體系過濾，依次用甲苯、甲醇、水、甲醇洗滌，產物在80°C條件下干燥12小時即得色譜 固定相4。
[0039] 實施例5
[0040] 稱取5g球形硅膠（粒徑為5 μ m，孔徑為20nm,比表面積160m2/g)，置于250mL玻 璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為10%的鹽酸溶液，加熱回流10小時，冷卻至室溫，過濾，水 洗至中性，120°C干燥24小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮 氣的條件下，向硅膠中加入60mL，pH為8的氨水溶液，攪拌均勻，然后滴加10mL2-[甲氧基 (聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷（聚合度為50~60)，90°C回流攪拌反應24小時。反應 體系過濾，依次用甲苯、甲醇、水、甲醇洗滌，產物在70°C條件下干燥12小時即得色譜固定 相5。
[0041] 實施例6
[0042] 稱取IOg球形硅膠（粒徑為10 μ m，孔徑為IOnm,比表面積350m2/g)，置于250mL 玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為10%的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，過 濾，水洗至中性，150°C干燥24小時。將干燥后的硅膠置于150mL三口玻璃瓶中，在通入干 燥的氮氣的條件下，向硅膠中加入70mL，pH為8的碳酸氫銨水溶液，攪拌均勻，然后滴加 10mL2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