一種可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種金屬螯合磁珠，具體的說是一種可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法。
【背景技術】
[0002]在溶液中，金屬離子往往和蛋白質、核酸、糖等生物大分子結合在一起，影響我們對這些生物大分子的結構和功能的分析。現有獲得脫金屬方法是通過加入高濃度的低分子量螯合劑，如Η)ΤΑ和EGTA等，或者通過金屬螯合瓊脂糖凝膠。前者在移除螯合劑金屬復合物的同時緩沖液中的金屬離子會重新與大分子結合，影響脫金屬效果。目前廣泛使用瓊脂糖凝膠來對生物大分子進行脫金屬處理。瓊脂糖的粒度均勻，表面有密度適宜的可反應的活性基團，便于連接金屬螯合基團。中國專利申請“四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法”(申請號CN200910196910.0)和“一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及其應用”(申請號CN201110329239.X)公開的方法，采用結合了乙二胺二乙酸(EDDA)或乙二胺二琥珀酸(EDDS)的瓊脂糖凝膠進行金屬離子的螯合，由于EDDA提供4個金屬配位體，EDDS提供6個金屬配位體，制得的瓊脂糖凝膠的金屬螯合能力要比亞氨基二乙酸(IDA，金屬配位數為3)的強。但是瓊脂糖凝膠在較低壓力下結構就會產生壓縮破壞，為提高其機械強度，常采用增加交聯度的辦法，但交聯后的瓊脂糖凝膠吸附性大大下降；另一方面，瓊脂糖凝膠的熱穩定性也較差，50°C以上就開始水解，這些缺點使其不能完全滿足目前的研究需要。
[0003]磁珠是近年來發展起來并已廣泛應用于醫學生物學領域的一種多功能試劑，它由磁性內核和核外包裹的高分子外殼兩部分組成，利用磁核對外磁場的響應，可以將磁珠從周圍介質中迅速分離出來。中國專利申請“一種金屬螯合納米磁珠，其制備方法及其應用”(申請號CN200610002030.1)公開了一種連接IDA的納米磁珠，該磁珠與金屬離子螯合后，金屬離子(如六配位金屬N1、Cu、Co和Ca等)上還剩余三個空軌道可以與具有金屬結合位點的蛋白質結合，因此以IDA為螯合基制成納米磁珠吸附蛋白質能力較強，能較好地用于溶液中金屬結合蛋白的分離和鑒定，但并不能從大分子中有效地移除金屬離子。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法，該方法可制備出金屬結合能力強，結合容量大的金屬螯合磁珠，用于移除溶液及生物大分子中的金屬離子。
[0005]—種可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法，包括以下步驟: 步驟一、羥基磁珠的活化:在羥基磁珠中加入堿液進行活化，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I，備用；所述堿液的加入量為可使混合物I的PH值達到12-14 ;
步驟二、環氧化:按照混合物1、二甲亞砜、環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液的體積比為1:2:1: 4的比例，在上述步驟一所得混合物I中加入二甲亞砜、環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液，混合后在60°C的溫度下，緩慢攪拌12-14小時，使活化后羥基磁珠連接上環氧基，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到環氧活化磁珠，備用；
步驟三、在每1mg上述步驟二所得環氧活化磁珠中加入4ml濃度為l~5mol/L的碳酸鈉(Na2CO3)溶液、0.1~1 g的乙二胺二琥珀酸三鈉(EDDS-Na3)和1~5 mg的硼氫化鈉(NaBH4),混合后在40-60°C的溫度下，緩慢攪拌10~15小時，除去溶液，將所得磁珠洗至中性后吸干，即制備出可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠，將其保存于質量濃度為30%乙醇水溶液中，置于4°C下保存，備用。
[0006]步驟一中所述羥基磁珠的優選為，表面功能基團為硅羥基的硅羥基磁珠，粒徑為400-600nm，在堿液中的濃度為10mg/ml ;所述堿液優選為氫氧化鈉溶液或氨水的濃度優選為為 5-10 mol/L ；
步驟二中所述氫氧化鈉溶液和環氧氯丙烷優選為在12-14小時內分5次緩慢加入處于攪拌狀態的含有活化后羥基磁珠的混合物中；所述氫氧化鈉溶液的濃度為I mol/L。
[0007]步驟二和步驟三中洗至中性的方法優選為，先采用蒸餾水洗，再用稀醋酸洗，最后用蒸餾水洗至中性。
[0008]有益效果是:
