一種基于單鏈dna核酸適配體修飾有機/無機雜化石英毛細管整體柱的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于化學分析測試儀器領域，涉及到基于核酸適配體修飾的有機/無機雜化毛細管整體柱，及一種新型管內固相微萃取整體柱制備方法，該整體柱適用于復雜食品和生物樣品中痕量、超痕量赭曲霉毒素等組分的快速、高效、高選擇性分離富集。
【背景技術】
[0002]由于待測組分受其共存組分的干擾或者由于測定方法本身靈敏度的限制以及對待測組分狀態的要求，絕大多數化學檢測和分析方法要求事先對試樣進行有效的、合理的處理，即在進行分析測定前應對試樣進行物理或者化學的處理，將待測組分從樣品中提取出來，排除其它組分對待測組分的干擾。簡單、快速、高效、綠色、高選擇性、自動化的樣品前處理技術是分析復雜樣品如血漿、尿液、醫藥、環境樣品和食品中痕量或超痕量待測組分的重要步驟。傳統樣品前處理技術包括液-液萃取、沉淀分離、離子交換萃取、柱色譜等，相對于儀器分析技術的發展，樣品前處理技術的進展較為緩慢，普遍存在耗時、低效、有機溶劑用量大、操作較繁瑣、選擇性差等問題，導致樣品前處理成為整個分析過程中最費時費力的環節，同時在樣品分析過程中至少導致了三分之一的誤差產生。
[0003]固相微萃取(Solid-phasemicroextract1n, SPME)技術由 Belardi 與 Pawliszyn在1989年提出，由于集采樣、萃取、濃縮及進樣于一體，具有耗時少、操作簡單、效率高、無溶劑或少溶劑、易與色譜儀器聯用等優點，提高了分析速度及靈敏度，已在環境、生物、工業、食品、臨床醫學等領域的各個方面得到廣泛的應用。然而，傳統的固相微萃取頭存在易折斷、萃取量不足等缺點，不利于與高效液相色譜的在線聯用。管內固相微萃取(In-tubeSolid-phase microextract1n, In-tube SPME)能較好地克服以上問題，易與其它儀器實現在線聯用。為此，國內外眾多研究小組開發了各種形式的管內固相微萃取，主要有以下三種形式:開管柱、顆粒/纖維填充柱、整體柱。近年來，具有選擇性高、穩定性好、制備簡單等整體柱成為管內固相微萃取的研究熱點。毛細管整體柱克服了開管柱存在的不足，同時也避免了顆粒填充柱操作繁瑣的特點，具有制備簡單、滲透性好、傳質效率高等特點。整體柱材料中，分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer, MIP)由于其類似于“鑰匙-鎖”相互作用的識別原理，成為選擇性整體柱材料研究的主要研究對象。但由于分子印跡技術自身的特點，尚存在合成時材料消耗大、極性溶劑干擾、剛性識別“空穴”易被破壞或變形等不足，以及MIP合成過程中不可避免地產生非特異性結合位點，導致其選擇性與抗體-抗原、酶-底物等專一特異性生物識別體系相比存在較大差距，上述問題限制了其在生物樣品分析中的應用前景。因此，對于復雜生物樣品中痕量、超痕量組分分析而言，尋找水溶液樣品適用性好、選擇性更強的管內固相微萃取材料是解決問題的關鍵，而生物識別體系無疑是較好的選擇。
[0004]核酸適配體是經體外篩選技術-指數富集的配基系統進化技術(Systematicevolut1n of ligands by exponential enrichment, SELEX)從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異結合目標配體的單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA)，具有高度專一性，一般是由幾十個核苷酸組成，目前已發展成為一種廣受關注的新型識別分子。核酸適配體作為一種人工合成的核酸，具有穩定的二級結構和高特異性、高親和力、便于化學修飾與功能化的特點。基于核酸適配體的各種結構特點，無機離子、有機分子、生物大分子蛋白質、酶等乃至細胞、微生物均可能存在與其對應的高特異性適配體，適配體一靶目標復合物的解離常數通常在μπιο?到nmol范圍內，有的甚至達到pmol。目前適配體的應用主要包括在化學研究檢測系統中作為分子識別元件，在生物樣品分離富集過程中作為能夠與靶目標發生特異性結合的配基以及在醫學上用于臨床診斷和治療。例如，Chris Le等將適配體固定在毛細管色譜整體柱中，用于蛋白質混合物中細胞色素C的分離與檢測。Jiang等成功利用SELEX技術篩選獲得葡萄球菌腸毒素B (SEB)高親和力的ssDNA適配體，并發現SEB與葡萄球菌A蛋白和牛血清清蛋白無非特異性的結合，為其診斷與治療奠定了基礎。2008年，Shamah等研究了復合靶(即靶分子的混合物)SELEX技術篩選。Jenison等從RNA庫中分離得到茶堿適配體，與茶堿的親和力比咖啡因高10000倍以上。