1、本發明可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法，以羥基磁珠為基質，經環氧活化后，與EDDS-Na3偶聯，制得連接有EDDS的金屬螯合磁珠。該方法制備工藝簡單，易于放大，使用方便，將該磁珠加入溶液后可快速移除溶液及生物大分子中的重金屬離子，方便對生物大分子的結構和功能進行分析。
[0009]2、本發明的所制備的金屬螯合磁珠連接的EDDS可以提供四個羧基和二個氮原子形成六配位體，可以與過渡金屬穩定螯合，為N1、Cu、Co和Zn等配位層上的所有空軌道提供孤對電子，形成的配合物更穩定。能移除蛋白質溶液中95%以上的Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+等金屬離子，尤其適合復合重金屬污染環境下生長的植物蛋白質中重金屬離子的移除。
【具體實施方式】
[0010]—種可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠制備方法，包括以下步驟: 步驟一、羥基磁珠的活化:在羥基磁珠中加入堿液進行活化，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I，備用；所述堿液的加入量為可使混合物I的PH值達到12-14 ;
步驟二、環氧化:按照混合物1、二甲亞砜、環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液的體積比為1:2:1: 4的比例，在上述步驟一所得混合物I中加入二甲亞砜、環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液，混合后在60°C的溫度下，緩慢攪拌12-14小時，使活化后羥基磁珠連接上環氧基，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到環氧活化磁珠，備用；
步驟三、在每1mg上述步驟二所得環氧活化磁珠中加入4ml濃度為l~5mol/L的碳酸鈉(Na2CO3)溶液、0.1~1 g的乙二胺二琥珀酸三鈉(EDDS-Na3)和1~5 mg的硼氫化鈉(NaBH4),混合后在40-60°C的溫度下，緩慢攪拌10~15小時，除去溶液，將所得磁珠洗至中性后吸干，即制備出可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠，將其保存于質量濃度為30%乙醇水溶液中，置于4°C下保存，備用。
[0011]步驟一中所述羥基磁珠為單分散粒徑納米微球，優選為，表面功能基團為硅羥基的娃輕基磁珠，粒徑為400-600nm，在堿液中的濃度為10mg/ml ;所述堿液優選為氫氧化鈉溶液或氨水的濃度優選為為5-10 mol/L ；
步驟二中所述氫氧化鈉溶液和環氧氯丙烷優選為在12-14小時內分5次緩慢加入處于攪拌狀態的含有活化后羥基磁珠的混合物中；所述氫氧化鈉溶液的濃度為I mol/L。
[0012]步驟二和步驟三中洗至中性的方法優選為，先采用蒸餾水洗，再用稀醋酸洗，最后用蒸餾水洗至中性。
[0013]以下實施例用于說明本發明的技術方案，并不對本發明的保護范圍有任何形式的限定；實施例中所述羥基磁珠購買于洛陽惠爾納米科技有限公司。
[0014]實施例1
在Iml 10mg/ml羥基磁珠中加入6 mol/L氫氧化鈉溶液充分活化后，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I ;6 mol/L氫氧化鈉溶液加入量為可使混合物I的pH值達到12 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亞砜、I ml環氧氯丙烷和4ml I mol/L氫氧化鈉溶液(I ml環氧氯丙烷和4ml氫氧化鈉在緩慢攪拌下，14小時內分5次加入，每次間隔2.8小時)，于60°C下緩慢攪拌過夜后過夜，除去溶液，所得磁珠先水洗、在稀醋酸洗、最后水洗，得到的環氧活化磁珠。然后在環氧活化磁珠中加入4ml濃度為lmol/L碳酸鈉溶液、0.1g的EDDS-Na3和Img NaBH4,在50°C下緩慢攪拌14小時，除去溶液，得到連接EDDS的羥基磁珠，將其先用水洗，再用稀醋酸洗，最后水洗至中性，即得到可從大分子中移除金屬離子的金屬螯合磁珠，將其保存于4°C下30%的乙醇溶液中。該實施例制得的金屬螯合磁珠在0.5mol/L硫酸銅溶液中每毫克能吸收0.012mmol Cu2+0
[0015]實施例2
在Iml 10mg/ml羥基磁珠中加入5 mol/L氫氧化鈉溶液充分活化后，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I ;5mol/L氫氧化鈉溶液加入量為可使混合物I的pH值達到14 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亞砜、I ml環氧