[0005]近年來，國內外研究者已將焦點移至核酸適配體在分析化學領域的應用。適配體易修飾的特性能使其作為配基可固定在各種材料表面，如硅膠、金屬、磁性微球、量子點等，應用于各類分離技術，包括液相色譜、親和色譜、毛細管電泳、毛細管電色譜、生物傳感器及原子力顯微鏡等。例如，Oznur等通過固載后的核酸適配體6H7和6H5實現了 His — tagged蛋白質的分離純化；Wu等通過將氨基修飾的核酸適配體化學鍵合到羧基化的磁性微球上，用于分離、富集小麥中生物毒素；zhao等將凝血酶適配體修飾在聚合物整體柱上，對人體血液及尿液中實現了凝血酶的分離、檢測。
【發明內容】
[0006]本發明針對前文所述的SPME易折斷、萃取量不足、選擇性不高及生物樣品兼容性較差等問題，將核酸適配體親合力高、特異性強、生物樣品相容性好等特性與In-tube SPME技術效率高、易與儀器聯用、操作簡單等優點結合在一起，制備有機/無機雜化毛細管整體柱，通過鏈霉親和素與生物素之間高親和力將核酸適配體固定毛細管整體柱內，研制一種基于核酸適配體修飾有機/無機雜化石英毛細管整體柱新型管內SPME萃取柱，用于復雜生物樣品及食品中痕量、超痕量的赭曲霉素、黃曲霉素等物質的高選擇性分離與富集。
[0007]本發明通過以下技術方案實現:一種基于單鏈DNA核酸適配體修飾有機/無機雜化石英毛細管整體柱的制備方法，按以下步驟依次進行:
[0008](I)采用食人魚堿溶液，循環流動方式，對空心石英毛細管內表面進行活化處理；該食人魚堿溶液的配制為30% H202-70% H2SO4(1:4, v: v)，取足量的食人魚堿溶液，循環流經石英毛細管，置于60°C反應3h，用無水乙醇和水沖洗；
[0009](2)稱CTAB于離心管中，分別加入TE0S、APTES、無水乙醇及水，于旋渦混合器上高速渦旋，得CTAB的混勻液，采用注射栗將所述混勻液注入所述步驟(I)處理后的空心石英毛細管中，硅膠片封端，水浴鍋恒溫反應，取出所述空心石英毛細管，置于烘箱中干燥老化，制備得到有機/無機雜化整體柱；
[0010](3)采用高壓液相栗，先后用甲醇和純凈水沖洗所述步驟(2)所得的有機/無機雜化整體柱，分別沖洗一定時間，除去剩余的CTAB ；[0011 ] ⑷Na2CO3緩沖液(pH = 9.0)配制lmg/L SA溶液為，取SA溶液于試劑瓶中，加入EDC與NHS的混合液及PBS緩沖液，混勻后靜置活化，注射栗注入步驟(3)處理后的整體柱，室溫反應一段時間，采用PBS緩沖液反復沖洗；
[0012](5)采用Tris-HCl緩沖液配制赭曲霉素A適配體溶液，將所述赭曲霉素A適配體溶液通過注射栗注入所述步驟(4)處理后的有機/無機雜化整體柱，室溫下循環反應，用Tris-HCl緩沖液反復沖洗，除去剩余的赭曲霉素A適配體溶液，將被所述Tris-HCl緩沖液沖洗后的有機/無機雜化整體柱于低溫保存，既得。
[0013]具體來說，有機/無機雜化整體柱制備的優選方案如下，所述步驟(2)和步驟(3)具體地為，在室溫下將適量CTAB于離心管中，分別加入TEOS、APTES、無水乙醇及水渦旋混勻，注入步驟(I)處理后的石英毛細管內，40°C水浴反應24h，分別用甲醇和水經高壓栗沖洗；
[0014]進一步來說，針對內徑為0.53_、長度為15cm的空心熔融石英毛細管，其反應試劑具體用量為 112 μ L TE0S, 118 μ L APTES，8mg CTAB，215 μ L 的無水乙醇和 25 μ L/K。
[0015]具體來說，生物素標記的赭曲霉素A核酸適配體固載到有機/無機雜化整體柱內，首先將適量SA在弱酸性條件下通過氨基和羧基發生的酰胺反應偶聯在整體柱內，然后應用生物素與鏈霉親和素之間的高親和力作用系統，在適配體緩沖液Tris-HCl中，將赭曲霉素A適配體修飾在有機/無機雜化整體柱內。
[0016]進一步來說，所采用的SA偶聯條件:200 μ L鏈霉親和素溶液，pH為6.5的1mmol/L PBS 緩沖液(0.lmol/L NaCl、10mmol/L Na2HP04/NaH2P04、5mmol/L MgCl2)及 EDC/NHS 比例為1:4的混合液；適配體固載條件:1400 μ L赭曲霉素A適配體溶液，50mmol/L Tris-HCl緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2、5mmol/L KCU pH = 7.4)，適配體固載時間為24h，核酸適配體鍵合緩沖液為50mmol/L Tris緩沖液，核酸適配體溶液濃度為 0.205 μ mol/Lo
[0017]需要說明一下的是，文中所述CTAB為十六烷基三甲基溴化銨的簡稱；所述TEOS為正硅酸乙酯的簡稱；所述APTES為3-氨丙基三乙氧基硅烷的簡稱；所述SA溶液為鏈霉親和素溶液的簡稱；所述EDC為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的簡稱；所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺的簡稱；所述PBS緩沖液為磷酸緩沖液的簡稱，所述赭曲霉素A適配體溶液為Tris-HCl緩沖液配制的赭曲霉素A核酸適配體溶液。